抗-血管内皮生长因子的抗体的制作方法

抗-血管内皮生长因子的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗-血管内皮生长因子的抗体。公开了人源化和变异的抗-VEGF抗体及其各种不同用途。抗-VEGF抗体对VEGF有很强的结合亲和力，可在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，并且可在体内抑制肿瘤生长。
【专利说明】抗-血管内皮生长因子的抗体
[0001] 此案是申请日为1998年4月3日、中国申请号为200910147016. 4、发明名称为 "抗-血管内皮生长因子的抗体"的发明申请的分案申请。
[0002] 交叉引用
[0003] 本申请是未审定的美国申请No. 08/833, 504 (1997年4月7日申请）的部分续展 申请，美国申请No. 08/833, 504在此在被引用作为参考并且根据35U. S. C. § 120要求其申 请优先权。 发明领域
[0004] 本发明一般涉及抗-VEGF的抗体，具体地，涉及人源化的抗-VEGF抗体和变异的 抗-VEGF抗体。
[0005] 相关技术的描述
[0006]目前已充分确定，在多种疾病的发病机理中涉及血管生成。这包括实体瘤、眼内 新血管综合症如增生性视网膜病或年龄相关性黄斑变性（AMD)、类风湿性关节炎、和牛皮癣 (Folkman 等人，生物化学杂志（J. Biol. Chem.) 267:10931-10934 ;Klagsbrun 等人，Annu. Rev.Physiol. 53:217-239(1991);和 Garner A, Vascular Diseases In:Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach.Garner A, Klintworth GK 编，2 版,Macel Dekker，NY，ppl625-1710(1994))。在实体瘤情况下，新血管生成使得与正常细胞相比 肿瘤细胞能够获得生长优势和增殖自主性。因此，观察到肿瘤切片的微血管密度和乳 腺癌及数种其他肿瘤的病人存活率之间的相关性（Weidner等人，新英格兰医学杂志 (N. Engl. J. Med. )324:1-6 (1991) ;Horak 等人，柳叶刀（Lancet) 340:1120-1124 (1992);和 Macchiarini 等人，柳叶刀（Lancet) 340:145-146 (1992))。
[0007] 对血管生成的正调节物的研究已得到了许多候选物质，其中包括：aFGF、bFGF、 TGF-α、TNF-P、HGF、TNF-a、血管生成素、IL-8 等（Folkman 等人和 Klagsbrun 等人）。目 前为止被鉴别出的负调节物包括：血小板反应蛋白（Good等人，美国科学院院报（Proc. Nat 1 · Acad. Sci· USA) 87:6624-6628 (1990) )、16 千道尔顿的促乳素 N 末端片段（Clapp 等 人，Endocrinology, 133:1292-1299(1993))、血管抑制素（angiostatin) (O'Reilly 等 人，细胞（Cell)79:315-328(1994))和内皮抑制素（endostatin)(0'Reilly 等人，细胞 (Cell)88, 277-285(1996))。
[0008] 在过去数年中所做的工作已确立了血管内皮生长因子（VEGF)在调节正常和异 常血管生成方面的关键地位（Ferrara等人，Endocr. Rev. 18:4-25(1997))。丢失甚至一 个VEGF等位基因会导致胚胎死亡，这一发现指明了该因子在血管系统发育和分化过程 中所起的不可替代的作用（Ferrara等人）。此外，还表明VEGF是与肿瘤和眼内疾病相 关的新血管生成的关键介质（Ferrara等人）。在受检查的大多数人肿瘤中，VEGF mRNA 是过度表达的（Berkman等人，临床研究杂志（J. Clin. Invest. )91:153-159(1993); Brown 等人，Human Pathol. 26:86-91(1995) ;Brown 等人，癌症研究（Cancer Res. )53:4727-4735 (1993) ;Mattern 等人，Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996) ;h Dvorak 等人，Am. J. Pathol. 146:1029-1039(1995))。而且，在眼睛液体中VEGF浓度，与患糖尿 病和其他局部缺血有关的视网膜疾病的病人中存在的血管活跃增殖现象是高度相关的 (Aiello 等人，新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.)331:1480-1487(1994))。此外，最近 的研究已表明，在患AMD的病人中脉络膜的新血管膜中存在VEGF (Lopez等人，Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868(1996))。抗-VEGF中和抗体可抑制裸鼠中各种不同人 肿瘤细胞系的生长（Kim等人，自然（Nature) 362:841-844(1993) ;Warren等人，临床 研究杂志（J. Clin. Invest. )95:1789-1797(1995) ;Borgstrom 等人，癌症研究（Cancer Res.) 56:4032-4039 (1996)和 Melnyk 等人，癌症研究（Cancer Res. )56:921-924 (1996))， 并且在缺血性视网膜疾病模型中也抑制眼内的血管生成（Adamis等人，Arch. Ophthalmol. 114:66-71(1996))。因此，对于治疗实体瘤和各种眼内新血管疾病，抗-VEGF 的单克隆抗体或其他抑制VEGF作用的抑制剂是有前途的候选物质。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明描述了具有治疗前景的有利特性的人源化抗-VEGF抗体和变异的抗-VEGF 抗体，这些特性包括：与VEGF的强结合亲和力；在体外抑制VEGF-诱导型内皮细胞增殖的 能力；和在体内抑制VEGF-诱导型血管生成的能力。
[0011] 此处优选的人源化抗-VEGF抗体或变异的抗-VEGF抗体结合于人VEGF时的Kd值 不超过约1X 1(Γ8Μ，更佳地不超过约5 X 1(Γ9Μ。此外，对于在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞 增殖，人源化或变异的抗-VEGF抗体的ED50值不超过约5nM。此处特别感兴趣的人源化或 变异抗-VEGF抗体，是那些在抗体剂量为5毫克/千克下在A673体内肿瘤模型中能抑制至 少50 %肿瘤生长的种类。
[0012] 在一实例中，抗-VEGF抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括 具有如下氨基酸序列的高变区：⑶RH1 (GYXfTXJGMN，其中Xi是T或D，而X2是N或H ;SEQ ID N0:128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID N0:2)和 CDRHSaPXJYGXjHWYFDV,其中 Xi是Y或H，而X2是S或T ;SEQ ID NO: 129)。例如，重链可变区可包含CDRH1 (GYTFTNYGMN ; SEQ ID N0:1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID N0:2)和 CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV;SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列。较佳地，3个重链高变区在人构架区域中，例如作为由下式表示的 连续序列：FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4。
[0013] 本发明还提供了抗-VEGF抗体重链可变区，它具有氨基酸序列：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYX^T X2YGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVWGQGTLVT VSS(SEQ ID 勵：125)，其中父1是1'或 D ;X2是N或H ;X3是Y或H以及X4是S或T。一种特别有用的重链可变区序列是实施例1 的F(ab)-12人源化抗体的重链可变区，它包含SEQ ID N0:7的重链可变区序列。这种优选 的重链可变区序列可与下面优选的轻链可变区序列或其他轻链可变区序列组合，只要这样 产生的抗体能结合于人VEGF。
[0014] 本发明还提供了优选的轻链可变区序列，它可与上述重链可变区序列或其他重链 可变区序列组合，只要这样产生的抗体能结合于人VEGF。例如，轻链可变区可包含具有下列 氨基酸序列的高变区：CDRL1(SASQDISNYLN;SEQ ID N0:4)，CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID N0:5) 和CDRL3(QQYSTVPWT;SEQIDN0:6)。较佳地，3个轻链高变区在人构架区域中，例如作为由 下式表示的连续序列：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。
[0015] 在一实例中，本发明提供了人源化的抗-VEGF抗体轻链可变区，它具有氨基 酸序列：DIQXJQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID 勵：124)，其中父1是]? 或L。一种特别有用的轻链可变区序列是实施例1的F(ab)-12人源化抗体的轻链可变区， 它包含SEQ ID N0:8的轻链可变区序列。
[0016] 本发明还提供了亲代抗-VEGF抗体的变异抗体（该亲代抗体宜为人源化或人的 抗-VEGF抗体），其中变异抗体结合于人VEGF并且在亲代抗-VEGF抗体的重链或轻链可 变区的高变区中包含了氨基酸取代。变异抗体较佳地在抗-VEGF抗体的一个或多个高变 区中具有一个或多个取代。较佳地，取代位于亲代抗体的重链可变区中。例如，氨基酸取 代可以位于重链可变区的⑶RH1和/或⑶RH3。较佳地，在这两种高变区中都有取代。这 种"亲和力成熟"变异抗体在本文中已表明可比产生它们的亲代抗-VEGF抗体更有力地结 合于人VEGF，即它们的K d值明显低于亲代抗-VEGF抗体。较佳地，与亲代抗-VEGF抗体相 t匕，变异抗体的在体外抑制VEGF-诱导型内皮细胞增殖的ED50值低至少约10倍，较佳地低 至少约20倍，最佳地低至少约50倍。一种特别优选的变异抗体是实施例3的Y0317变异 抗体，它具有氨基酸序列为GYDFTHYGMN(SEQ ID N0:126)的⑶RH1以及具有氨基酸序列为 YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID N0:127)的CDRH3。这些高变区和CDRH2通常位于人构架区，例如 导致重链可变区具有SEQ ID N0:116的氨基酸序列。这种重链可变区序列可任选地与具有 SEQ ID N0:124氨基酸序列的轻链可变区组合，更佳地与具有SEQ ID N0:11氨基酸序列的 轻链可变区组合。
[0017] 各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如，抗-VEGF抗体可以是全长的抗体（例 如具有完整的人Fc区），或是抗体片段（如Fab、Fab'或F(ab'） 2)。此外，抗体可以用可检 测的标记物进行标记，固定在固相载体上，和/或偶联于异源化合物（如细胞毒性物质）。
[0018] 抗体的诊断和治疗用途被包括在内。在一种诊断应用中，本发明提供了一种确定 VEGF蛋白是否存在的方法，它包括：将怀疑含有VEGF蛋白的样品暴露于抗-VEGF抗体，然 后测定抗体与样品的结合。对于该应用，本发明提供了一试剂盒，它含有抗体和使用抗体来 检测VEGF蛋白的说明书。
[0019] 本发明还提供了：分离的编码该抗体的核酸；含有该核酸的载体，其中该核酸可 任选地操作性连接于被载体所转化的宿主细胞所识别的控制序列；含该载体的宿主细胞； 产生该抗体的方法，它包括培养该宿主细胞从而表达核酸，以及任选地从宿主细胞培养物 (如从宿主细胞培养液中）中回收抗体。本发明还提供了一种组合物，它含抗-VEGF抗体和 药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗的组合物是灭菌的并且可以是冻干的。本发明还 提供了治疗患肿瘤或视网膜疾病的哺乳动物的方法，它包括将治疗有效量的抗-VEGF抗体 施用于哺乳动物。
[0020] 本发明涉及：
[0021] 1. 一种人源化抗-VEGF抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约1 X 10_8M。
[0022] 2. -种人源化抗-VEGF抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约5 X 10_9M。
[0023] 3. -种人源化抗-VEGF抗体，它在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的ED50值 不超过约5nM。
[0024] 4. 一种人源化抗-VEGF抗体，它在体内抑制VEGF-诱导型血管生成。
[0025] 5.如4所述的人源化抗-VEGF抗体，5毫克/千克的该抗体在A673体内肿瘤模型 中抑制至少50%肿瘤生长。
[0026] 6.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区，该重链可变区包括具有 如下氨基酸序列的高变区：⑶RH1 (GYX^TXJGMN，其中乂1是1'或D，而X2是N或H ;SEQ ID NO: 128)，CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR ;SEQ ID NO: 2)和 CDRH3 (YPXJYGXjHWYFDV,其中 X!是 Y 或 H，而父2是3 或 T ;SEQ ID NO: 129)。
[0027] 7.如6所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列。
[0028] 8.如6所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区，该重链可变区包括具有 如下氨基酸序列的高变区：CDRH1(GYTFTNYGMN;SEQ ID N0:1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID N0:2)和 CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV;SEQ ID N0:3)。
[0029] 9.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有轻链可变区，轻链可变区可包含具有 下列氨基酸序列的高变区：CDRL1(SASQDISNYLN;SEQ ID N0:4)，CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID N0:5)和 CDRL3(QQYSTVPWT;SEQ ID N0:6)。
[0030] 10.如9所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO:8所述的氨基酸序列。
[0031] 11.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有的重链可变区包括SEQ ID N0:7的氨 基酸序列，而且它具有的轻链可变区包括SEQ ID N0:8的氨基酸序列。
[0032] 12. -种抗-VEGF抗体轻链可变区，它包括氨基酸序列：
[0033] DIQXJQSPSS LSASV⑶RVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID 勵：124)，其中父1是]? 或L。
[0034] 13. -种抗-VEGF抗体重链可变区，它包括氨基酸序列：
[0035] EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYXiFT X2YGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVWGQGTLVT VSS(SEQ ID NO: 125)，其中Xi是T或D ;X2是N或H ;X3是Y或H以及X4是S或T。
[0036] 14. -种亲代抗-VEGF抗体的变异抗体，该变异抗体结合于人VEGF，而且在该亲代 抗体的重链可变区的高变区中有氨基酸取代。
[0037] 15.如14所述的变异抗体，该亲代抗体是人抗体或人源化抗体。
[0038] 16.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约1 X 10_8M。
[0039] 17.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约5 X 10_9M。
[0040] 18.如14所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的⑶RH1中。
[0041] 19.如14所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的⑶RH3中。
[0042] 20.如14所述的变异抗体，该氨基酸取代位于⑶RH1和⑶RH3两者中。
[0043] 21.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值小于该亲代抗体的K d值。
[0044] 22.如14所述的变异抗体，它在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的ED50值比 该亲代抗体的ED50值低至少10倍。
[0045] 23.如18所述的变异抗体，该CDRH1具有氨基酸序列GYDFTHYGMN (SEQ ID NO:126)。
[0046] 24.如19所述的变异抗体，该CDRH3具有氨基酸序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO:127)。
[0047] 25.如14所述的变异抗体，该重链可变区具有SEQ ID NO: 116的氨基酸序列。
[0048] 26.如25所述的变异抗体，该轻链可变区具有SEQ ID N0:124的氨基酸序列。
[0049] 27.如26所述的变异抗体，该轻链可变区具有SEQ ID N0:115的氨基酸序列。
[0050] 28.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它是全长的抗体。
[0051] 29.如28所述的人源化抗-VEGF抗体，它是人IgG。
[0052] 30.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它是抗体片段。
[0053] 31.如30所述的抗体片段，它是Fab。
[0054] 32. -种组合物，它含有1所述的人源化抗-VEGF抗体和药学上可接受的载体。
[0055] 33. -种组合物，它含有14所述的变异的人源化抗-VEGF抗体和药学上可接受的 载体。
[0056] 34.分离的编码1所述抗体的核酸。
[0057] 35.含有34所述核酸的载体。
[0058] 36.含有35所述载体的宿主细胞。
[0059] 37. -种产生人源化抗-VEGF抗体的方法，它包括培养36所述的宿主细胞，从而使 核酸被表达出。
[0060] 38.如37所述的方法，还包括从宿主细胞培养物中回收人源化的抗-VEGF抗体。
[0061] 39. -种在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成的方法，它包括将治疗有效量的 1所述的人源化抗-VEGF抗体施用于该哺乳动物。
[0062] 40.如39所述的方法，该哺乳动物是人。
[0063] 41.如39所述的方法，该哺乳动物有肿瘤。
[0064] 42.如39所述的方法，该哺乳动物有视网膜疾病。
[0065] 附图简述
[0066] 图1A和1B显示了 muMAb VEGF A4. 6. 1的重链可变区（SEQ ID N0:9)和轻链可变 区（SEQIDN0:10)，人源化的F(ab)(F(ab)-12)的重链可变区（SEQIDN0 :7)和轻链可变 区（SEQ ID N0:8)，以及人共有构架（重链亚组III，humIII(SEQ ID N0:11);轻链κ亚组 I,humKl(SEQ ID N0:12))。图1A排列了可变的重链区序列，而图1B排列的可变的轻链区 序列。星号表示在人源化F(ab)-12和鼠单克隆抗体之间，或F(ab)-12和人构架之间的差 另IJ。互补决定区（CDR)用下划线标出。
[0067] 图2是人源化F(ab)-12'和VHg模型的带状图。'区用棕色表示，而⑶R用黄褐 色表示。残基L46的侧链用黄色表示。V H区用紫色表示，而CDR用粉红色表示。从人的变 为鼠的VH残基的侧链用黄色表示。
[0068] 图3显示了实施例1的人源化抗-VEGF F(ab)-12对VEGF诱导型有丝分裂的抑 制作用。将衍生自牛肾上腺皮质的毛细血管内皮细胞，以6X 103细胞/孔的密度接种于 6孔板中，如实施例1所述。按所示浓度加入muMAb VEGF A4. 6. 1或rhuMAb VEGF(IgGl ; F(ab)-12)。在2-3小时后，加入rhVEGF165至终浓度为3ng/ml。在5或6天之后，用胰蛋 白酶处理细胞并计数。所示的数值是两次测量的平均值。与平均值的变差不超过10%。
[0069] 图4显示了实施例1的人源化抗-VEGF F(ab)_12在体内对肿瘤生长的抑制作 用。将A673成横纹肌细胞瘤细胞以2X 1〇7鼠的密度注入BLAB/c裸鼠。在肿瘤细胞接种 开始后24小时，动物每周两次腹膜内注射对照单克隆抗体、muMAb VEGF A4. 6. 1或rhuMAb VEGF(IgGl ;F(ab)-12)。对照单克隆抗体的剂量是5mg/kg ;抗-VEGF单克隆抗体的剂量按 指示是0.5或5mg/kg (η = 10)。在注射肿瘤细胞4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并 称量。*:用ANOVA比较，与对照组相比有显著区别（ρ〈0.05)。
[0070] 图5Α和5Β分别显示了实施例2的下列抗体的轻链可变区和重链可变区的氨 基酸序列：鼠抗体A4.6.1(SEQIDN0 :10是V?而SEQIDN0:9是VH)、人源化的A4.6.1 变异抗体hu2.0(SEQIDN0 :13是V?而SEQIDN0:14是VH)和人源化的鼠 A4.6.1变 异抗体hu2.10(SEQIDN0:15是V?而SEQIDN0:16是VH)。序列编号根据Kabat等 人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th),Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991),并且错配用星号（A4. 6. lvs hu2. 0)或点（hu2. Ovs hu2. 10)表不。变异抗体hu2. 0仅含有鼠抗体的CDR序列（粗体），它被移植于人轻链κ 亚组I共有构架（SEQ ID NO: 12)和重链亚组III共有构架（SEQ ID NO: 11)上。hu2. 10是 用本文所述的噬菌体挑选试验而获得的共有人源化克隆。
[0071] 图6显示了实施例2中随机诱变所针对的构架残基。
[0072] 图7显示了用于在噬菌体上表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒构建物。噬菌 粒编码融合于一部分M13基因 III外被蛋白的人源化的A4. 6. 1抗体Fab片段。该融合蛋 白包括Fab，该Fab在重链的羧基端处连于单个谷氨酰胺残基（受到SupE E. coli的琥珀密 码子的抑制），然后连于基因 III蛋白的C末端区域（残基249-406)。转入F+大肠杆菌， 然后用M13K07辅助噬菌体进行超感染，这样产生了噬菌粒颗粒，其中一部分展示出单拷贝 的融合蛋白。
[0073] 图8A-8F显示了实施例3中噬菌体展示抗体在载体phMB4-19_l. 6的双链核苷酸 序列（SEQ ID N0:99)和编码的氨基酸序列（SEQ ID N0:100)。
[0074] 图9A和9B显示了轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列排列图，被比较的分别 是实施例3的亲和力成熟的抗-VEGF抗体和实施例1的F(ab)-12(SEQ ID N0:8和7分别为 轻链和重链可变区）。⑶R用下划线标出，用L表示轻链，用Η表示重链，并且用1-3编号。 残基在\和V H区中被依次标号，这与Kabat的编号方法相反。显不了模板分子MBL 6 (SEQ ID N0:101和102分别是轻链和重链可变区）以及下列变异抗体：H2305. 6 (SEQ ID N0:103 和104分别是轻链和重链可变区）、Y0101 (SEQ ID NO: 105和106分别是轻链和重链可变 区）以及Y〇192(SEQ ID N0:107和108分别是轻链和重链可变区）。与F(ab)-12的区别用 阴影框标出。
[0075] 图10A和10B显示了轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列排列图，被比较的分 别是实施例3的亲和力成熟的抗-VEGF抗体和实施例1的F(ab)-12(SEQ ID N0:8和7分 别为轻链和重链可变区）。⑶R用下划线标出，用L表示轻链，用Η表示重链，并且用1-3 编号。变异抗体被命名为：Y〇243-l(SEQ ID勵:109和110分别是轻链和重链可变区）、 Y0238-3(SEQIDN0:111和112分别是轻链和重链可变区）、Y0313-1(SEQIDN0:113和114 分别是轻链和重链可变区）以及Y0317 (SEQ ID NO: 115和116分别是轻链和重链可变区）。 与F(ab)-12的区别用阴影框标出。
[0076] 图11显示了实施例3中对变异抗体Y0238-3、Y0192和Y0313-1以及实施例1的 全长F(ab)-12进行HuVEC活性测定的结果。
[0077] 图12显示了实施例1的全长F(ab)_12(rhuMAb VEGF)、实施例1的F(ab)_12的 Fab片段（rhuFab VEGF)和实施例3的亲和力成熟变异抗体Y0317的Fab片段（rhuFab VEGF (亲和力成熟型））对VEGF诱导型有丝分裂的抑制作用。
[0078] 优选例的详细描述
[0079] I.定义
[0080] 如本文所用，术语"人VEGF"指如Leung等人，科学（Science) 246:1306 (1989)和 Houck等人，Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)所述的165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因 子，以及相关的121、189和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，以及这些生长因子的天 然存在的等位基因的或加工的形式。
[0081] 本发明提供了抗-VEGF的拮抗性抗体，它能够抑制VEGF的一种或多种生物活性， 例如其促分裂或血管生成活性。VEGF的拮抗剂通过干扰VEGF与细胞受体的结合、通过使 被VEGF激活的细胞失去功能或被杀灭、或通过干扰VEGF结合于细胞受体后血管内皮细胞 的激活过程而起作用。出于本发明目的，VEGF拮抗剂的所有这些干扰应被认为是等价的。
[0082] 如本文所用，术语"VEGF受体"或"VEGFr"指VEGF的细胞受体，通常是在血管 内皮细胞上的细胞表面受体，以及保留与hVEGF结合能力的变异受体。VEGF受体的一 个例子是fms样酪氨酸激酶（fit)，它是酪氨酸激酶家族的一种跨膜受体（DeVries等 人，科学（Science)255:989 (1992) ;Shibuya 等人，Oncogene 5:519(1990))。fit 受 体包括一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞 外结构域涉及与VEGF的结合，而胞内结构域涉及信号传导。VEGF受体的另一例子是 flk-1受体（也被称为KDR) (Matthews等人，美国科学院院报（Proc. Natl. Acad. Sci. USA)88:9026(1991) ;Terman 等人，0ncogene 6:1677(1991) ;Terman 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992))。VEGF与fit受体的结合导致形成至少2种高分子 量的复合物，表观分子量为205, 000和300, 000道尔顿。据信，300, 000道尔顿的复合物是 包含结合于一个VEGF分子的2个受体分子的二聚体。
[0083] 除非另外说明，术语"表位A4. 6. 1"在本文指可与Kim等人，Growth Factors 7:53(1992)和Kim等人，自然（Nature)362:841(1993)所公开的A4.6. 1抗体结合的，人 VEGF的区域。
[0084] "治疗"指治疗性处理和预防性或防御性措施。需要治疗者包括已经患病以及要预 防疾病的生物。
[0085] 出于治疗目的，"哺乳动物"指任何划为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动 物，以及动物园动物、运动动物和宠物，如狗、马、猫、牛等。较佳地，此处的哺乳动物为人。
[0086] "抗体（Ab)"和"免疫球蛋白（Ig)"是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特 异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的抗体样分子。后一类多 肽可由例如淋巴系统低水平地产生，而由骨髓瘤高水平地产生。
[0087] "天然抗体"和"天然免疫球蛋白"是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个 相同的轻链（L)和两个相同的重链（H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连， 而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链 内二硫键。每条重链的一端有可变区（V H)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区 (')，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的 可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0088] 术语"可变"表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定 抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。 它集中于轻链和重链可变区中被称为高变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为 构架区（FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区（分别是FR1、FR2、FR3和 FR4)，它们大致上呈β-折叠构型，由三个高变区相连。这些高变区形成连接β折叠结构 的环并且在某些情况下是β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在 一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位（参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Tmmunological Interest, (5th 版），Public Health Service, National Instistutes of Health, Bethesda，MD (1991)，第 647-669 页）。恒定区不直接参与抗体与 抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0089] 如本文所用，术语"高变区"指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括 来自"互补决定区"即"CDR"的氨基酸残基（即轻链可变区的残基24-34(Ll)、50-56 (L2) 和 89-97 (L3)以及重链可变区的残基 31-35 (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3) ;Kabat 等 人,Sequences of Proteins of Tmmunological Interest, (5th 版),Public Health Service,National Instistutes of Health,Bethesda,MD(1991))和/或来自"高变环" 的残基（即轻链可变区的残基26-32 (LI)、50-52(L2)和91-96 (L3)以及重链可变区的残 基 26-32〇11)、53-55〇12)和96-101〇13);〇1〇让13和1^81^等人，分子生物学杂志〇.]\1〇1. Biol.) 196, 901 (1987))。"构架"或"FR"残基是除了此处所定义的高变区残基之外的那些 可变区残基。
[0090] 木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段（称为"Fab"片段，每个片 段有单个抗原结合位点）以及一个残余的"Fc"片段（该名称反映了其容易结晶的能力）。 用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab'） 2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交 联。
[0091] "Fv"是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价地紧 密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个高变 区相互作用，在V H-'二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个高变区共同地赋予抗体抗原 结合特异性。然而，即使是单个可变区（或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性的三个高 变区）也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。
[0092] Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区（CH1)。Fab'片段与Fab片 段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基（包括来自铰链区的一个或多个半 胱氨酸）。Fab'-SH在本文表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab'。？( &13'）2抗 体片段最初是以Fab'片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学 偶联方式也是已知的。
[0093] 脊椎动物抗体（免疫球蛋白）的"轻链"，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显 不同的两类（称为kappa( κ )和lambda( λ ))中的一类。
[0094] 根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类 免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类（同种型），如IgG-l、 IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-l和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、 δ、ε、Υ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
[0095] 术语"抗体"被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体（包括全长的单克隆 抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（包括双特异性抗体）、以及抗体片段，只要它们表现出 所需的生物活性即可。
[0096] "抗体片段"包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；二体（diabody);线性抗体；单链抗体分 子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0097] 本文所用的术语"单克隆抗体"指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体 中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高 特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的（多克隆）抗体制剂（它通常是包括 针对不同的决定簇（表位）的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决 定簇。修饰语"单克隆"表示了抗体的特性-即从基本均一的抗体群中获得的，而不应 被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交 瘤方法（由Kohler等，Nature, 256:495(1975)首先提出）制得，或可用重组DNA方 法（例如参见美国专利No. 4, 816, 567)制得。"单克隆抗体"还可利用例如Clackson 等人，自然（Nature) 352:624-628 (1991)和Marks等人，分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。
[0098] 单克隆抗体在此特别包括"嵌合"抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链的一 部分与某一特定物种的抗体对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链 的其余部分则与另一物种的抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类， 以及这种抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可（美国专利No. 4, 816, 567和 Morrison 等人，美国科学院院报 81 :6851-6855 (1984))。
[0099] "人源化"形式的非人（如鼠）抗体是嵌合的抗体，它们含有非人免疫球蛋白的最 小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白（受者抗体），其中受者高变 区残基被非人源（供者抗体）（例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人灵 长动物抗体）的高变区残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区（FR)残基可被 对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于供体 抗体的残基。这些修饰能进一步提高抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的 (至少一个、通常两个）可变区，其中所有或基本上所有的高变区区对应于非人免疫球蛋白 的高变区区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还包 括免疫球蛋白（通常是人免疫球蛋白）恒定区（Fc)的至少一部分。更详细的情况可参见 Jones 等人，Nature, 321:522-525 (1986) ;Reichmann 等人，Nature, 332:323-329 (1988); 和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol.，2:593-596 (1992)。
[0100] "单链Fv"或"sFv"抗体片段包含存在于单条多肽链内的抗体VH和八区。一般 说来，Fv多肽还包含位于V H和 '区之间的多肽接头，使得sFv形成适合抗原结合所需的 结构。有关sFv的综述，可参见Pluckthum的"单克隆抗体的的药物学"（Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编，Spring-Verlag, New York, ρρ· 269-315(1994)。
[0101] "二体（diabody) "指有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽 链（vH-\)内与轻链可变区（')连接的重链可变区（V H)。通过使用短至使同一链内两功能 区无法配对的接头，功能区被迫与另一链的互补区配对，由此形成两个抗体结合位点。例如 欧洲专利 404, 097 ;W093/11161 ;和 Hollinger 等在美国科学院院报 90:6444-6448 (1993) 中对二体有更为全面的论述。
[0102] 术语"线性抗体"在本申请中指Zapata等人，蛋白质工程（Protein Eng.) 8 (10) : 1057-1062 (1995)中所述的抗体。简而言之，这些抗体包括一对串联的Fd片段 (VH-CH1-V H-CH1)，它们构成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
[0103] "变异的"抗-VEGF抗体指与因在亲代抗体序列中插入、缺失和/或取代一个或多 个氨基酸残基而在氨基酸序列上与"亲代"抗-VEGF抗体氨基酸序列有所不同的分子。在优 选例中，变异抗体包含位于亲代抗体的一个或多个高变区中的一个或多个氨基酸取代。例 如，变异抗体在亲代抗体的一个或多个高变区中可含有至少一个（例如1-10个，较佳地2-5 个）取代。通常，变异抗体的氨基酸序列与亲代抗体的重链或轻链可变区序列（如SEQ ID NO: 7或8)有至少75 %，较佳地至少80 %，更佳地至少85 %，更好地至少90 %，最佳地至少 95%的氨基酸序列相同。关于序列的相同性或同源度，在本文是将序列排列对齐并引入空 隙（如果需要）从而达到最大的序列相同百分比之后，用候选序列中与亲代抗体残基相同 的氨基酸残基百分比表示。抗体序列的N末端、C末端、或内部延伸区、缺失或插入都不认 为会影响序列相同性或同源度。变异抗体保留结合人VEGF的能力，并且较佳地具有优于亲 代抗体的特性。例如，变异抗体具有更强的结合亲和力，更强的抑制VEGF诱导型内皮细胞 增殖的能力和/或更高的在体内抑制VEGF诱导型血管生成的能力。为了分析这些特性，人 们可例如将Fab形式的变异抗体与Fab形式的亲代抗体比较，或将全长形式的变异抗体与 全长形式的亲代抗体比较，因为已发现抗-VEGF抗体的形式影响其在此处公开的生物活性 测定中的活性。此处特别感兴趣的变异抗体是与亲代抗体相比生物活性高至少约10倍，较 佳地至少约20倍，更佳地至少约50倍的抗体。
[0104] "亲代"抗体在此是具有用于制备变异抗体的氨基酸序列的抗体。较佳地，亲代抗 体具有人构架区，而且具有人抗体恒定区（如果存在）。例如，亲代抗体可以是人源化抗体 或人抗体。
[0105] "分离的"抗体是经鉴定的和分离和/或回收自其天然环境组份的抗体。其天然环 境中的污染组份是指会干扰所述抗体的诊断或治疗性用途的物质，可包括酶、激素和其它 蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体纯化至（1)经Lowry法测定，按重量 计抗体纯度高于95%，最好高于99%，（2)其纯度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15 个N末端残基或内部氨基酸序列，或者（3)用Coomassie蓝或最好用银染色法，经还原或非 还原条件下SDS-PAGE测定时达到均质。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因 为该抗体天然环境的至少一种组份是不存在的。但是，通常，分离的抗体是经至少一步纯化 步骤制备的。
[0106] 术语"表位标记的"在此表示抗-VEGF抗体被融合于"表位标记"。表位标记 (印itope tag)应具有足够的残基来形成可产生其对应抗体所需的表位，但又短到不 至于影响VEGF抗体的活性。表位标记宜具有相当的独特性，以致针对其的抗体基本上 不与其它表位交叉反应。适宜的标记多肽一般具有至少6个氨基酸残基，一般介于约 8至50个氨基酸残基（以约9至30个残基为宜）。例子包括flu HA标记多肽及其抗 体 12CA5 (Field 等人，分子细胞生物学（Mol. Cell. Biol.)这:2159-2165 (1988)) ;c-myc 标记及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等人，分子细胞生物学（11〇1.〇611· Biol. )3(12) :3610-3616(1985);和单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体（Paborsky 等，Protein Engineering 2(6) :547-553(1990))。在某些例子中，表位标记是"补救受体结 合表位"。如本文所用，术语"补救受体结合表位"指IgG分子（如IgGpIgGylgQ或IgG 4) 的Fc区的表位，它负责提高IgG分子在体内血清半衰期。
[0107] 术语"细胞毒剂"在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术 语包括放射性同位素（例如1 131、1125、￥9°、和此186)、化疗剂和毒素（例如来自细菌、真菌、植 物或动物的酶活毒素或其片段）。
[0108] "化疗剂"是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素（Adriamycin)、 阿霉素（Doxorubicin)、5_氟尿啼陡、阿糖胞苷（"Ara-C"）、环磷酰胺、塞替派、白消胺、 Taxotere (docetaxel)、细胞毒素、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵钼、美法仑、长春碱、博来 霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素 C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡钼、替尼泊 甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素 D、丝裂霉素、EsperamicinS(参见美国专利 4, 675, 187)、美法仑以及其它相关的氮芥。
[0109] 术语"前药（prodrug)"在此指药学活性物质的前体或衍生形式，其对肿瘤细 胞的细胞毒性低于亲代药物，并且能够被酶激活或转化成较高活性的亲代形式。参见 Wilman, "癌症化疗中的前药"（"Prodrugs in Cancer Chemotherapy"），生物化学协会学 报（Biochemical Society Transaction) 14, ρρ· 375-382，第 615 次会议，Belfast (1986) 和Stella等人，"前药：定祀药物释放的化学方法"（"Prodrug:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery"），受控药物释放（Directed Drug Delivery)，Borchardt 等编， pp. 247-267, Humana Press (1985)。本发明的前药包括（但不限于）：含磷酸盐的前药、含硫 代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、经D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、 含β内酰胺的前药、任选地取代的苯氧基乙酰胺的前药或任选地取代的苯乙酰胺的前药、 5_氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药，它们可以被转化为细胞毒性更高的游离药物。可以衍 生成为本发明所用前药形式的细胞毒性药物的例子，包括（但不限于）前文所述的化疗剂。 [0110] 词语"标记"在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身 可以被检测到（例如放射性同位素标记或荧光标记），或者，如果是酶标记，它们可催化化 合物或组合物底物发生可检测的化学转变。
[0111] "固相"指本发明抗体可吸附于其上的非液态基质。固相的例子在此包括：部分或 完全由玻璃（例如可控多孔玻璃）、多糖（例如琼脂糖）、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇 和硅氧烷构成的固相。在某些实施方案中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其 它实施方案中，可能是纯化柱（例如亲和色谱柱）。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续 固相，如美国专利No. 4, 275, 149中所述的。
[0112] "脂质体"是由各种脂类、磷脂和/或表面活性剂构成的，通常被用来向哺乳动物传 递药物（例如本文所述的抗VEGF抗体和任选的化疗剂）的小囊泡。脂质体的组份通常排 列成双层结构，与生物膜的脂排列类似。
[0113] "分离的"核酸分子是经鉴定的，并且与通常与之相伴存在于该抗体核酸天然来源 中的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不是其天然形式或处于其天 然环境中。所以，分离的核酸分子与存在于天然细胞内的核酸分子在形式上是不同的。但 是，分尚的核酸分子包括正常表达抗体的细胞内所含的核酸分子，例如，该核酸分子可以位 于不同于天然细胞内的某个染色体位置上。
[0114] 术语"调控序列"指在特定的宿主微生物内表达与之可操作性连接的编码序列所 必需的DNA序列。例如，适合原核细胞的调控序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体 结合位点。已知，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和加强子。
[0115] 当与另外的核酸序列形成功能关联的时，核酸是"操作性相连的"。例如，前序列 (presequense)或分泌性前导序列的DNA是与多肽的DNA操作性相连的，如果它被表达成参 与多肽分泌的前蛋白原（preprotein);启动子或增强子是与编码序列操作性相连的，如果 它影响序列的转录；或者，核糖体结合位点是与编码序列操作性相连的，如果它的位置能够 促进翻译。通常，"操作性相连"指相连的DNA序列是毗邻的，而在分泌性前导序列情况下， 是毗邻的并处于同一阅读框下。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连 接来实现相连。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接 头。
[0116] 在本文中，"细胞""细胞系"和"细胞培养物"是互换使用的，而且所有这些名称都 包括子代。所以，词语"转化体"和"转化细胞"包括原代细胞及其衍生的培养物（不论传 代多少次）。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上并不精确相同。 它包括了筛选出的，具有与原始转化细胞相同功能或生物活性的突变型子代。当采用不同 的命名时，可以从上下文中明显看出。
[0117] II.发明的实施方式
[0118] 下面的实施例描述了人源化和变异的抗-VEGF抗体的产生方法，这些抗体从治疗 角度看具有有益的特性，其中包括：（a)与VEGF的强结合亲和力；(b)在体外抑制VEGF-诱 导型内皮细胞增殖的能力；和（c)在体内抑制VEGF-诱导型血管生成的能力。
[0119] 抗体的亲和力如下面的实施例所述进行测定。优选的人源化或变异的抗体是那些 与人VEGF结合时K d值不超过约1 X 1(Γ7Μ，较佳地不超过1 X 1(Γ8Μ，最佳地不超过约5 X 1(Γ9Μ 的抗体。
[0120] 除了与人VEGF具有强结合亲和力的抗体之外，还需要选择具有其他有利的治疗 特性的人源化或变异的抗体。例如，抗体可以是能抑制对VEGF应答而导致的内皮细胞生 长的抗体。在一个实施例中，抗体能够抑制牛毛细血管内皮细胞对几乎最大有效浓度的 VEGF (3ng/ml)应答时的增殖。较佳地，对于在该"内皮细胞生长测定"中抑制VEGF诱导型 的内皮细胞生长，抗体的有效剂量50 (ED50)不超过约5nM，较佳地不超过InM，最佳地不超 过0.5nM，即在这些浓度下抗体能够在体外抑制50 % VEGF诱导型内皮细胞生长。一种优 选的"内皮细胞生长测定"包括：基本上如实施例1所述，将衍生自牛肾上腺皮质的毛细血 管内皮细胞，在补充有10%牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco氏改良的 Eagle培养基（DMEM) (GIBC0)(生长培养基）中培养。这些内皮细胞，以6X 103细胞/孔 的密度接种于6孔板中的生长培养基中。以l-5000ng/ml之间的浓度加入亲代抗-VEGF抗 体（对照）、人源化的或变异的抗-VEGF抗体。在2-3小时后，加入纯化的VEGF至终浓度 为3ng/ml。对于特异性对照，将每种抗体以5000ng/ml的浓度加至内皮细胞，或者单独加 入，或者在有2ng/ml bFGF下加入。在5或6天之后，通过暴露于胰蛋白酶而使细胞解离， 并在Coulter计数器（Coulter Electronics, Hialeah, FL)上计数。用四参数曲线拟合程 序（KaleidaGraph)分析数据。
[0121] 优选的人源化或变异的抗-VEGF抗体还可以是具有体内抑制肿瘤活性的抗体。 例如，该抗体可抑制人A673成横纹肌细胞瘤细胞或乳房癌MDA-MB-435细胞在裸鼠中的 生长。对于体内肿瘤研究，如实施例1所述将A673成横纹肌细胞瘤细胞（ATCC;CRL1598) 或MDA-MB-435细胞（可从ATCC获得）在补充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的 DMEM/F12培养基中培养。将2X 106肿瘤细胞（体积200微升）皮下注入6-10周龄雌性 BLAB/c裸鼠的背部。然后，在该测试中用人源化或变异的抗体以及无活性的对照抗体来处 理动物。人源化或变异的抗-VEGF单克隆抗体的剂量是0. 5或5mg/kg。在肿瘤细胞接种开 始后24小时，将每种单克隆抗体以100微升体积进行腹膜内注射，每周两次。每周确定肿 瘤大小。在注射肿瘤细胞4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并称量。用AN0VA进行统 计分析。较佳地，在这种"体内肿瘤测定"中5mg/kg剂量的抗体可抑制约50-100%，较佳地 约70-100%，最佳地约80-100%人A673肿瘤细胞的生长。
[0122] 在优选例中，在将治疗有效量的抗体施用于病人时，人源化或变异的抗体不会引 发免疫应答。如果引发了免疫应答，则该应答较佳地仍使抗体能够给被治疗的病人带来治 疗好处。
[0123] 人源化的或变异的抗体还宜能够抑制人体中VEGF诱导型血管生成，例如，抑制人 肿瘤生长和/或抑制视网膜疾病中眼内的血管生成。
[0124] 优选的抗体与本文所述的"表位A4. 6. 1"结合。为了筛选能结合于被感兴趣抗体结 合的人VEGF表位的抗体（如阻断A4. 6. 1抗体与人VEGF结合的抗体），可以进行常规的交叉 阻断测定，例如在Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane (1988)中所述的方法。或者，可进行表位定位（例如用Champe等人， 生物化学杂志（J. Biol. Chem. )270:1388-1394 (1995)中所述的方法），以确定抗体是否结 合于有关的表位。
[0125] 本文优选例的抗体具有一重链可变区，它包括由下式表示的氨基酸序列：FR1_CDR H1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4,其中，"FR1-4"表示 4 个构架区，而"CDRH1-3"表示抗-VEGF 抗体重链可变区的3个高变区。FR1-4可如下面实施例那样衍生自"共有序列"（即一类、亚 类或亚组人免疫球蛋白的重链或轻链中最常见的氨基酸），或者可来自某个人抗体构架区 或来自组合的不同构架区序列。许多人抗体构架区序列被收集在例如Kabat等人（同上） 的文献中。在一个优选例中，可变的重链FR是由如Kabat等人（同上）编纂的人免疫球蛋 白的共有序列所提供。较佳地，人免疫球蛋白亚组是人重链亚组ΠΙ (如SEQ ID N0:11)。
[0126] 人可变的重链FR序列宜在其中具有取代，例如人FR残基被相应的非人残基取代 (非人残基指当人和非人的序列被排列对齐时，与有关的残基具有相同Kabat位置编号的 非人残基），但是不一定必须用非人残基进行取代。例如，除了相应的非人残基之外的FR 残基替换，可以用噬菌体展示法进行选择（参见下面的实施例2)。可以被取代的代表性可 变重链FR残基包括任何一个或多个下列编号的FR残基：37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、 76H、78H、94H (此处采用Kabat的残基编号法）。较佳地，这些残基中有至少2个，或至少3 个或至少4个被取代。一种优选的FR取代组合是：49H、69H、71H、73H、76H、78H和94H。
[0127] 对于重链高变区，较佳地具有如下氨基酸序列：
[0128] CDRH1
[0129] GYXJAXJGXsMSEQ ID N0:117)，其中父1是0、1'或 E，但较佳地是 D 或 丁义是？、 W、或Y，但较佳地是F ;X3是T、Q、G或S，但较佳地是T ;X4是Η或N ;而且X5是Μ或I，但较 佳地是Μ。
[0130] CDRH2
[0131] WINTXJGEPTYAADFKR(SEQ ID Ν0:118)，其中 Xi 是 Υ 或 W，但较佳地是 Υ。
[0132] CDRH3
[0133] YPXJXJAXgHWYFDVCSEQ ID N0:119)，其中父丨是!!或 ￥;父2是丫、1?、1(、1、1'4、或1， 但较佳地是Y ;x3是G、N、A、D、Q、E、T、K、或S，但较佳地是G ;X4是S、T、K、Q、N、R、A、E、或 G，但较佳地是S或T ;而且X5是S或G，但较佳地是S。
[0134] 重链可变区可任选地包括FR3中的、在此处被命名为"⑶R7"的序列（参见图9B 和10B)，其中⑶R7可具有如下氨基酸序列：
[0135] CDR7
[0136] Χ#Χ2ΟΧ3Χ4Χ5Χ6ΤΧ7(5Ε〇 ID N0:120)，其中 X!是 F、I、V、L 或 A，但较佳地是 F ;X2 是 A、L、V或I，但较佳地是L ;&是1\￥或K，但较佳地是T ;\是3或W，但较佳地是S ;&是3 或K，但较佳地是K ;X6是N或S，但较佳地是S ;而X7是V、A、L或I，但较佳地是A。
[0137] 本文优选例的抗体具有一轻链可变区，它包括由下式表示的氨基酸序列：FR1_CDR L1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4,其中，"FR1-4"表示 4 个构架区，而"CDRL1-3"表示抗-VEGF 抗体轻链可变区的3个高变区。FR1-4可如下面实施例那样衍生自"共有序列"（即一类、 亚类或亚组人免疫球蛋白的重链或轻链中最常见的氨基酸），或者可来自某个人抗体构架 区或来自组合的不同构架区序列。在一个优选例中，可变的轻链FR是由如Kabat等人（同 上）编纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。较佳地，人免疫球蛋白亚组是人κ轻链亚组 1(如 SEQ ID N0:12)。
[0138] 人可变的轻链FR序列宜在其中具有取代，例如人FR残基被相应的小鼠残基取代， 但是不一定必须用非人残基进行取代。例如，除了相应的非人残基之外的FR残基替换，可 以用噬菌体展示法进行选择（参见下面的实施例2)。可以被取代的代表性可变轻链FR残 基包括任何一个或多个下列编号的FR残基：4L、46L和71L(此处采用Kabat的残基编号 法）。较佳地，仅46L被取代。在另一实例中，4L和46L被取代。
[0139] 对于⑶R，较佳地具有如下氨基酸序列：
[0140] CDRL1
[0141] X1AX2X3X4X5SNYLN(SEQIDN0 :121)，其中X1是R或S，但较佳地是S;X2是S或N，但 较佳地是S ;X3是Q或E，但较佳地是Q ;X4是Q或D，但较佳地是D ;而且X5是I或L，但较佳 地是I。
[0142] CDRL2
[0143] FTSSLHS(SEQ ID NO: 122)
[0144] CDRL3
[0145] QQYSXAPWI^SEQ ID勵：123)，其中乂1是1\4或1但较佳地是1';而且乂2是￥或 T，但较佳地是V。
[0146] 优选的人源化抗-VEGF抗体是那些具有实施例1中F(ab)_12的重链和/或轻链 可变区序列的抗体及其变异体，例如亲和性成熟形式的变异抗体，其中包括实施例3中的 变异抗体Y0317、Y0313-1和Y0238-3,并且Y0317是优选的变异抗体。产生感兴趣的人源 化抗-VEGF抗体的方法，将在下面详细描述。
[0147] A.制备抗体
[0148] 在下面实施例中描述了使非人VEGF抗体人源化以及产生抗-VEGF抗体变异体的 方法。为了使抗-VEGF抗体抗体人源化，制备非人的抗体原料。当需要产生变异抗体时，可 制备亲代抗体。在下一节中将描述产生这种非人的抗体原料和亲代抗体的代表性技术。
[0149] (i)制备抗原
[0150] 用于产生抗体的VEGF抗原可以是例如完整的VEGF或VEGF片段（如含"A4.6. 1 表位"的VEGF片段）。可用于产生抗体的其他形式的VEGF，对于本领域技术人员而 言是显而易见的。用于产生抗体的VEGF抗原宜是人VEGF，例如在Leung等人，科学 (Science) 246:1306 (1989)和 Houck 等人，Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)所述的。
[0151] (ii)多克隆抗体
[0152] 多克隆抗体宜通过多次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内 生成的。可以用例如马来酰亚氨苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯（通过半胱氨酸残基偶联）、N-羟 基琥珀酰亚胺（通过赖氨酸残基）、戊二醛、琥珀酸酐、S0C1 2或= C = NR(其中的R和 R1是不同的烷基）的双官能剂或衍生剂，将有关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋 白质进行偶联，后者包括例如：匙孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰 蛋白酶抑制物。
[0153] 用抗原、免疫偶联物或衍生物免疫动物，例如将100微克或5微克（分别适合兔或 小鼠）蛋白质或偶联物与3倍体积Freund完全佐剂混合后，在多处皮内注射该溶液。一个 月后，通过多处皮下注射1/5至1/10最初剂量的肽或偶联物和Freund完全佐剂，对动物进 行加强免疫。7至14天后，对动物放血，分析血清的抗体效价。对动物的加强免疫进行至 效价稳定为止。较好的是，用相同抗原但与不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联而成的 偶联物进行加强免疫。偶联物还可以在重组细胞内以融合蛋白的形式制备。而且，凝聚剂 (例如明矾）适合用来加强免疫应答。
[0154] (iii)单克隆抗体
[0155] 单克隆抗体可以用Kohler等人，自然256 :495(1975)首次公开的杂交瘤方法制 得，或者利用重组DNA方法制得（美国专利4, 816, 567)。
[0156] 在杂交瘤方法中，鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，如前文所述接受免 疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免 疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂（例如聚乙二醇）将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成 杂交瘤细胞（Goding,单克隆抗体：理论与实践（Monoclonal Antibodies:Principles and Practic), pp.59-103(Academic Press,1986))〇
[0157] 将如此制得的杂交瘤细胞接种并培养在合适的培养基中，培养基中最好含有一种 或多种抑制非融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基中一般含有次黄嘌呤、氨 基蝶呤和胸苷这些抑制HGPRT缺陷型细胞生长的物质（HAT培养基）。
[0158] 优选的骨髓瘤细胞是那些融合效率高、支持选定的抗体生产细胞稳定且高水平地 生产抗体、而且对诸如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞 系，例如来自 M0PC-21 和 M.C.-11 鼠肿瘤的（可以从 Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA 获得），和 SP-2 或X63-Ag8-653 细胞（可由美国典型培 养物保藏中心，Rockville, Maryland USA获得）。也有用人骨髓瘤细胞和人-鼠异源骨髓瘤 细胞系来生产人单克隆抗体的（Kozbor,免疫杂志（J. Immunol. ) 133:3001 (1984) ;Brodeur 等，单克隆抗体的生产技术和应用（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications), pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc.，New York, 1987)〇
[0159] 对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。 较好的是，用免疫沉淀法或例如放射免疫分析（RIA)或酶联免疫吸附分析（ELISA)的体外 结合分析法，来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
[0160] 例如，单克隆抗体的结合亲和性可以利用Scatchard分析（Munson等，生物化学年 刊（Anal. Biochem. ) 107:220(1980))来测定。
[0161] 在杂交瘤细胞经鉴定生产了具有所要求的特异性、亲和性和/或活性的抗体后， 可以利用有限稀释程序将克隆亚克隆化，并利用标准方法培养（Goding，单克隆抗体：理论 与实践（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice) pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。就此目的而言，合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养液。此外，杂交瘤 细胞可以以腹水瘤的形式在动物体内生长。
[0162] 利用常规免疫球蛋白纯化技术，例如A蛋白-琼脂糖柱（protein A-Sepharose)、 羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和性色谱，可从培养液、腹水液或血清中合适地分离 出由亚克隆分泌的单克隆抗体。
[0163] 使用常规方法，可以方便地分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序（例如，利用 能与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）。杂交瘤细胞是所 述DNA的优选来源。一旦被分离，可以将DNA置于表达载体中，表达载体然后被转染到例如 大肠杆菌细胞、猿C0S细胞、中国仓鼠卵巢（CH0)细胞或杂交瘤细胞等原本并不产生免疫球 蛋白的宿主细胞内，从而在重组宿主细胞内获得生成的单克隆抗体。下面更详细地描述抗 体的重组产生法。
[0164] (iv)人源化和氨基酸序列变异体
[0165] 下面的实施例1-2描述了使抗-VEGF抗体人源化的程序。在某些例子中，可能需 要产生这些人源化抗体的氨基酸序列变异体，尤其是在需要提高人源化抗体的结合亲和力 或其他生物特性的场合。实施例3描述了产生具有比亲代抗体更高亲和力的抗-VEGF抗体 的氨基酸序列变异体的方法。
[0166] 抗-VEGF抗体的氨基酸序列变异体可这样制备：将合适的核苷酸变化引入 抗-VEGF抗体的DNA，或通过肽合成。这样的变异抗体包括例如，在此处实施例的抗-VEGF 抗体的氨基酸序列中有氨基酸残基缺失、和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代 的任何组合，以制备最终的构建物，只要该最终构建物具有所需的特性。氨基酸改变也可改 变人源化或变异的抗-VEGF抗体的翻译后加工过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
[0167] 一种有用的、确定抗-VEGF抗体中那些残基或区域是适合诱变的优选位置的方 法，是 Cunningham 和 Wells,科学（Science) ,244:1081-1085 (1989)中描述的"丙氛酸扫 描诱变"。在该方法中，确定一个或一组祀残基（如带电荷的残基如arg、asp、his、lys和 glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸（最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸）加以替换，以影响氨基 酸与VEGF的相互作用。那些在功能上表现出对替换敏感的氨基酸位置，再通过在置换位点 处引入进一步的或其他的突变而进行结构的精细研究。这样，尽管引入氨基酸序列变异的 位点被预先确定，但是突变本身的性质不必被预先确定。例如，为了优化给定位点处突变的 性能，可以对靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，然后筛选表达的抗-VEGF抗体 变异体是否有所需活性。丙氨酸扫描诱变在实施例3中描述。
[0168] 氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的融合，长度为一个残基至含100个或 更多残基的多肽，还包括在序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括：具有 N端甲硫氨酸残基的抗-VEGF抗体，或融合于表位标记的抗体。抗-VEGF抗体分子的其他插 入变异体包括：将抗-VEGF抗体的N端或C端融合于会导致抗体血清半衰期更长的酶或多 肽（见下面）。
[0169] 另一种变异体是氨基酸置换变异体。这些变异体在抗-VEGF抗体分子中至少有一 个氨基酸残基被除去并在其位置上插入不同的残基。置换诱变最感兴趣的位置包括高变 区，但FR改变也在范围之中。保守性置换示于表1，标题是"优选的置换"。如果这种置换 导致生物活性的改变，那么可引入更接近的变化即表1中指出的"代表性置换"、或进一步 按下面氨基酸类型引入置换，然后筛选产物。
[0170] 表 1
[0171]
【权利要求】
1. 一种人源化抗-VEGF抗体，它在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的ED50值不超 过约5nM。
2. -种人源化抗-VEGF抗体，它在体内抑制VEGF-诱导型血管生成。
3. 如权利要求2所述的人源化抗-VEGF抗体，5毫克/千克的该抗体在A673体内肿瘤 模型中抑制至少50%肿瘤生长。
4. 如权利要求1-3任一项所述的人源化抗-VEGF抗体，其中该人源化抗-VEGF抗体包 含具有氨基酸序列 GYDFTHYGMN(SEQ ID NO:126)的 CDRH1。
5. 如权利要求1-3任一项所述的人源化抗-VEGF抗体，其中该人源化抗-VEGF抗体包 含具有氨基酸序列 YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO:127)的 CDRH3。
6. 如权利要求1-5任一项所述的人源化抗-VEGF抗体，具有重链可变区，该重链可变 区包括具有如下氨基酸序列的高变区：序列GYXfTXJGMN所示的⑶RH1，其中Xi是D，X 2是 H ;WINTYTGEPTYAADFKR 所示的 CDRH2 ;以及序列 YPXJYGXjHWYFDV 所示的 CDRH3,其中 Xi 是 Y，XjT。
7. 如权利要求6所述的人源化抗-VEGF抗体，它包括含有氨基酸序列SEQ ID NO: 116 的重链可变区。
8. 如权利要求1-5任一项所述的人源化抗-VEGF抗体，具有轻链可变区，该轻链可变区 包括具有如下氨基酸序列的高变区：CDRL1 (SASQDISNYLN ;SEQ ID N0:4)，CDRL2 (FTSSLHS ; SEQ ID N0:5)and CDRL3(QQYSTVPWT;SEQ ID N0:6)。
9. 如权利要求8所述的人源化抗-VEGF抗体，它包括含有氨基酸序列SEQ ID NO: 115 的轻链可变区。
10. 如权利要求1-9任一项所述的人源化抗-VEGF抗体，它包括含有氨基酸序列SEQ ID NO: 116的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO: 115的轻链可变区。
【文档编号】C07K16/22GK104231078SQ201410411945
【公开日】2014年12月24日 申请日期:1998年4月3日 优先权日:1997年4月7日
【发明者】M.巴卡, J.A.韦尔斯, L.G.普雷塔, H.B.洛曼, Y.M.Y.陈 申请人:基因技术股份有限公司