专利名称：具有抗肿瘤活性的疫苗组合物及其在恶性疾病治疗方面的应用的制作方法
本项发明涉及免疫学的领域，尤其是对自身表皮生长因子(EGF)能够产生自身免疫反应的疫苗组合物。
本项发明的一个重要目标是获得一种疫苗组合物，它能够对EGF依赖性的恶性肿瘤产生主动的免疫治疗，它能够抑制这些肿瘤的增殖，因此，它被用作恶性肿瘤及其它EGF相关疾病的治疗。因此，本项发明也与肿瘤治疗相关。
表皮生长因子，一种能够刺激上皮细胞增殖的多肽，被认为是一种在细胞恶性转化过程中起作用的生长因子，其作用的发挥主要是通过其细胞膜受体。
表皮生长因子(EGF)是一53个氨基酸组成的多肽，其分子量约为6045D(道尔顿)。它首先是从鼠的下颌下腺被分离和纯化(Co-hen S.J.Biol Chem(1962)237，1.555)，其后从人尿液中获得一个相似的分子(Cohen S.人表皮生长因子分离及其化学和生物学特性PNAS USA 72，1975，1317)。
EGF能够在体内外刺激上皮细胞和间质细胞的增殖(CohenS.，Carpenten G.，PN AS USA 72，1317，1975)，对某些乳腺癌细胞系EGF能行使一个特异性的刺激作用(Osborne C.K.etals Can Res.40，2361(1980))。在乳腺分化过程中，EGF的作用，主要是对小叶乳泡系统的发展起作用已经被证实(Tonelli C.J.Nature(1980)285，250-252)。
此种生物调节活性的发挥是通过一种细胞膜受体(EGF-R)来实现的，该受体为一个由1186个氨基酸组成的糖蛋白，分子量约为170KD，其基因已被克隆并且进行了序列分析。此受体的细胞内区域与酪氨酸特异性的蛋白激酶活性相关，此酶和与细胞恶性转化过程有关的癌基因产物v-erb-B具有结构上的同源性(HeldinC.H.Cell 37，9-20(1984))。
EGF和其受体组成一个高度特异性的分子复合体，它们之间的相互作用形成了细胞生长调节的重要机制。
高水平的EGF-R已经在上皮起源的恶性肿瘤中被发现，例如，乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、阴道癌、结肠癌、肺癌，脑癌和食管癌。EGF及其受体在调节肿瘤生长过程中的作用目前尚不清楚，有观点认为，ECF-R在肿瘤细胞中的表达提供了一种自分泌式的生长刺激机制，这种刺激导致了非控制性的增殖(Schlessinger J.，Schreiber A.B.，Levi A.，Liberman T.，Yarden Y.Cnt.Rev.Biochem 1983，14(2)93-111)。
EGF-R在肿瘤细胞中的存在已经被证明是人类乳腺癌预后不良的指标。大约40％的乳腺肿瘤显示有对EGF具有高度亲和力的特异性的结合位点，也有在有与雌激素受体相反的关系，它指示EGF-R作为一种反分化的标记或者恶性细胞增殖潜能的指示器(Perez R.，Pascual M.R.，Macias A.，Lage A.，乳腺癌研究与治疗4，189-193，1984)。
也已经有报道在局部的神经节转移灶中EGF-R的表达要高于原发的乳腺肿瘤组织(Sainsbury J.R.，et al(1985)Lancet1(8，425)，364-366)，并且有报道说，在乳腺肿瘤细胞不同的组织严型之间该受体的表达也存在着不同，这也使得它们的存在是预后不良的一个信号(Macias A.，et al(1986)，AnticancerRes.6849-852)。
先前用Balb-C小鼠的艾化腹水瘤(EAT)模型的研究证明EGF在体内的抑制作用(Lombardero J.，et als Neoplas-ma33，4(1987))，因此，认为此分子作为一个生物反应的调节物是可能的。
早先的研究已经报道，在EGF依赖性的肿瘤细胞膜上存在着EGF的前体分子。该发明的作者报道，一个重要的事实是该分子也是自身抗体作用的靶分子(Patent Application Cuba No.113/93)。来自不同的研究结果显示，EGF/EGF-R系统是治疗作用可能的靶。
应用抗EGF-R的单克隆抗体进行被动免疫治疗，许多研究表明，该受体的抗体的特异性识别抑制了EGF的结合，同时对恶性细胞的促有丝分裂刺激也产生了抑制效应(SATO J.D.，et al.Metliods in Enzymology，Vol 146 pp63-81(1987))。然而，这些鼠源性的抗体通常将产生人抗鼠的抗体反应(HAMA)。
直到本项发明为止，没胡一项能够抑制细胞增殖的主动免疫治疗来治疗EGF依赖性的肿瘤的方案被提出，因为先前的观念一致认为“自身”的分子不将诱导任何免疫反应，因为机体是自我耐受性的。
本项发明提供了一种包含有被连接在一个载体蛋白分子上的自体EGF的疫苗组合物，通过自身免疫效应，该组合物能够抑制EGF依赖性的肿瘤的生长，而不产生那种异源蛋白进入人体所产生的副效应。
这种疫苗组合物可用于EGF依赖性肿瘤或EGF相关的恶性疾病的治疗。
在此说明，在该设计中EGF应该被理解为包含其任意片段或者其衍生物，它们与其原始物具有相似的免疫学特性或者效应。衍生物包括但不仅仅限于常规的氨基酸的替代，氨基酸位点直接的置换以便增加稳定性或者活性和化学的修饰等等。I.免疫原制剂的获得要获得两种制剂。第一种是连接在蛋白载体上的鼠EGF(mu-EGF)，第二种是人重组EGF(hu-rec-EGF)(National Medica-ment Register Office from Cuba，HEBERMIN，No.1266)，它也被连接在一个载体蛋白分子上。
包含有连接在载体蛋白上的hu-rec-EGF的制剂只用在非人的灵长动物和人。同时辅以适应的免疫佐剂。
被连接在蛋白载体上的mu-EGF在小鼠动物模型上使用，以便确定包含自身EGF分子的制剂的免疫原性和抗瘤作用。
结合的hu-EGF载体蛋白的免疫原性研究用灵长动物进行实验，因为hu-EGF与灵长类EGF非常相似，尽管它被认作一个自体分子。允许证实自体分子免疫原反应的结果能够被得出。
制剂准备如下，溶解于PBS/10mM MgCl2中的鼠EGF或者hu-rec-EGF溶液与用同样溶剂溶解的载体蛋白溶液，以1-5摩尔EGF/每摩尔蛋白的比率相混合。
然后再加入0.5％戊二醛，使终浓度为0.1％-0.05％之间。
混合物在室温下温育1-3小时，然后用PBS/MgCl210mM溶液进行透析，至少更换透析液三次。结合物特性鉴定。
结合效率试验和免疫原性保持试验，通过ELISA测定进行。
经PVC(NUNC)活化的ELISA平板用50μl抗载体蛋白的抗血清进行包被，浓度在1-10μg/ml。例如用霍乱毒素B(CTB)作为载体，平板用神经节苷脂GM1进行包被。
接着用PBS/Tween洗三次，然后再用0.5-1％的BSA溶液(溶于PBS/Tween中)封闭，37℃温育30分钟至一小时。然后把待测定的结合物用0.1-0.001的稀释度加到平板上，每孔50μl，37℃温育1-2小时。
接着用1∶500～1∶1000的稀释度加鼠抗hu-rec-EGF抗血清，每孔50μl，37℃温育30分钟至1小时。
最后，用1∶500～1∶1000稀释度加抗鼠碱性磷酸酶抗血清，每孔50μl，37℃温育30分钟至一小时。
用浓度为1mg/ml的对硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)黑色，每孔加50μl，37℃温充30分钟。用ELISA平板读数仪测定405nm波长时的光密度(OD值)。
结果表示分子的活性和结合物的效率，因为结合物保持有对包被平板的分子的识别位点，该分子特异性地识别载体蛋白，同时，结合物又为抗EGF的抗血清所识别。II.包含mu-EGF的制剂的效能特征前临床研究IIa)内源性的EGF的免疫原性小鼠自身免疫性的诱导。
为了证实上述包含mu-EGF的免疫原制剂诱导抗内源性EGF的自身免疫的能力，在Balblc小鼠中进行了分组实验。
各组动物接种不同的剂量，范围在每只小鼠每周注射50-100μg的mu-EGF/载体蛋白，持续4-6周。
第一周，免疫原制剂与弗氏完全佐剂按1∶1的比率配制，随后的剂量都是与弗氏不完全佐剂来配制。
在对照组中也进行同样的程序，只是动物仅用佐剂来处理。在最后一次免疫接种以后一周，从实验动物采血，分离血清，抗mu-EGF血清抗体效价用ELISA技术进行测定。IIb)hu-rec-EGF的免疫原性为了证实hu-rec-EGF对小鼠的免疫原性，同时为了显示抗hu-rec-EGF抗体识别mu-EGF的能力，在Balblc小鼠中进行了实验。
动物分组以后，按每只小鼠每周注射50-100μg的hu-rec-EGF/载体蛋白，每组接种不同的剂量，持续4-6周。
第一周，免疫原制剂与弗氏完全佐剂按1∶1的比率配制。随后的各剂量与弗氏不完全佐剂配制。
相同的程序也在对照组中进行，只是动物仅用佐剂来处理。
在最后一次免疫接种以后一周，从动物采血，分离血清，抗mu-EGF抗体的效价用ELISA技术进行测定。IIc)抗肿瘤活性。
本实验的主要目的是为了确定抗自身EGF的免疫反应是否能够在EGF依赖性的肿瘤中引出抗肿瘤作用。
根据以上技术，在确定具有高滴度抗体的动物体内接种艾氏腹水瘤(EAT)，接种的细胞浓度为每只动物20-200。万对照组按同样的方法进行处理。
观察动物移植瘤生长和动物生存情况。II.免疫反应的鉴定IIIa)抗体反应的同型性为了证实用自身EGF免疫接种小鼠所获得的自身免疫反应是一种IgM或IgG同型抗体的反应，进行了ELISA测定，按条款IIa)和b)描述的方法检测了用EGF免疫动物的血清。对于IgM，用抗IgM的抗血清与样品一起温育，检测IgG的特征时用抗IgG抗血清与样品一起温育。IIIb)免疫反应记忆的鉴定开发一种能够用于主动免疫治疗的疫苗产品，必须确定该产品诱导免疫记忆的能力，如果免疫记忆被诱导出，要能够确定该记忆的持久性。
这些信息使得该产品的免疫计划能够被正确地设计，并且能够被很好地完成。
用hu-rec-EGF免疫各组小鼠，每只动物用5-100μg的hu-rec-EGF，hu-rec-EGF与弗氏完全佐剂按1∶1比率配制。
在不同的动物组，抗mu-EGF的抗本产生过程的动力学被研究。动力学研究在首次免疫接种后和当抗体滴度下降时再加强免疫接种后进行。抗体水平用ELISA技术测定。IV.在非人灵长动物进行免疫原性研究免疫原制剂的免疫原性的标准必须建立在从非人灵长类动物获得的实验结果之上，因为它们与人类的亲缘关系最近。
用包含hu-rec-EGF免疫原制剂免疫一组灵长动物，剂量为500μg，hu-rec-EGF被结合在破伤风类毒素上，并且与免疫佐剂一起使用。最后一次免疫接种后采血，测定抗hu-EGF抗全效价。
实施例1在EGF依赖性肿瘤细胞膜上有EGF前体分子存在的研究本研究所用技术为蛋白印迹技术。所用样品为，5例不同阶段的乳腺导管癌，1例头颈部肿瘤，4例纤维发育不良症，5例正常样品作为对照。
从样品分离细胞膜，按Grimaux M.的操作程序(GrimauxM.Rev Neurol，1988，144101-103)。
电泳条件为250V，10mA，3DW，15℃，150Vh。分子量标准范围为14,300D(溶菌酶)～340,000D(a2巨球蛋白)。
用一Phast系统装置在转移缓冲液中把电泳分离开的蛋白带转移到0.45μm的硝酸纤维素膜上。转移完成后，膜用10％脱脂乳封闭过夜，不断振摇。
用缓冲液洗涤三次后，加入一鼠抗人EGF单克隆抗全，孵育4小时。
洗洒三次，加入生物素酰化的抗鼠抗全，孵育一小时。加入过氧化物酶链霉抗生物素蛋白结合物温育1小时后，加入二氨基联苯胺和过氧化氢显色。
结果显示，来源于正常组织的样品，在高分子量的区段没有出现条带。而来源于乳腺有病理学改变的样品(发育不良症和肿瘤)在高分子量的区段出现弥散型的条带。这就是在肿瘤细胞膜上存在高分子量的EGF前体的实验证据。实施例2制备mu-EGF/CTB结合物1毫升浓度为1mg/ml的mu-EGF(溶于PBS/MgCl210mM溶液中)与2毫升的CTB溶液(溶于PBS/10mM MgCl2中)相混合。混合摩尔数之比为1∶1。加入3毫升0.5％戊二醛，使终浓度为0.05％。
在室温下温育一小时，然后用PBS/10mM MgCl2溶液进行透析，至少更换透析液三次。实施例3mu-EGF/CTB结合体鉴定结合试验的ELISA测定PVC活化的ELISA平板(NUNC)用50μl溶于甲醇之中的浓度为4μg/ml的神经节苷酯GM1(能够识别CTB分子)包被，放置通风橱中干燥一小时。
接着用PBS/Tween洗三次，然后用1％BSA(溶于PBS/Tween中)溶液封闭平板，37℃温育30分钟。
用0.1-0.001mg/ml的稀释度把结合物加入平板，每孔50μl，37℃温育一小时。
然后把1∶1000稀释的鼠抗mu-EGF的抗血清加入平板.，每孔加50μl，37℃温育一小时。
每孔加50μl抗鼠抗血清碱性磷酸酶结合物(稀释度为1∶1000)，37℃温育一小时。每孔再加50μl浓度为1mg/ml的对硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)，37℃温育30分钟显色，读取405nm波长的光密度(OD)。
结果证实结合物浓度与吸收值之间直接的相互关系。显示了结合活性和结合的效率。因为，分子保持对神经节苷酯GM1的识别(由CTB识别)，同时也被抗mu-EGF抗血清所识别(
图1)。实施例4自身EGF的免疫原性小鼠自身免疫的诱导。
为了证实包含自身EGF的免疫原制剂能够诱导自身免疫反应，在Balb/C小鼠进行了实验。
免疫接种几组动物，每只动物每周皮下注射50μg结合的mu-EGF，持续4-6周。
第一周，免疫原制剂与弗氏完全佐剂按1∶1的比例配制，随后的剂量与弗氏不完全佐剂配制。
对照组动物仅用佐剂处理。最后一次免疫注射后一周，采血，分离血清，用ELISA测定抗mu-EGF抗体的效价。
在包被板之中加入浓度为10μg/ml mu-EGF(用碳酸盐碳酸氢盐缓冲系统pH9.6)，温育过夜。平板被洗涤以后，加入不同稀释度的样品，孵育1小时。加入碱性磷酸酶抗鼠抗体结合物，孵育1小时后出现颜色，用ELISA读数仪读取405nm波长的光密度。
所有被mu-EGF-CTB免疫的动物均产生抗mu-EGF抗体，其最高效价达1∶1000稀释度，而对照组未出现抗体(图2)。实施例5hu-rec-EGF的免疫原性小鼠自身免疫反应的诱导为了证实包含hu-rec-EGF的免疫原制剂能够诱导产生抗mu-EGF抗体，在Balb/C小鼠进行了实验。
动物进行分组。每只动物每周皮下注射50μg的hu-rec-EGF，持续4-6周。
第一周，免疫原制剂与弗氏完全佐剂按1∶1的比率配制，随后的剂量与弗氏不完体佐剂配制。
设置对照组。其动物仅用佐剂处理。
最后一次接种后一周，采血分离血清，用ELISA方法测定抗mu-EGF抗体效价。
实验所用包被板用10μg/ml的mu-EGF(溶于碳酸盐碳酸氢盐缓冲液pH9.6)包被。温育过夜。洗洒后加入各种稀释度的样品，孵育1小时。加入碱性磷酸酶抗鼠抗体结合物孵育1小时后出现颜色，用ELISA读数仪读取波长为405nm时的光密度。
所有被hu-rec-EGF免疫的动物均出现抗mu-EGF抗全，其最高效价达1∶20000稀释度，而对照组无抗体出现(图3)。实施例6hu-rec-EGF在氢氧化铝制剂中的免疫原性为了证实包含hu-rec-EGF免疫原制剂在以氢氧化铝为佐剂时能够产生抗mu-EGF抗体，在Balb/C小鼠进行实验。
动物进行分组。每只动物每周皮下注射一剂50μg的hu-rec-EGF(氢氧化铝为佐剂)，持续4-6周。
设置对照组，其动物只用佐剂处理。是后一次接种后一周，采血分离血清，用ELISA方法测定抗mu-EGF抗体效价。
用在碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中浓度为10μg/ml的mu-EGF包被平板过夜。洗涤后加入各种稀释度的样品孵育1小时。加入碱性磷酸酶抗鼠抗体结合物后1小时出现颜色反应，用ELISA读数仪读取405nm波长时的光密度。
所有被hu-rec-EGF/Al(OH)3免疫的动物均出现血清抗mu-EGF抗体，其最高效价达1∶4000稀释度。对照组无血清抗体产生(图4)。实施例7抗肿瘤活性。
本实验的主要目的是确定获得的抗自身EGF的免疫反应是否能够在EGF依赖性的肿瘤引出抗肿瘤作用。
按实施例5中描述技术确定的具有高效价抗体的动物，接种艾氏腹水瘤(EAT)，每只动物按二百万EAT细胞浓度接种。对照组(非免疫鼠)按同样方法处理。
观察实验动物移植瘤生长和动物生存情况。处理组和对照组动物生存曲线如图5所示。
生命期指数增加22.5％，并且处理组比对照组生存数的增加具有统计学的显著性(按照Mantel Haenszel和Wilcoxon试验)。实施例8按mu-EGF抗体效价与125I EGF生物学分布之间的相关性进行本实验的目的是为了证实在有抗mu-EGF抗体的动物与体内无抗mu-EGF抗体的动物体内，125I标记的EGF存在着不同的生物学分布。
为了实现此目的，用4组动物(鼠)进行实验第1组30只带有抗mu-EGF抗体的小鼠。
第2组30只无抗mu-EGF抗体的小鼠。
第3组30只有抗mu-EGF抗体并且带EAT移植瘤的小鼠。
第4组30只无抗mu-EGF抗体但有EAT移植瘤的小鼠。
在第1组和第2组在注射125I标记的EGF后2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分钟分别杀死3只动物，分别从血液、肺、肾，肝和皮肤取样，然后计数被取器官的放射活性。
实验结果显示不同时间125I标记EGF蓄积情况的不同，主要分布肾和肝(图6-a，b)，结果证实抗mu-EGF抗体的存在改变了该分子的生物学分布。
第3、4组动物，样品取自于血液，肺，肾，肝，皮肤和腹水。分别在2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分钟10个时间点上杀死3只动物，计数被取器官的放射活性。
实验结果显示，带有抗体的动物腹水中标记EGF蓄积比不带抗体的动物腹水中标记EGF蓄积少(图7)。结果显示，在有抗体的动物能够比较快地清除存在于腹水中的EGF，或者能够限制EGF进入腹水。实施例9免疫反应的鉴定抗自身EGF的同型性为了确知被自身EGF免疫的小鼠所获得的自身免疫反应是否是产生同型IgM或者IgG抗体的反应，进行了ELISA测试，平板用10μg/ml的mu-EGF包被，每孔50μl，37℃孵育一小时。
接着加入稀释度为1∶10～1∶1000被mu-EGF-CTB免疫的动物的血清，每孔加50μl，37℃温育一小时。
用对应的抗血清(分别用抗IgG、抗IgM)来检测IgG和IgM反应。
用溶于二乙醇胺之中浓度为1mg/ml的对硝基苯磷酸酯进行显色反应。37℃温育30分钟后读取405nm波长时的OD值。
在所有被处理的动物获得了IgG反应(图8)。实施例10抗自身EGF免疫记忆的鉴定研究用二组动物，每组10只小鼠，用50μg hu-rec-EGF(用弗氏完全佐剂)一次免疫接种。
在第一组，研究动物抗mu-EGF抗体产生动力学。每4天采血一次，用ELISA技术测定抗体水平。
在第二组，参照第一组当抗体效价下降时，再免疫接种一次，每2天采血一次，用ELISA技术测定抗体水平。
结果显示，当用同一制剂再次免疫动物时，能够产生免疫记忆反应(图9)。实施例11免疫原制剂的制备hu-rec-EGF/破伤风类毒素(TT)溶于PBS/10mM MgCl2中的hu-rec-EGF浓度为4mg/ml，溶于PBS/10mM MgCl2中的破伤风类毒素(TT)溶液浓度为4mg/ml，把1ml hu-rec-EGF溶液与2ml TT溶液相混合，加入3ml 0.5％戊二醛，使终浓度为0.05％。
室温下温育1小时，然后用PBS/10mM MgCl2溶液透析，更换透析液至少三次。实施例12结合特性hu-rec-EGF/TT用ELISA测定进行结合试验用50μl抗TT抗血清包被平板，温育过夜。抗TT抗血清来源于羊，浓度为10μg/ml。
用PBS/Tween法涤三次，平板再用1％BSA溶液(在PBS/Tween中)封闭，37℃温育30分钟。
每孔加50μl结合物，稀释度为0.1-0.001mg/ml，37℃温育1小时。
每孔加50μl鼠抗hu-rec-EGF抗血清，稀释度为1∶1000，37℃温育1小时。
然后，每孔加50μl抗鼠抗血清碱性磷酸酶结合物(稀释度为1∶1000)，37℃温育1小时。每孔加50μl/mg/ml的对硝基苯磷酸酯，37℃温育30分钟显色，读取波长405nm时的光密度。
结果显示结合物浓度与吸收值之间直接的相互关系。
结果显示结合物的活性和结合效率。因为该分子保持对抗TT抗血清的识别，同时其又被抗mu-EGF抗血清所识别(图10)。实施列13在非人灵长动物研究连接至载体蛋白(TT)的hu-rec-EGF/TT的免疫原性研究工作用4只猕猴来开展。先提供一项临床兽医学检查包括一般身体检查胸部X光检查血液化验这些动物用hu-rec-EGF/TT进行免疫，按实施例10提供的方法进行。
分别在1，2，3，4，6和12周进行皮下接种。第1次免疫接种辅以弗氏完全佐剂，其余各次辅以弗氏不完全佐剂。
取血，用ELISA测定抗体效价。
实验所有包被板用10μg/ml的hu-EGF包被过夜，hu-EGF溶于碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)之中。洗涤后加不同稀释度的样品，温育1小时。加碱性磷酸酶抗人抗体复合物，温育1小时后再显色，用ELISA读数仪读取OD405值。
所有用hu-EGF/TT制剂免疫的动物均产生抗hu-EGF抗体，其最高效价达1∶20000稀释度(图11)。
图1确定CTB与hu-rec-EGF之间结合效率的ELISA测定。
X轴结合物的连续稀释度(1～0.001mg/ml)y轴波长为405nm时的光密度(OD405)(用ELISA读数仪测定)图25只用mu-EGF-CTB免疫的小鼠抗mu-EGF抗体效价的ELISA测定X轴抗血清稀释度(1∶10，1∶100，1∶1000)Y轴波长为405nm时的光密度(由ELISA技术测定)曲线表示5只实验动物的抗体效价(与同一动物免疫之前的比较)图35只用hu-rec-EGF免疫小鼠抗mu-EGF抗体效价的ELISA测定X轴血清稀释度1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶20000Y轴405nm波长光密度图45只用hu-rec-EGF(氢氧化铝为佐剂)免疫的小鼠抗mu-EGF抗体效价的ELISA测定X轴血清稀释度1∶100，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000
Y轴405nm波长光密度图5用mu-EGF-CTB免疫后又接种了艾氏腹水瘤的动物的生存率与非免疫但接种了艾氏腹水瘤的对照动物生存率的比较。
图6ahu-rec-EGF免疫小鼠与非免疫对照动物肝组织中125I标记EGF蓄积时间图。
图6bhu-rec-EGF免疫小鼠与非免疫对照小鼠肾组织中125I标记EGF蓄积时间图。
图7hu-rec-EGF免疫并且带有EAT移植瘤动物腹水中125I标记mu-EGF蓄积时间图。
图8mu-EGF-CTB免疫动物的免疫反应的IgG和IgMELISA测定。
图9hu-rec-EGF免疫动物抗mu-EGF抗体(IgG)反应动力学(免疫记忆)。
X轴时间(无数)Y轴抗体效价的反对数(平均值)图10破伤风类毒系与hu-rec-EGF结合效率的ELISA测定X轴结合物的稀释度Y轴405nm波长的光密度(OD405)图11hu-rec-EGF/TT免疫非人灵长动物抗hu-rec-EGF抗体效价。
权利要求
1.结合在任何一种载体蛋白上的自身EGF疫苗组合物，它包括佐剂，能够产生抗自身EGF的自身免疫反应。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有hu-rec-EGF。
3.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有载体蛋白CTB(霍乱毒素B)。
4.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有载体蛋白破伤风类毒素。
5.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有作为载体蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有作为载体蛋白的脑膜炎球菌外膜蛋白。
7.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征是含有作为佐剂的氢氧化铝。
8.根据权利要求1-7中任何一项的疫苗组合物在恶性疾病治疗方面的应用。
9.哺乳动物自身EGF在制备用于治疗EGF相关疾病的疫苗方面的应用。
全文摘要
该项发明提供了EGF和由EGF组成的疫苗组合物的新的应用。尤其是，自身EGF或者其结段或者其衍生物被用作，抗EGF依赖性的肿瘤或者EGF依赖性疾病的免疫接种法。自身EGF能够被很好地结合在载体蛋白，例如，破伤风类毒素或者霍乱毒素B上。根据该项发明，该疫苗组合物通常包含一个免疫佐剂，如氢氧化铝。
文档编号C07K16/00GK1142973SQ95115090
公开日1997年2月19日 申请日期1995年8月17日 优先权日1993年12月9日
发明者A·B·L·达维拉, G·G·马诺罗, B·S·拉米里, I·B·德咖道, G·N·嗄多夫, E·S·比塔纳 申请人:分子免疫中心