一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于食品安全免疫检测【技术领域】，具体公开了一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述半抗原的分子结构如（Ⅰ）所示：；其中，n=0～6。由上述半抗原与载体蛋白结合获得人工抗原，由上述人工抗原免疫动物获得的抗体能直接识别组胺，对其他结构类似物均不存在明显的交叉反应；基于此抗体建立的组胺免疫分析方法，较之前报道的间接衍生的方法，省去了对样品进行前处理的衍生步骤，节省有机试剂的消耗和分析时间，降低检测成本。所得多克隆抗体的效价为1：64000，半抑制浓度为56.3mg/L，其组胺的最低检测限可达25.8mg/L低于各国规定的限量标准。
【专利说明】一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法 与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全免疫检测【技术领域】，更具体地，涉及一种直接针对组胺的半 抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 组胺又名组织胺，化学名称为4 -(5) - (2-氨乙基）咪唑，是一种广泛存在于各 生物体组织中的胺类物质。生物体中的组氨酸经过组胺酸脱羧酶的作用形成组胺，组胺是 生物胺中对人体健康影响最大的物质。组胺一般很容易代谢，但如果摄入由于细菌的污染 导致食物中组胺的含量水平超过人体对其代谢能力时，就会对机体产生危害。组胺中毒是 水产食品存在的主要安全问题之一，世界各地尤其是沿海地区组胺中毒事件时有发生。组 胺可引起头痛、瘙痒性皮疹、低血压等一系列过敏反应，对消化道有强烈的刺激作用，可造 成肠胃出血、糜烂，其在动物源性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。鉴于此，美国FDA 要求进口水产品组胺不得超过50 mg/kg;欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100 mg/ kg;我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000 mg/kg;其他海水鱼不得超过300 mg/kg。目前国内 外检测组胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方 法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵 复杂、费时费力，很难满足在许多场合中快速检测组胺的需要，在应用上不能得到有力的推 广。
[0003] 基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快 速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领 域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心是决定整个方法性能的 重要基础，而抗体的效果很大程度上又取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。由 于组胺分子质量非常小（111. 14 Da)，得到高特异性且针对组胺的抗体一直是有关学者致 力解决的难题。
[0004] 1984 年，Mital 等人在《Agents and Actions》发表题为 An attempt to produce an antibody of histamine and histamine derivatives 的文章，他们首先尝试了用牛血 清蛋白（BSA) - 丁二酰组胺偶联物作为免疫原去免疫大白兔，得到的血清含有抗BSA的抗 体，没检测到识别半抗原(组胺）的抗体；接着，他们又将BSA与对-[2-(N-三氟乙酰组胺） 偶氮基]苯甲酸偶联免疫兔子，得到了对三氟乙酰组胺有一定识别的抗体，然而该抗体对 含三氟乙酰基的化合物都有一定的识别，不适合用于建立免疫分析方法。1986年，Guesdon 等人在〈〈Journal of Immunological Methods〉〉发表题为 Monoclonal anti-histamine antibody ：preparation,characterization and application to enzyme immunoassay of histaminel的文章，他们选择通过对苯醌将组胺与BSA偶联免疫Balb/c小鼠得到一株分泌 针对组胺与苯醌复合物的单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述杂交瘤细胞产生的抗体对组胺苯 醌复合物的亲和力达到约1. 3X109 L/mol。但是，采用对苯醌与组胺衍生化副反应很多，反 应过程不好控制，且产物稳定性不好，导致重复性差。1988年，Morel等人在《Journal of Allergy and Clinical Immunology〉〉发表题为 Immunoanalysis of histamine through a novel chemical derivatization的文章，他们用琥拍酰甘氨酰亚胺作衍生试剂，衍生组 胺，并制备了针对该衍生物的单克隆抗体，该抗体与衍生物的亲和力比组胺本身高5X 105 倍，并与其他类似物不存在交叉反应，但是该衍生方法的步骤多，操作复杂，产物纯化难度 很大。申请号为201310197597. 9的发明专利公开了一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其 制备方法与应用，但该制备得到的组胺半抗原所产生的抗体仅针对组胺衍生物(例如苯甲 酰化组胺)，还不能直接用于检测组胺。
[0005] 现有的组胺检测技术以仪器法居多，而仪器法操作繁复，前处理复杂，成本高，不 适应用现场大批量样品的检测。现有的免疫检测方法分为：直接法，即检测组胺本身，间接 法，即检测组胺的衍生物。直接法所采用的抗体是直接针对组胺本身，但是由于组胺分子量 太小。间接法一般是将组胺衍生化增大其分子量，制备出针对其衍生物的抗体，所用的抗 体，是针对组胺衍生物，在检测时先将组胺衍生为相应的组胺衍生物，通过检测组胺衍生物 从而间接地实现对组胺的检测。其灵敏度较直接法所用抗体高，但是检测时，衍生步骤的引 入加重了样品前处理的负担，有悖于快速检测的理念。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服传统组胺检测技术中抗体仅针对组胺衍生物，组 胺检测时需要先进行衍生化处理等缺陷，提供一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗 体。
[0007] 本发明的第二个目的是提供上述直接针对组胺半抗原、人工抗原和特异性抗体的 制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述半抗原、人工抗原或特异性抗体在在组胺免疫检 测方面的应用。
[0009] 本发明的第四个目的是提供一种直接检测组胺的免疫分析方法。
[0010] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 提供一种直接针对组胺的半抗原，所述组胺半抗原具有式（I )所示分子结构：
【权利要求】
1. 一种直接针对组胺的半抗原，其特征在于，具有式（I )所示分子结构：
其中，n=0?6。
2. 权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将组胺二盐酸盐 与具有式(III)所示分子结构的带羧基的苯甲醛衍生物缩合后用硼氢化钠还原得到具有式 (I )所示分子结构的组胺半抗原；
其中，n=0?6。
3. 权利要求1所述半抗原制备得到的人工抗原，其特征在于，具有式（II)所示分子结 构：
其中，n=0?6。
4. 权利要求3所述人工抗原的制备方法，其特征在于，将具有式（I )所示分子结构的 组胺半抗原溶于硼酸溶液中，搅拌加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，然 后再加入载体蛋白，4 °C下磁力搅拌反应过夜；偶联混合物，4 °C下用生理盐水透析得到目 的产物；所述组胺半抗原与载体蛋白的摩尔比为1〇〇?25 :1。
5. 权利要求3所述人工抗原制备得到的抗体，其特征在于，包括单克隆抗体、多克隆抗 体或基因工程抗体。
6. 权利要求3所述人工抗原或权利要求5所述抗体在组胺免疫分析检测中的应用。
7. -种直接检测组胺的免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
51. 将具有式（I )所示分子结构的组胺半抗原与载体蛋白偶联制备具有式（II)结构 的免疫原，免疫动物制备组胺的多克隆抗体；
52. 将具有式（II)所示分子结构的组胺人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤 S1制备得到组胺的多克隆抗体加入微孔板中；
53. 加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中组胺的含量；
其中n=0?6。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋 白。
9. 跟据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1所述组胺半抗原与载体蛋白偶联是将 具有式（I )分子结构的组胺半抗原溶于硼酸溶液中，搅拌加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亚胺盐酸盐，然后加入一定量的载体蛋白，4 °C下磁力搅拌反应过夜，保持pH在 4. 5?5. 0之间；偶联混合物4 °C下用生理盐水透析得到目的产物；所述组胺半抗原与载 体蛋白的摩尔比为100?25 :1。
【文档编号】C07K16/06GK104119277SQ201410338095
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】孙远明, 罗林, 徐振林, 沈玉栋, 王弘, 雷红涛, 杨金易, 肖治理 申请人:华南农业大学