一对特异识别绵羊krt25基因的多肽及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一对特异识别绵羊KRT25基因的多肽及其编码基因和应用。该多肽由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；所述多肽乙由15个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊KRT25基因进行敲除或修饰，以解析绵羊KRT25基因的功能、构建绵羊KRT25基因突变库或获得相关疾病模型，为绵羊育种及医药研发服务。
【专利说明】-对特异识别绵羊KRT25基因的多肽及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，涉及一对特异识别绵羊KRT25基因的多肽及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 角蛋白是毛囊和皮肤生物学功能重要的决定因子之一，在一定程度上决定羊毛的 品质和产量。内根鞘角蛋白基因一般分为酸性的I型角蛋白基因（KRT25, KRT26, KRT27， KRT28)和呈中性或碱性的II型角蛋白基因（KRT71，KRT72, KRT73, KRT74)，它们都在毛囊 内根鞘特异性表达。所编码的蛋白质参与毛囊的形态发生过程。R〇gers(2004)研究证明 I 型内根鞘角蛋白基因 （Rogers GE. Hair follicle differentiation and regulation. International Journal of Developmental Biology, 2004, 48:163-170)在羊的内根鞘中 特异性表达。由此可见，KRT25基因可作为绵羊抗病育种及羊毛细度育种的一个重要候选 基因。在细胞或个体水平上对绵羊KRT25基因进行敲除或修饰，可解析绵羊KRT25基因的 功能，为绵羊育种及医药研发服务。
[0003] 转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技术是一个高效的基因打靶新工具。转录因子激活效应物家族中有一 种蛋白（TALEs)能够识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34 个恒定氨基酸序列介导。将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALENs，从而 可以实现对基因组DNA序列的精确修饰。TALENs是一种异源二聚体分子（两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域），能够切割两个相隔较近的序列，从而使得 特异性增强。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一对特异识别绵羊KRT25基因的多肽及其编码基因和应用。 本发明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子（TALE)能够特异性地 识别绵羊KRT25基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活 子样效应因子核酸酶（TALENs)，能够对绵羊KRT25基因进行准确、高效地靶向修饰。
[0005] 具体地，本发明的目的是这样实现的：
[0006] -对特异识别绵羊KRT25基因的多肽（命名为特异多肽对），由多肽甲和多肽乙组 成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨 基酸；所述多肽乙由15个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连 氨基酸；
[0007] 所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位 氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第 148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251 位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸 残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第 488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基。
[0008] 所述多肽乙中的15个双连氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位 氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第 148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251 位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸 残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基和第 488-489位氨基酸残基。
[0009] 所述多肽甲具体可如序列表的序列2所示。
[0010] 所述多肽乙具体可如序列表的序列4所示。
[0011] 本发明还保护一对DNA分子（命名为特异DNA分子对），由编码所述多肽甲的DNA 分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。
[0012] 所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷 酸和第1564-1569位核苷酸。
[0013] 所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的15个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核 苷酸。
[0014] 所述DNA分子甲具体可如序列表的序列1所示。
[0015] 所述DNA分子乙具体可如序列表的序列3所示。
[0016] 本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰绵羊KRT25基因中的应用。 所述绵羊KRT25基因，其NCBI GI为57619200。
[0017] 本发明还保护所述特异多肽对在构建绵羊KRT25基因突变库中的应用。所述绵羊 KRT25 基因，其 NCBI GI 为 57619200。
[0018] 与现有技术相比，本发明提供了特异识别绵羊KRT25基因的多肽对，并提供了该 多肽对的编码基因。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊KRT25基因进行敲除或修 饰，以解析绵羊KRT25基因的功能、构建绵羊KRT25基因突变库或获得相关疾病模型，为绵 羊育种及医药研发服务。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为TALENs祀点设计结果示意图。
[0020] 图2为TALEN质粒对（左臂TALEN和右臂TALEN)转染绵羊SEF细胞72小时后提 取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果（突变序列）。
[0021] 图3为TALEN质粒对的工作原理示意图。
【具体实施方式】
[0022] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。
[0023] FastTALE? TALEN快速构建试剂盒：上海斯丹赛生物技术有限公司，Cat No. 1802-030。该试剂盒包含两个模块板：模块板1包含96个模块，每个模块识别连续的两 个碱基；模块板2包含76个模块，其中48个模块识别连续的两个碱基，28个模块识别单个 碱基。另外，该试剂盒还包括其他组分：溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、感受态细胞、 S0C培养基、ddH20 ;TALEN骨架载体，包括左臂骨架和右臂骨架。
[0024] 实施例1、TALENs质粒对的构建
[0025] 1、TALENs 靶点设计
[0026] 米用在线软件(https://tale-nt. cac. Cornell, edu)设计。将绵羊 KRT25 基 因 cDNA序列（NCBI GI为57619200)输入软件中，在130-177bp区域找到靶序列，具体示 意图如图1所示。TALENs左臂识别序列是5 ' -TGCAGCATGCCTGGAA-3 '，右臂识别序列是 5, -GCTCCCAAAGGCACA-3，。
[0027] 2、TALENs 模块组装
[0028] 依照FastTALE? TALEN快速构建试剂盒（以下简称"试剂盒"）说明书进行。具体 步骤如下：
[0029] 1)将左右臂识别序列分别拆分为9个模块，以一个或两个碱基组合为一个模块， 依次进行标记，如首个标记为1，最后一个标记为9,如下所示：
[0030] 左臂 L5:T1 GC2 A3 GC4 AT5 GC6 CT7 GG8 AA9(使用骨架载体 L15)
[0031] 右臂 R5:G1 C2 TC3 CC4 AA5 AG6 GC7 CA8 CA9(使用骨架载体 R11)
[0032] 2)从试剂盒中取出相应编号的9个模块，每个模块取1. 5微升，并将其加入同一个 PCR管中。
[0033] 3)将溶液1、溶液2从-20°C冰箱取出置于冰盒上，溶液3放置于37°C水浴锅中溶 解。
[0034] 4)按如下体系加样，先加入相应的TALEN骨架载体（L16或R12)，然后将溶液3、溶 液1、溶液2依次加入步骤2的PCR管中，最后加水补至20微升，短暂离心混匀。
[0035] 连接体系：
[0036]
【权利要求】
1. 一对特异识别绵羊KRT25基因的多肽，由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个 TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；所述多肽乙由15 个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸； 所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位氨 基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第 148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251 位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸 残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第 488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基； 所述多肽乙中的15个双连氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位氨 基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第 148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251 位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸 残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基和第 488-489位氨基酸残基。
2. 如权利要求1所述的一对特异识别绵羊KRT25基因的多肽，其特征在于：所述多肽 甲的氨基酸序列如序列表中的序列2所示；所述多肽乙的氨基酸序列如序列表中的序列4 所示。
3. -对DNA分子，由编码权利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和编码权利要求1 中的所述多肽乙的DNA分子乙组成。
4. 如权利要求3所述的一对DNA分子，其特征在于： 所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第 1564-1569位核苷酸； 所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的15个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核苷酸。
5. 如权利要求4所述的一对DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲的核苷酸序列如 序列表中的序列1所示，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
6. 权利要求1所述的一对多肽在特异识别和靶向修饰绵羊KRT25基因中的应用。
7. 权利要求1所述的一对多肽在构建绵羊KRT25基因突变库中的应用。
【文档编号】C07K14/47GK104250297SQ201410471728
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】柳楠, 李和刚, 赵金山, 刘积凤, 刘开东, 程明, 贺建宁 申请人:青岛农业大学