一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在NΔ19 RhoGDI2 N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；该融合蛋白的制备方法包括以下步骤：(1)构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒；(2)利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白；(3)分离纯化eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白。与现有技术相比，本发明首次制备了TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白，纯度达到92.5％。MTT和Transwell实验检测发现，纯化的TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白对包括膀胱癌T24细胞在内的癌细胞具有明显的增殖抑制和侵袭作用。
【专利说明】-种TAT-BH3-NA19 Rh〇GDI2融合蛋白及其制备方法和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白及其制备方法，尤其是涉及一种TAT-BH3-NA 19Rho⑶12 融合蛋白及其制备方法和应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 自从Leffers等人发现Rho⑶12以来，人们对它的认识与日俱增。近年来，Rho⑶12 与癌症的关系逐步为人们所知。Rh 〇GDI2是RhoGDI家族成员之一，在抑制Rho家族的活性 方面起着重要的调控作用。研究发现，RhoGDI 2在膀胱癌，肺癌和霍奇金淋巴瘤中是下调的， 并且参与细胞的凋亡过程。Rho⑶12有两个caspase家族裂解位点。在凋亡过程中，N A 19 Rho⑶12是Rho⑶12的N端缺乏前19个氨基酸的残基。N A 19 Rho⑶12是caspase-3的裂 解产物，并向细胞核迁移，起着诱导细胞凋亡的作用。而BH3结构域普遍存在于Bcl-2家族 成员中，对介导促凋亡成员与抑凋亡成员的结合及促凋亡成员的促凋亡活性起重要作用。 目前，N A 19 Rho⑶12的研究主要侧重于其抑制肿瘤生长与转移的机制，而关于通过运用基 因工程技术将TAT穿膜肽、促凋亡短肽BH3和N A 19 Rho⑶12进行融合表达，以期促进癌细 胞凋亡，提高肿瘤抑制效果，尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种纯度高、具有肿 瘤抑制作用的TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白及其制备方法和应用。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0005] -种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白，为TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在 NA 19 Rho⑶12的N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0006] 所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，所述的促凋亡短肽BH3的 氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，所述的N A 19 Rho⑶12的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所 /Jn 〇
[0007] 编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0008] 一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0009] (1)构建 pPAL7/eXact-TAT-BH3_N A 19 Rho⑶ 12 重组质粒；
[0010] (2)利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白；
[0011] (3)分离纯化 eXact-TAT-BH3_NA I9 Rho⑶I2 融合蛋白。
[0012] 步骤（1)所述的构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12重组质粒具体包括以 下步骤：
[0013] a.以序列如SEQ ID NO :6所示的上游引物和序列如SEQ ID NO :7所示的下游引 物为反应引物，以全长的Rho⑶12基因为模板，其中Rho⑶12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示，PCR反应，获得TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的编码基因，即目的基因；
[0014] b.用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和pPAL7/eXact表达质 粒用BamH I和HindIII进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pPAL7/eXact-TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆送样测序。
[0015] 所述的PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸50s，循环30次，最后72°C延伸5min。
[0016] 步骤（2)所述的利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融 合蛋白具体包括以下步骤：
[0017] 将测序正确的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT-N A 19 Rho⑶12重组质粒的大肠杆菌 BL21在含有100 ii g/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当OD6tltl达到0. 6时，加入终浓 度为ImM的IPTG，37°C诱导4h，异源表达eXact-BH3-TAT-NA 19Rho⑶12融合蛋白。
[0018] 步骤（3)所述的分离纯化eXact-TAT-BH3_N A 19 Rho⑶12融合蛋白具体包括以下 步骤：
[0019] 在上样过程中，Profinity eXact纯化系统中固定化的枯草杆菌蛋白酶识别并亲和 带eXact标签的蛋白质，随后加入洗脱缓冲液，使枯草杆菌蛋白酶切断融合蛋白上的标签， 最终得到仅带有自身天然氨基酸序列的高度纯化的目标蛋白，即TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12 融合蛋白。
[0020] 一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的应用，所述的TAT-BH3-N A 19Rho⑶12融 合蛋白用于抑制癌细胞的增殖和侵袭。所述的癌细胞包括膀胱癌T24细胞、肺癌A549细胞 及膀胱癌UM-UC-3细胞。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下的优点及有益效果：
[0022] (1)首次将TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在N A 19 Rho⑶12的N端，构 成 TAT-BH3-NA 19 Rho⑶ 12 融合蛋白。构建 pPAL7/eXact-TAT-BH3-NA 19Rho⑶ 12 重 组质粒，经过异源表达和分离纯化，大量制备TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白。最终 TAT-BH3-N A 19 RhoGDI2融合蛋白的浓度为I. 64g/L，纯度为92. 5 %。
[0023] (2) TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的TAT穿膜肽可以将N A 19 Rho⑶12蛋白转 移到细胞内，而促凋亡短肽BH3则能增强N A 19 Rho⑶12的促凋亡和肿瘤抑制效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为pPAL7/eXact-TAT-BH3_NA 19 Rho⑶12重组质粒的构建过程示意图；
[0025] 图2为6父&(^-了六1'-8113，八19 1^0〇)12融合蛋白的表达情况图；
[0026] 图3为Profinity eXact系统纯化结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0028] 实施例1
[0029] 一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白，为TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在 NA 19 Rho⑶12的N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0030] TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，促凋亡短肽BH3的氨基酸序列如 SEQ ID NO :3所示，NA 19 Rho⑶12的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0031] 编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0032] -种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0033] (1)构建 pPAL7/eXact-TAT-BH3_N A 19 Rho⑶ 12 重组质粒：
[0034] a.获取TAT-BH3-NA19 Rho⑶12融合蛋白的编码基因。如图1所示，以全长的 Rho⑶12基因为模板，其中Rho⑶12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示，利用含有TAT 穿膜肽及促凋亡短肽BH3编码序列的上游引物（序列如SEQ ID NO :6所示）和下游引物 (序列如SEQ ID NO : 7所示），通过PCR扩增将TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3的编码基因串 连融合到N A 19 Rho⑶12基因的N端，获得TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白编码基因。
[0035] 上游引物：5' -CCCAAGCTTTGTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGA ATGCT GCGGCGGATGGCGGAGGAGCTGAAC agcaagctcaattataagcct-3 '(下划线表示 TAT穿膜肽编码序列，波浪线表示BH3编码序列）
[0036] 下游引物：5，-CGCGGATCCTCATTCTGTCCACTCCTTCTT-3，
[0037] PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸50s， 循环30次，最后72°C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒（Omega)回 收目的片段。
[0038] b?利用BamH I和HindIII将所得的TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12基因片段和 pPAL7/eXact表达质粒双酶切。T4 DNA连接酶22°C连接2h，获得重组表达质粒pPAL7/ eXact-TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12,将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克 隆，通过菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测 序。
[0039] (2)利用大肠杆菌BL21 (DE3)异源表达eXact-TAT-BH3_NA 19 Rho⑶12融合蛋 白：
[0040] 将测序正确的含有pPAL7/eXact-TAT-BH3_NA 19 Rho⑶12重组质粒的 E. coliBL21(DE3)在含有lOOiig/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当OD6tltl达到0. 6 时，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导4h，异源表达eXact-TAT-BH3-NA 19Rho⑶12融合 蛋白。在4°C下，IOOOOXg离心lOmin，收集菌体。超声破碎细胞，分别收集上清和沉淀。参 考图2,图2中1为低分子量蛋白marker，2为未诱导菌体破碎液上清，3为诱导菌体破碎液 上清，4为诱导菌体破碎液沉淀。SDS-PAGE结果显示，融合蛋白大部分存在于上清中。
[0041] (3)eXact-TAT-BH3_NA 19 Rho⑶ 12 融合蛋白的纯化
[0042] 用5CV的PB缓冲液（100mmol/L，pH = 7. 2)以2mL/min的流速平衡柱子。柱子平 衡好后，将蛋白粗体液以〇. 5mL/min的流速上样。随后用IOCV的PB缓冲液（100mm〇l/L， pH = 7. 2)以lmL/min的流速洗脱杂蛋白。室温孵育30min后，用5CV的含lOOmmol/L NaF 的PB缓冲液（100mm〇l/L PB, pH = 7. 2)以lmL/min的流速洗脱目的蛋白。洗脱得到的目 的蛋白的纯度可达92. 5%。
[0043] Profinity eXact系统纯化结果如图3所示，图3中1为低分子量蛋白marker, 2为 菌体破碎液上清，3为上清蛋白上样穿透液，4为起始洗涤杂蛋白液，5为洗涤结束时杂蛋白 液，6为蛋白洗脱液。
[0044] (4)纯化的TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12蛋白的定量
[0045] 总蛋白浓度采用Bradford法来测定。将纯化得到的收集液进行SDS-PAGE电泳， 电泳后用考马斯亮蓝R-250染色30min，然后用脱色液脱色，最后用计算机软件Gel-Pro analyzer扫描凝胶，分析TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的浓度及纯度。
[0046] 通过以上纯化操作，获得浓度为1.64g/L，纯度为92. 5 %的 TAT-BH3-NA 19Rho⑶ 12 融合蛋白。
[0047] 进行MTT和Transwell实验，检测发现，纯化的TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白 对膀胱癌T24细胞具有明显的增殖抑制和侵袭作用。
[0048] 实施例2
[0049] BH3-TAT-NA 19 Rho⑶12融合蛋白的制备
[0050] (1)构建 pPAL7/eXact-BH3-TAT_N A 19 Rho⑶ 12 重组质粒。
[0051] a.获取BH3-TAT-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的编码基因。以全长的Rho⑶12基因为 模板，利用含有促凋亡短肽BH3及TAT穿膜肽编码序列的上游引物和含有Rh 〇GDI2编码序 列的下游引物，通过PCR扩增将促凋亡短肽BH3和TAT穿膜肽的编码基因串连融合到N A 19 Rho⑶12基因的N端，获得BH3-TAT-N A 19 Rho⑶12融合蛋白编码基因。
[0052] 上游引物：5, -CCCAAGCTTTGATGCTGCGGCGGATGGCGGAGGAGCTGAAC TATGGCAGG AAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGA agcaagctcaattataagcct-3 '(下划线表示 BH3 编码序列，波浪线表示TAT穿膜肽编码序列）
[0053] 下游引物：5 ' -CGCGGATCCTCATTCTGTCCACTCCTTCTT-3 '
[0054] PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸50s， 循环30次，最后72°C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒（Omega)回 收目的片段。
[0055] b?利用BamH I和HindIII将所得的BH3-TAT-N A 19 Rho⑶12基因片段和 pPAL7/eXact表达质粒双酶切。T4 DNA连接酶22°C连接2h，获得重组表达质粒pPAL7/ eXact-BH3-TAT-NA19 Rho⑶12,将连接产物转化E. coli BL21(DE3)感受态。挑选阳性克 隆，通过菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测 序。
[0056] (2)利用 E. coli BL21 (DE3)异源表达 eXact-BH3-TAT-NA 19 Rho⑶ 12 融合蛋白。
[0057] 将测序正确的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT_NA 19 Rho⑶12重组质粒的 E. coliBL21(DE3)在含有lOOiig/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当OD6tltl达到0. 6 时，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导4h，异源表达eXact-BH3-TAT-NA 19Rho⑶12融合 蛋白。在4°C下，IOOOOXg离心lOmin，收集菌体。超声破碎细胞，分别收集上清和沉淀。 SDS-PAGE结果显示，融合蛋白大部分存在于上清中。
[0058] 实施例3
[0059] TAT-NA 19 Rho⑶I2-BH3融合蛋白的制备
[0060] (1)构建 pPAL7/eXact-TAT_N A 19 Rho⑶I2-BH3 重组质粒。
[0061] a.获取TAT-N A 19 Rho⑶I2-BH3融合蛋白的编码基因。以全长的Rho⑶12基因为 模板，利用含有TAT穿膜肽编码序列的上游引物和促凋亡短肽BH3的下游引物，通过PCR扩 增将TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3分别融合到N A 19 Rho⑶12基因的两端，获得TAT-N A 19 Rho⑶I2-BH3融合蛋白编码基因。
[0062] 上游引物：5，-CCCAAGCTTTGTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAAGCAAGCTCAATT ATAAGCCT-3'(下划线表示TAT穿膜肽编码序列）
[0063] 下游引物：5，-CGCGGATCCTCA GTTCAGCTCCTCCGCCATCCGCCGCAGCAT TTCTGTCCACTCCTTCTT-3'（波浪线表示BH3编码序列）
[0064] PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸50s， 循环30次，最后72°C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒（Omega)回 收目的片段。
[0065] b?利用BamH I和HindIII将所得的TAT-N A 19 Rho⑶I2-BH3基因片段和 pPAL7/eXact表达质粒双酶切。T4 DNA连接酶22°C连接2h，获得重组表达质粒pPAL7/ eXact-TAT-NA19 Rho⑶I2-BH3,将连接产物转化E. coli BL21(DE3)感受态。挑选阳性克 隆，通过菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测 序。
[0066] (2)利用 E. coli BL21 (DE3)异源表达 eXact-TAT-NA 19 Rho⑶I2-BH3 融合蛋白。
[0067] 将测序正确的含有pPAL7/eXact-TAT_NA 19 Rho⑶I2-BH3重组质粒的E. coli BL21 (DE3)在含有100 ii g/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当OD6tltl达到0. 6时，加入 终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导4h，异源表达eXact-TAT-NA 19Rho⑶I2-BH3融合蛋白。在 4°C下，10000 Xg离心lOmin，收集菌体。超声破碎细胞，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE结 果显示，融合蛋白大部分存在于上清中。
[0068] 实施例4
[0069] TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白的制备
[0070] (1)构建 pET28a(+)/TAT-BH3-N A 19 RhoGDI2 重组质粒。
[0071] a.获取TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的编码基因。以全长的Rho⑶12基因为 模板，利用含有TAT穿膜肽及促凋亡短肽BH3编码序列的上游引物和下游引物，通过PCR扩 增将TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3的编码基因串连融合到N A 19Rho⑶12基因的N端，获得 TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白编码基因。
[0072] 上游引物：5' -CGCGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGA ATGCTGC GGCGGATGGCGGAGGAGCTGAAC AGCAAGCTCAATTATAAGCCT-3'(下划线表示 TAT 穿 膜肽编码序列，波浪线表示BH3编码序列）
[0073] 下游引物：5 ' -CCGCTCGAGTCATTCTGTCCACTCCTTCTT-3，
[0074] PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸50s， 循环30次，最后72°C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒（Omega)回 收目的片段。
[0075] b?利用BamH I和Xho I将所得的TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12基因片段和 pET28a(+)表达质粒双酶切。T4 DNA连接酶22°C连接2h，获得重组表达质粒pET28a(+)/ TAT-BH3-NA19 Rho⑶12,将连接产物转化E. coli BL21(DE3)感受态。挑选阳性克隆，通过 菌液PCR和重组质粒上酶切初步验证阳性克隆，将初步验证正确的重组菌送样测序。
[0076] (2)利用 E. coli BL21 (DE3)异源表达pET28a(+)/TAT-BH3-NA 19 Rho⑶ 12 融合蛋 白。
[0077] 将测序正确的含有pET28a (+) /TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12重组质粒的E. coli BL21 (DE3)在含有100 ii g/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当OD6tltl达到0. 6时，加入 终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导4h，异源表达TAT-BH3-N A 19Rho⑶12融合蛋白。在4°C下， IOOOOXg离心lOmin，收集菌体。超声破碎细胞，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE结果显 示，融合蛋白大部分存在于上清中。
[0078] 上述的对实施例的描述是为便于该【技术领域】的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
[0079]
【权利要求】
1. 一种TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白，其特征在于，为TAT穿膜肽和促凋亡短肽 BH3串连在NA19 Rho⑶12的N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根据权利要求1所述的一种TAT-BH3-NA19 Rho⑶12融合蛋白，其特征在于，所述 的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，所述的促凋亡短肽BH3的氨基酸序列如 SEQ ID N0:3所示，所述的NA19 Rho⑶12的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
3. 根据权利要求1所述的一种TAT-BH3-NA19 Rho⑶12融合蛋白，其特征在于，编码该 融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
4. 一种如权利要求1?3任一所述的TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法， 其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 构建 pPAL7/eXact-TAT-BH3-NA 19 Rho⑶ 12 重组质粒； (2) 利用大肠杆菌此21异源表达6乂&(^-了41'-81134八19诎〇0)12融合蛋白； (3) 分离纯化6父&(^-1六1'-8113，八19 1^〇0)12融合蛋白。
5. 根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，其特征 在于，步骤（1)所述的构建口?417/6乂&(^-了41'-81134八19 1^〇0)12重组质粒具体包括以下 步骤： a. 以序列如SEQ ID NO :6所示的上游引物和序列如SEQ ID NO :7所示的下游引物为 反应引物，以全长的Rho⑶12基因为模板，其中Rho⑶12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :8 所示，PCR反应，获得TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白的编码基因，即目的基因； b. 用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和pPAL7/eXact表达质粒 用BamH I和Hindlll进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pPAL7/eXact-TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆送样测序。
6. 根据权利要求5所述的一种TAT-BH3-NA19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，其特征 在于，所述的PCR反应的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 50s，循环30次，最后72°C延伸5min。
7. 根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，其特征 在于，步骤（2)所述的利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NA 19Rho⑶12融合蛋 白具体包括以下步骤： 将测序正确的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT-N A 19 Rho⑶12重组质粒的大肠杆菌BL21 在含有100 y g/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C培养，当0D_达到0. 6时，加入终浓度为 ImM 的 IPTG，37°C诱导 4h，异源表达 eXact-BH3-TAT-NA 19Rho⑶ 12 融合蛋白。
8. 根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融合蛋白的制备方法，其特征 在于，步骤（3)所述的分离纯化6乂&(^-了41'-81134八19 1^〇0)12融合蛋白具体包括以下步 骤： 在上样过程中，Profinity eXact纯化系统中固定化的枯草杆菌蛋白酶识别并亲和带 eXact标签的蛋白质，随后加入洗脱缓冲液，使枯草杆菌蛋白酶切断融合蛋白上的标签，最 终得到仅带有自身天然氨基酸序列的高度纯化的目标蛋白，即TAT-BH3-N A 19 Rho⑶12融 合蛋白。
9. 一种如权利要求1?3任一所述的TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白的应用，其特 征在于，所述的TAT-BH3-NA 19 Rho⑶12融合蛋白用于抑制癌细胞的增殖和侵袭。
10.根据权利要求9所述的一种TAT-BH3-NA19 Rho⑶12融合蛋白的应用，其特征在 于，所述的癌细胞包括膀胱癌T24细胞、肺癌A549细胞及膀胱癌UM-UC-3细胞。
【文档编号】C07K19/00GK104356239SQ201410412110
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】孙爱友, 魏东芝, 赵志强, 徐瑞 申请人:华东理工大学