专利名称：：白点症杆状病毒的鉴定、纯化及检测的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种感染节肢动物，特别是虾类的新病毒性病原体的鉴定、纯化及检测。该病毒命名为WSBV(白点症杆状病毒)。近年来，由于疾病的爆发造成亚洲国家的养殖虾类大量死亡。自1992年起，在台湾北部爆发一种新的疾病，造成养殖的斑节虾(Penaeusjaponicus)族群严重死亡，此病的特征为患病虾体的头胸甲、附肢及虾体内面表皮组织会出现明显的白点，并且发病后2至7天内的死亡率达100％。患病的虾体通常活动力减弱，肝胰腺略红。1993年间，白点症亦出现于台湾的养殖草虾(P.monodon)及红尾虾(P.penicillatus)，目前已有学者针对白点症所造成的危害提出报导(董明澄等，个人报导)在日本，有关斑节虾的疫情报导亦有类似发现(Nakanoetal.，FishPathology，29(2)135-139，1994)。根据电子显微镜的观察及以病虾淋巴组织滤液进行的感染试验结果显示，造成白点症的病原体为一杆状病毒，暂称之为RV-PJ，(rod-shapednuclearvirusofPenaeusjaponicus)(Inouyeetal.，FishPathology，29(2)149-158，1994；Takahashietal.，FishPatyhology，29(2)121-125，1994)。目前养殖对虾类普遍受到杆状病毒感染的事实已有明确报导(Lightneretal.，Aquaculture，32209-233，1983)。在这些感染对虾类的杆状病毒中，以monodonbaculovirus(MBV)，baculoviralmid-gutnecrosisvirus(BMNV)及Baculovirus(MBV)，baculoviralmid-gutnecrosisvirus(BMNV)及Baculoviruspenaei(BP)最为重要，因其感染养殖虾类而造成严重损失(Couch，Nature247(5438)22-231，1974；J.Invertebr.Pathol.，24311-331，1974；Lihgtneretal.(1983)，supra；Lightneretal.，1987；Sanoetal.，FishPathology，15185-191，1981)。自然界中患白点症的虾体组织内可观察到杆状病毒的存在(董明澄等，个人报导)。此病毒极可能是造成台湾养殖对虾类白点症的主要致病原。为避免此病毒的扩散，造成养殖虾类因白点症的危害而导致经济上严重损失，实在需要发展鉴定致病原及诊断的方法，以期在不牺牲检测个体的状况下，能以方便、精准又不费时的方法检测白点症。本发明是基于一种引起对虾白点症的新病原的发现。此病原已被分离及纯化，为一种无包含体杆状病毒粒子，具有包膜，长约330±20nm，直径约87±7nm。此病毒被认定为杆状病毒科(Baculovirdae)，裸杆状病毒亚科(Nudibaculovirinae)，无包含体杆状病毒属(NOB，Non-OccludedBaculovirus)的一员，本发明所分离的病毒被称为PmNOBIII，而与白点症相关的病毒则称之为WSBV(白点症杆状病毒)。WSBV的基因组DNA文库已被建立，并基于其中一段克隆的DNA片段序列设计出一对WBSV专一性引物对，用于通过PCR反应检测对虾类WSBV的侵染。以此WSBV专一性引物对进行PCR反应的结果显示，不同虾种白点症的致病原事实上是密切相关的。因此本发明的结果提供了一有效的检测工具，适用于筛检动物宿主生物体特别是虾类中的白点症杆状病毒的传染，所以本发明的使用对于防止此病毒性疾病的蔓延是相当重要的。一个简易、灵敏、专一性高又立即可用于诊断的产品，其中包括基于一个独特的白点症杆状病毒基因组DNA克隆的核苷酸序列所设计的引物对，可被发展成检测白点症杆状病毒的存在及防止此病毒性疾病蔓延的工具。本发明的特征和优点将通过参照附图对优选实施方案的描述而变得清楚明了。附图的简要说明图1为患白点症草虾(P.monodon)的照片，示出白点由不易辨到直径约3mm不等。比例尺1cm。图2为观察白点症草虾头胸甲外骨骼下的角质状表皮(C)等组织的光学显微镜照片，有分解现象的细胞其细胞核胀大并呈现许多嗜碱性包含体(箭头所指处)。比例尺10μm。图3为白点症草虾头胸甲外骨骼下的角质状表皮(C)等组织的透射电镜照片，示出在坏死区域胀大的细胞核中有病毒粒子存在(箭头所指处)。比例尺0.5μm。图4示出以病草虾组织过滤液人工感染斑节虾(P.japonicus)后，在其表皮组织所出现的杆状病毒粒子。比例尺200nm。图5为以负染法观察患病草虾表皮组织滤液沉淀物中的杆状病毒粒子的显微照片。比例尺50nm。图6示出人工感染斑节虾剥离的头胸甲，上有明显白点(箭头所指)。图7示出人工感染斑节虾(平均体重0.08g)的累计死亡率(％)。实验组浸泡于病草虾及病斑节虾的组织过滤液中，对照组则以健康草虾组织过滤液浸泡。图8为以透射电子显微镜观察纯化的病毒粒子(负染法)，病毒粒子一端延伸出尾状凸出物(tail-likeprojection)(P)。比例尺0.1μm。图9为以透射电子显微镜观察纯化的病毒粒子(负染法)，显示由病毒衣壳蛋白环状亚基所形成的横纹，此环状排列与病毒衣壳长轴垂直。比例尺0.1μm。图10为由纯化病毒提取的PmNOBIIIDNA的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳，凝胶上显示出病毒的单一DNA分子。泳道1为分子量标记(λ/HindIIIDNA片段标记物)；泳道2-4为三次分别纯化的PmNOBIIIDNA。图11为PmNOBIIIDNA以三种限制性内切酶酶切后的琼脂糖凝胶电泳(经溴化乙锭染色)。凝胶上至少有22个片段。泳道1λDNAHindIII片段标记物；泳道2PmNOBIIIDNA以HindIII酶切的片段。泳道3PmNOBIIIDNA以SalI酶切的片段。泳道4PmNOBIIIDNA以XhoI酶切的片段。泳道51kbDNA梯。图12示出虾基因组DNA经PCR反应扩增的18SrDNA片段，经DNA电泳分析及溴化乙锭染色后的琼脂糖凝胶。反应使用用于节肢动物18SRNA高保守区序列的引物143F，145R，以健康虾DNA为模板进行PCR反应扩增出一848bp的DNA片段(泳道2)。泳道1pGEMDNA分子量标记物。DNA分子量标记物的大小单位为碱基对(bp)。图13示出了以虾类DNA专一性引物对143F，145R，进行PCR反应，检测WSBV基因组DNA制备物中是否夹杂虾DNA的定性分析。PCR反应产物以1％凝胶电泳分析，PCR扩增产物若出现848bp的片段则代表存在虾DNA的污染。泳道1pGEMDNA分子量标记物。泳道2-6以各白点病杆状病毒(WSBV)基因组DNA为模板进行PCR的扩增产物。泳道7-8以健康草虾DNA为模板进行PCR的扩增产物。泳道9无DNA模板所进行PCR的扩增产物。标记物DNA片段的大小单位为碱基对(bp)。图14示出WSBV基因组以SalI酶切割的片段。WSBV基因组DNA以SalI在37℃下作用3小时，取5μl以0.8％凝胶电泳分析，并用溴化乙锭染色，显示出片段由15kb到1kb不等(泳道2)，自相同反应物中取20μl进一步建立白点症杆状病毒(WSBV)的基因组文库。泳道1λ/HindIII片段标记物。DNA分子量标记物的大小单位为碱基对(bp)。图15A表示以SalI酶切的1461bp片段的克隆于pms146质粒的位置图。图15B示出用于PCR反应的引物在SalI-1461bpDNA片段上的位置。146F1及146R1引导1447bp片段的扩增，而146F2及146R2则引导941bp片段的扩增，SalI1461bpDNA片段中的两个EcoRI酶切位点也在图中示出。图15C示出SalI-1461bp片段的详细的核苷酸序列，其中也示出两个引物对(146F1/146R1，146F2/146R2)以及两个EcoRI酶切位点。图15D示出由SalI-1461bp片段所设计的六个引物对的核苷酸序列。图16示出由蔗糖密度梯度离心纯化的WSBV病毒DNA为模板进行PCR反应，所扩增的WSBVDNA片段及虾类DNA特异性片段。泳道2，5，8，11的反应所使用的为WSBV专一性引物对143F1/146R1，扩增出一1447bpDNA片段。泳道3，6，9，12进行PCR反应所使用的为虾类DNA专一性引物对143F/145R。泳道4，7，10，13则使用143F/145R及146F1/146R1引物对同时反应。PCR扩增产物均以1％琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1pGEMDNA分子量标记；泳道2-4以病虾(1#)表皮组织所纯化的病毒的DNA为模板进行PCR反应的扩增产物，示出虾类DNA带和WSBVDNA带。泳道5-7以病虾(2#)表皮组织所纯化的病毒的DNA为模板进行PCR反应的扩增产物，显示只扩增出WSBVDNA带。泳道8-10以病虾(2#)肌肉组织所纯化的病毒的DNA为模板进行PCR反应的扩增产物，显示扩增出集中的虾类DNA带和WSBVDNA带。泳道11-13以健康虾DNA为模板进行PCR反应的扩增产物，显示只扩增出虾类DNA带。DNA分子量标记物的大小单位为碱基对(bp)。图17显示由pms146质粒或患白点症的草虾DNA为模板进行PCR反应所扩增的WSBV及虾类专一性DNA的片段。泳道2，5，8，11所使用的引物为WSBV专一性引物146F1，146R1，所扩增的产物大小为1447bp，泳道3，6，9，12使用专一于1447bp片段的内部引物146F2，146R2，所扩增的产物大小为941bp，泳道4，7，10所使用的是虾类DNA专一性引物143F，145R，所扩增的产物大小为848bp。以上扩增产物均以1％琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析。泳道1pGEMDNA分子量标记物，泳道2-4pms146质粒DNA，泳道5-7自然患病草虾的DNA提取物，泳道8-10自然患病斑节虾的DNA提取物，泳道11-12为不加模板反应的对照组。DNA分子量标记物的大小单位为碱基对(bp)。图18显示以人工感染WSBV的病草虾DNA为模板进行PCR反应所扩增的WSBV及虾类专一性的DNA片段。PCR反应使用引物146F1，146R1，其所扩增的产物大小为1447bp，扩增产物以1％琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析。泳道1pGEMDNA分子量标记物，泳道2-4分别为以三尾人工感染的草虾DNA为模板进行PCR所扩增的产物，泳道5-7分别为以三尾健康草虾DNA为模板进行PCR所扩增的产物。DNA分子量标记物的大小单位为碱基对(bp)。图19为WSBV感染的健康草虾的DNA与DIG标记的1447bpPCR产物进行的斑点杂交反应。将两尾受WSBV感染的病虾DNA(1，2)及两尾健康虾DNA(3，4)以双份(A，B)点在Hybond-Npaper上，接着以DIG标记的1447bpPCR产物片段为探针进行斑点杂交反应，此探针只与受感染的虾的DNA杂交，而不与健康虾DNA杂交。图20为来自患病草虾或斑节虾的WSBVDNA与DIG标记的1447bpPCR产物进行的Southern杂交。来自草虾或斑节虾的WSBVDNA以SalI酶切后，转印至Hybond-Npaper上并以DIG标记的1447bpPCR产物进行探测。结果显示探针以相同的强度与由草虾或斑节虾来源的WSBVDNA经SalI酶切后的1461bp片段杂交，因此显示它们密切的相关性。A以溴乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶，B凝胶(A)的Southern印迹的放射自显影图。泳道1pGEMDNA分子量标记物，泳道2由草虾分离纯化的WSBV的基因组DNA的SalI酶切片段，泳道3由斑节虾分离纯化的WSBV基因组DNA的SalI酶切片段。图21示出以疫区收集的节肢动物的DNA为模板，并利用WSBV专一性引物对146F1/146R1进行的PCR扩增反应。泳道1pGEMDNA分子量标记物，泳道2草虾，泳道3斑节虾，泳道4螃蟹，泳道5桡足类，泳道6昆虫(水蝇科)，泳道7正反应对照组，DNA来自己知的病虾，泳道8负反应对照组，样品末加模板。台湾的养殖对虾近来相继爆发病害，造成经济上的严重损损，其中包括草虾(Penaeusmonodon)、斑节虾(P.japonicus)、红尾虾(P.penicillatus)等。其共同病征为头胸甲、附肢及虾体内表面上出现明显白点。为鉴定造成对虾白点症之病原体，使用电子显微镜观察患病的虾体组织。取具有明显白点患病草虾及斑节虾的表皮萃取液浸泡不同大小的健康斑节虾，进行感染实验。利用电子显微镜观察人工感染或自然感染的患病斑节虾，均发现一种无包含体的杆状病毒粒子存在于病虾的表皮组织中。此病毒粒子具包膜，长约330±20nm，直径约87±7nm。这些人工感染的虾很象自然感染的虾。将含此病毒的滤液直接接种于鱼类细胞株，未发生细胞病变的现象。在人工感染实验中，累计死亡率在5-7天内高达100％，且实验虾易受捞捕及温度改变等紧迫因子影响而死亡。由于自然界中患病的病虾与人工感染的病虾的病征及所见到的病毒形态非常相似，因此可判断此杆状病毒是造成台湾养殖对虾白点症的主要病原体，因此，这种病毒性疾病被命名为“白点症”(W.S.S)，而此病原体的分类地位则以进一步研究分离自患W.S.S病草虾的病原体(白点症病毒)来判定。所述的病原体自患白点症的草虾纯化得到。此病毒粒子以负染法观察时是多态的，呈椭圆形或纺锤形或杆形，长约250-380nm，最宽处约70-150nm，部分病毒粒子的一端具有尾状凸出物。病毒衣壳是由亚基环绕相叠而成，呈现与病毒衣壳纵轴垂直的特殊横纹状。病毒基因组为双链DNA分子，经由HindIII酶切后，至少可分为22个片段，总长约150kb，基于形态特征及基因组结构，可确认此病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，裸杆状病毒亚科(Nudibaculovirinae)，无包含体杆状病毒属(Non-OccludedBaculovirus)，因此称最近所分离的病毒为PmNOBIII，而与PmNOBIII相关的病毒则称为WSBV(白点症杆状病毒)。目前推测和PmNOBIII相类似的WSBV包括在大陆地区于1993-1994年间所发生的EEDS致病原—皮下及造血组织坏死杆状病毒(hypodermalandhematopoieticnecrosisbaculovirus，HHHNBV)(Caietal.，J.Fish.China，19112-117，1995)以及发生于泰国地区养殖草虾的系统性外胚层及中胚层组织杆状病毒(Systematice.ctodermalandmesodermalbaculovirusSEMBV)，(Wangetal.，Dis.aquat.Org.，23239-242，1996；Wongteerasupayaetal.，Dis.aquat.Org，2169-77，1995)这种新病毒疾病的主要临床症状为病虾的外骨骼及表皮上出现明显白点或白斑，白点大小从肉眼几乎不可见到直径3mm不等，从病理组织学的研究可证明WSBV主要攻击的部位是角质状表皮，在这些病灶组织中可发现许多细胞核胀大的细胞(Momoyamaetal.，FishPathol.，29141-148，1994，Chouetal.，Dis.aquat.Org.，23165-173，1996；C.H.Wangetal.，1995)，因此对虾类的白点症可确知是由无包含体杆状病毒所引起的，在前期研究中，本发明人以从草虾中分离的WSBV为起始材料以开发一种检测虾中WSBV的诊断工具。为发展检测虾体是否受WSBV及相关病毒体感染的准确诊断法，本实验室由受WSBV严重感染的草虾组织中纯化出病毒粒子，并由纯化的病毒粒子提取基因组DNA，其中包括用蛋白酶K及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理病毒粒子、苯酚—氯仿萃取、酒精沉淀等步骤。所纯化的病毒DNA以虾类DNA专一性引物对进行PCR定性检测，以确定其中无虾DNA的污染，并以此病毒DNA建立WSBV基因组文库且由克隆的DNA片段的序列设计出一套专一性引物。以此套专一性引物对含有WSBVDNA的样品进行PCR反应，结果正如预期的出现一约1447bp的DNA片段，而健康虾的DNA样品则不出现此片段，所以肯定了此套引物对于WSBVDNA的专一性。由于患白点症之不同虾种，均能以此套WSBV专一性引物以PCR反应检测出，因此可证明不同虾种白点症的病原是很相近的。至于其他生物，如桡足类、蟹类及昆虫等以此套引物进行PCR反应均出现正反应。本发明结果提供了节检虾体是否受WSBV感染的有效检测工具，这对于防止此病毒性疾病的扩散是相当重要的。材料与方法虾类来源作为感染试验的健康斑节虾取自于台湾南部一不曾出现病毒性疾病的斑节虾繁殖场。所有斑节虾均饲养于水族箱，水温25-28℃，充分曝气并每日二次喂食人工饲料。患病的斑节虾得自于台湾北部的养殖场，而患病垂死的草虾(平均重量30g/每尾)则于1994年11月收集自台湾南部的养殖场。所有样品均以解剖、光学显微镜及电子显微镜观察，以确定此病症，所使用的方法详述如下光学显微镜观察正常虾及具有白点的斑节虾先以Davison’s固定液浸泡(Bell&Lighter1988)，固定48小时后，将样品转移至50％酒精中，然后进行脱水、包埋、切片等过程制成5μm石蜡切片，并以HemtaoxylinandEosin(H&E)染色。透射电子显微镜观察取自然或人工感染斑节虾头胸甲下方、鳃部上方的表皮组织，立即以2.5％戊二醛(于0.1M冷磷酸缓冲液中，pH7.4，PBS)于4℃浸泡2小时，之后用冷PBS清洗数次，再用1％四氧化锇4℃固定3小时，接着进行脱水过程并以Spurr’s树脂包埋。使用Richert-jungUltracutEUltrome进行超薄切片，续以乙酸双氧铀及柠檬酸铅染色，观察时则使用HITACHIH-600透射电子显微镜。感染试验负染法观察病毒粒子取病草虾表皮组织与海水在4℃下匀浆(组织∶海水＝1∶9)，之后以8510×g离心5分钟(Sigma2K15rotor12141)，上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液再14549×g离心1小时，(Sigma2K15rotor12139)，得到的沉淀物用灭菌海水悬浮，作为负染之用。负染时取1滴悬浮液加上4滴0.1％牛血清白蛋白和2％磷钨酸(1∶2；pH7.0)混合液，将此混合物置于300目载网上，30-60分钟后以滤纸吸去多余液体待其干燥后进行电镜观察，所使用的透射电子显微镜为HITACHIH-600透射电子显微镜。细胞病理分析先将EPC(epithliomapapulosumcyprini)，CHSE-214(chinooksalmonembryow)，FHM(fatheadminnow)，SSE-5(sockeyesalmonembryo)等细胞接种于24孔的微滴定板上，病虾表皮组织过滤液则以5倍连续稀释成1/20至1/12500等倍数，用稀释的滤液直接与上述四种鱼类细胞株共同培养，培养温度为20℃，共培养观察4星期。感染试验使用病虾表皮组织滤液用海水稀释500-750倍后以浸泡方式进行，虾体为活的或冰冻过的自然感染的病斑节虾和草虾。实验时将35尾斑节虾浸泡于稀释滤液中2小时(所使用的虾年龄为一个月，平均体重0.08g)，对照组则浸泡于健康草虾表皮组织滤液或Grace昆虫培养液中。浸泡感染后的斑节虾饲养于玻璃水族箱中，水温25-28℃，盐度维持25-30ppt，并充分打气。每日观察并计算死亡率，同时收集垂死虾体以透射电子显微镜观察研究。WSBV的纯化、基因组构造及分类地位由草虾分离纯化WSSV病毒粒子的方法如下，虾体先用冰的一倍TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.6)润湿体表，由一到五只活虾或冰冻虾体取下的外骨骼及其下表皮，加入20毫升冰的萃取缓冲液(20mMHEPES，0.4NNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，1mMDTT，2.5mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml亮抑酶肽、1.6μg/ml抑胃酶肽，2μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml苯丁抑制素)进行萃取，接着使用重量百分比35％到65％梯度浓度的遮糖溶液，进行74,700xg(HitachiSRP285rotor24,000rpm)超高速离心一小时。将梯度中段肉眼可见的病毒层移出，并在4℃下以74,700xg离心30分钟，沉淀物用冰的一倍TE缓冲液洗两次，视沉淀物的大小以300到500毫升不等的冰的一倍TE缓冲液重新溶解，并且立刻进行病毒DNA的提取，另取一小部分纯化的病毒悬浮液用2％磷钨酸(PTA)(pH＝7)进行负染，用做病毒粒子超微结构的研究。从蔗糖梯度浓度纯化出的病毒粒子，进行病毒基因组DNA的提取，使用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB)处理后用苯酚-氯仿萃取及酒精沉淀(Wilson(1994)，PreparationofgenomicDNAfrombacteria.MiniprepofbacterialgenomicDNA.inAusubel，F.M.etal(.(eds.)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1.GreenePub.Assoc.andWiley-Interscience，NY，p.2.4.1-2.4.5)。利用限制性内切酶酶切分析，估算病毒基因组的大小。病毒DNA利用限制性内切酶HindIII，SalI及XhoI(BoehringerMannheimCompany)酶切之后，酶切片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，其中缓冲液为含0.5μg/ml溴化乙锭的Tris-乙酸缓冲液(0.04MTris乙酸盐，0.1mMEDTA，pH8.0)，并同时使用1kb的DNA梯及HindIII片段二种标记物(LifeTechnlolgies，Inc.)做为估算DNA大小的参考标准。有效诊诊断工具的开发为了开发有效的诊断工具，以从病毒粒子中提取的“超纯”WSBV基因组DNA为材料，构建WSBV基因组文库，并且使用聚合酶链反应(PCR)扩增选定的DNA片段，此方法是证明病原存在与否的非常有利的诊断工具。(Erlichetal.，Nature331461-462，1988；Oste，C.，Biotechniques6162-167，1988)。依据克隆的WSBVDNA片段序列，设计了一组专一于WSBV的PCR引物对。I.WSBV基因组文库的构建A.病毒纯化及病毒DNA的提取利用与分类研究同一批的冰冻感染病毒草虾做为纯化病毒的材料，这株WSBV病毒依据Franki等人(Arch.Virol.，21-450，1991)的标准命名为PmNOBIII(thethirdnon-occludedbaculovirusreportedfromP.monodom)。纯化病毒的方法如前文所述。病毒基因组的提取是将纯化的病毒粒子用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基澳化铵(CTAB)处理，并用苯酚-氯仿萃取及酒精沉淀(Wilson(1994)，supra)。简单说明如下，梯度纯化出的病毒粒子，在含有100mMKCl，1％SLS(N-十二烷基肌氨酸)及0.2mg/ml蛋白酶K的TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.6)中置于65℃下温育三小时。之后加入5MNaCl使DNA溶液中NaCl的浓度达到0.7M，再缓慢加入十分之一体积的CTAB/NaCl(10％CTAB于0.7MNaCl中)，充分混匀后置于65℃温育十分钟。经二次等体积的氯仿/异戊醇提取之后，再进行二次等体积的苯酚/氯仿/异戊醇萃取，DNA以二倍体积的100％乙醇进行沉淀，之后以冰的70％乙醇清洗。干燥的DNA沉淀溶于适量的0.1倍TE缓冲液中，65℃下水浴30分钟，然后保存于4℃直到使用。B.虾DNA的制备，以供做PCR反应的对照组为了监测WSBV基因组DNA纯化的过程中是否遭受虾DNA的污染，因此设计一组专一于虾基因组DNA的PCR引物对。为了这个目的，搜寻电脑资料档案(GenBank，NationalIustituteofHealth，MD，U.S.A)中已发表的十足类基因序列(Kim&AbeleJ.Crust.Biol.10，1-13，1990)，以PC/GENE程序(Intelligenetics，Inc.)进行序列对比分析，在18SrRNA序列中高度保守的区域设计二个引物，143F正向引物(5’-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3’，N表示G、A、T或C)及145R反向引物(5’-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3’)。通过二者配对以供PCR反应的进行，虾DNA如预期产生了长848bp的PCR产物，相对于P.aztecus18SrRNA的核苷酸序列中第352到第1200位核苷酸。以健康草虾及斑节虾肌肉提取的基因组DNA为PCR反应的正对照。提取去蛋白质的虾基因组DNA的方法，是依照提取哺乳动物组织的基因组DNA的方式进行(Strauss，WM(1994)，PreparationofgenomicDNAfromMammaliantissue.InAusubel，FM，BrentR，KingstonRE，MooreDD，SeidmanJG.SmithJA，StruhlK(ED.s)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1.GreenePublishingAssociatesInc.andJohnWileyandSons，Inc.，NewYork，p.2.2.1-2.2.3)。简单说明如下，从虾腹部切下重约200毫克的肌肉组织后，置入液氮中急速冷冻并磨碎成粉末状，处理过的组织加入2.4毫升消化缓冲液(100mMNaCl，10mMTris-HCl，pH8，25mMEDTA，pH8，0.05％十二烷基硫酸钠，0.1mg/ml蛋白酶K)并置于65℃水浴12到18小时。消化之后利用苯酚/氯仿/异戊醇萃取以去除蛋白质，并以酒精沉淀DNA，DNA干燥后用0.1倍TE缓冲液重新溶解，置于65℃水浴30分钟，然后保存在4℃下直到PCR反应时使用。C.构建WSBV基因组文库如下构建两个WSBV基因组文库PmNOBIII(pms)及PmNOBIIIHindIII(pmh)无虾体DNA污染的WSBV基因组DNA，用SalI或HindIII限制酶(BRL，LifeTechnologiesInc.)在37℃下作用3小时，以得到DNA片段，利用T4连接酶将这些DNA片段与已被SalI或HindIII酶切的pUC19质粒载体进行连接反应，16℃下反应过夜。得到的质粒DNA转化EscherichiacoliDH5α感受态细胞，并涂布在氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷(X-gal)琼脂培养基上。以小量制备法筛选抗氨苄青霉素的白色转化子，以确定是否得到适当的重组质粒，之后用双链DNA模板、测序试剂盒(UnitedStatesBiochemicalCorp.)及M13/pUC测序引物(GIBCOBRLLifeTechnologies)测定插入的DNA片段的两条链的序列，并接着设计序列内具有专一性的引物。从转化子中分离出重组质粒，利用SalI或HindIII酶切筛选插入片段的在与否。插入片段的大小列于表1。II.利用由纯的WSBV病毒粒子提取的DNA扩增WSBVDNA片段寡核苷酸引物(146F及146R)用于扩增WSBVDNA片段。引物146F及146R的设计是依据一段来自于重组质粒pms146的克隆的WSBV1461bpSalIDNA片段的序列，在这段DNA片段中设计了六对引物，如图15D所示。146R1及146F1引物对的序列如下146R1，5’-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3′；146F1，5’-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3’，利用这对引物，预期可从WSBV基因组DNA中扩增出一段1447个碱基对的DNA片段。而内部的引物对146R25’-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3’及146F25’-GTAACTGCCCCTTCCATCTCC-3’则用于确定扩增片段的确来自WSBV941bp的SalIDNA片段。PCR反应中用来测定引物专一性的DNA模板是用从纯的WSBV病毒粒子及健康虾肉中提取的去蛋白的DNA样品。III.由自然感染及人工感染WSBV的虾体中提取的DNA进行WSBVDNA片段的扩增反应病虾包括自然感染及人工感染WSBV的虾体。人工感染是指健康虾(平均体重0.5克)利用前述的方法感染WSBV，感染五天后取三只人工感染的虾及三只健康虾提取其DNA，并用专一于WSBV的引物对(146F1及146R1)与专一于虾DNA的引物对(143F及145R)进行PCR检测反应。IV.PCR扩增反应及产物分析进行扩增反应的去蛋白DNA样品用量约0.1-0.3μg，最后的反应混合物体积为100μl，其中包含10mMTris-HCI，25℃时pH9，50mMKCl，1.5mMMgCl2，0.1％TritonX-100，每种dNTP200μM，每种引物100pmol及2.5单位的TaqDNA聚合酶(Promega)。扩增反应由AG-9600ThermalStation(BiotronicsCorp.)完成，其反应程序为94℃4分钟，55℃1分钟及72℃3分钟一个循环，94℃1分钟，55℃1分钟及72℃3分钟39个循环，共40个循环后再72℃5分钟。每次PCR反应的对照组中均不加入DNA模板，有些PCR反应的对照组则在反应混合物中还加入提自健康虾的DNA，PCR产物利用含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳分析，在UV光照射下可用肉眼辨认。V.利用DIG标记的1447bp的PCR产物与提取自WSBV感染草虾或健康草虾的DNA进行斑点杂交反应将从WSBV感染草虾或健康草虾提取的DNA利用96孔斑点印迹真空过滤装置(SchleicherandSchuellInc.)点在Hybond-Npaper上，自然干燥后用1.5MNaCl及0.5NNaOH使DNA变性10分钟，然后用1.5MNaCl及1MTrispH7.4中和10分钟。根据标准的分子克隆技术(SambrookJ，FritschEF，ManiatisT(1989，)MolecularcloningALaboratoryManual，2nd.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)将这些印迹与DIG标记的1447bp的PCR产物进行杂交反应。首先在37℃下，这些斑点印迹置于预杂交液中(50％甲酰胺，5XSSC，1mMEDTA，50mMTris(pH8)，5XDenhardt′s试剂(0.1％Ficoll-400，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA))进行预杂交反应12小时，然后将这些斑点印迹与DIG标记的探针进行斑点印迹杂交反应，37℃16小时。以1447bp的PCR产物为模板，利用随机引物方法(BoehringerMannheim)制备探针，杂交反应之后，利用DIG发光检测试剂盒(BoehringerMannheim)进行呈色反应，检测斑点印迹上具有DIG标记的核苷酸。37℃下，这些斑点曝露在柯达底片XAR-5上30分钟，以记录发光讯号。VI.利用DIG标记的1447bpPCR产物与病草虾或病斑节虾提取的WSBVDNA进行Southern杂交反应进行Southern杂交反应以确定1447bpPCR产物在由感染白点症的病草虾或病斑节虾纯化而来的WSBV基因组DNA中的位置。为此目的，从病虾分离而来的200ngWSBV基因组DNA用SalI限制酶酶切，并以0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶经过酸化(0.25NHCl)去嘌呤及碱处理(1.5MNaCl-0.5NNaOH)使DNA变性后，用1MTris(pH7.4)及1.5MNaCl中和处理，之后将DNA转移至Hybond-N尼龙膜上，转移步骤利用抽真空转移装置进行60分钟，转移缓冲液是20XSSC(3MNaCl，1.5M柠檬酸钠)(Sambrooketal.(1989)，supra)，Hybond-N膜与DIG标记的1447bpPCR产物进行杂交反应。VII.检测疫情流行区收集到的节肢动物感染WSBV的情况从疫情流行区收集到的节肢动物提取其DNA做为DNA模板，利用146F1及146R1引物对进行PCR反应，检测试验生物体内是否有WSBV的存在。结果A.组织病理研究对虾类白点症的爆发不再只是局限于局部地区的问题，它已带来整个亚洲养虾工业的危机。为了更清楚地将这些致病病毒分类，并能发展快速的诊断方法，对于此病毒的物理化学特征，做更进一步的研究。病草虾的主要临床症状是外骨骼出现白点(图1)，尤其虾壳剥下后的头胸甲上的白点最为明显，即使在轻微感染个体的头胸甲亦可见。组织病理学的研究证明病虾表皮是此病毒的攻击部位，因为这类组织会出现核胀大并有内含体的退化细胞(图2)。利用白点症病虾角质层下的表皮做超薄切片，在电子显微镜下观察，可见到坏死区域具有大量无包含体杆状病毒颗粒，也很容易看见胀大的核中充满病毒粒子(图3)。这些病毒颗粒长约330±20nm，直径为87±7nm(n＝30)，病毒颗粒中的电子致密中心是核衣壳，大小约220×70nm，自然感染及人工感染病虾中的病毒粒子在外观上没有差异(图4)。B、负染色及滤液毒性测定的感染试验从病草虾表皮制得的滤液沉淀的负染结果如图5所示，病毒粒子可见杆状外型，与自然界感染虾体做超薄切片后所见的病毒粒子相似，没有观察到细菌的存在。已试过的四株鱼类细胞株中，没有发现任何一株出现细胞致病反应(CPE)，用于浸泡接种的滤液对于细胞没有毒性。C、感染试验将健康虾暴露于白点症病斑节虾及病草虾外表皮滤液中。这些人工感染的虾相似于自然界被感染的虾(图6)，并且在5到7天内累积死亡率高达100％(图7)，而对照组则无虾死亡。另外，WSBV接种对于试验中最小的虾(平均体重0.08克)具有高致病力，在五天内所有这些虾均死亡；然而在0.16克大小的虾群中，虽然在十二天达到100％的累计死亡率，但是七天后只有35％的累计死亡率；而试验中最大的虾群(平均体重0.26克)则在二星期内只有10％的死亡率。对照组均无死亡。D、WSBV的纯化、基因组结构及分类地位纯化的病毒粒子呈纺锤形或两端钝圆的杆状，负染制备下，病毒粒子最宽点为70-150nm，长为250-380nm，比超薄切片约大了10％。有些病毒粒子则可观察到某一端延伸出尾状凸出物(图8)。无包膜的核衣壳通常直径约58-67nm，长约330-350nm。衣壳部分呈平行横纹(图9)，因此衣壳看起来由相叠的亚基环组成，这些环的厚度(20nm)非常一致且垂直于衣壳的纵轴。就病毒外型来看，WSSV相近于SEMBV(SystemicEctodermalandMesodermalBaculovirus)而不同于BMN(BaculoviralMid-gutGlandNecrosisVirus)及PmSNPV(PenaeusmonodoonSingleNucleocapsidNclearPolyhedrosisvirus-MBV)(Marietal.，Disaquat.Org.162-7-215，1993；Sanoetal.，Dis.aquat.Org.2169，1995)。然而SEMBV感染的虾体并末被报导具有如同WSSV感染呈现白点的主要临床特征，因此目前为止很难推测WSSV及SEMBV间的相关性。图10是纯化的WSBV病毒粒子中提取的一条DNA分子，图11则是WSBV的基因组DNA用限制性内切酶HindIII、SalI及XhoI酶切后的图谱，WSSV的基因组DNA用HindIII酶切割后，在琼脂糖凝胶上电泳后可见到至少有22个片段，其大小分另约为19.4，16.9，14.9，12.5，10.0，9.6，8.4，8.0，7.3，6.1，5.5，4.8，4.3，3.9，3.6，3.3，3.0，2.5，2.0，1.6，1.4及1.1kbp。若尚有小于1kbp的片段则已走出凝胶无法辨识。估算WSBV的DNA长度大于150kbp，其位于昆虫杆状病毒基因组大小90-230kbp的范围内(Franckietal.Arch.Virol.，suppl.121-450，1991)。依据形态特征及基因组结构，将白点症病毒分类于杆状病毒科(Baculoviridae)，裸杆状病毒亚科(Nudibaculovirinae)的无包含体杆状病毒属(NOB)(Franckietal.(1991)，supra)，且由于其为记录中草虾体内第三种无包含体状病毒，而命名为PmBOBIII(thethirdnon-occludedbaculovirusrepeotedforp.monodon)(D.V.Lightner，BocaRaton，p.393-486，1993；Wongteerasupayaetal.，1995，supra)。本发明的病毒分离物PmNOBIII根据布达佩斯条约已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为1996年1月11日，保藏号为CCTCC-V96001。我们也建议可用WSBV(Baculovirusassociatedwithwhite-spotsyndrome)表示与PmNOBIII相关的病原。E、有效诊断WSBV感染的工具的开发I、WSBV基因组文库的构建a)病毒纯化及病毒DNA的提取经过蔗糖梯度离心浓缩及纯化之后，可见到典型杆状的WSBV病毒粒子，这些病毒粒子可用以提取病毒DNA。利用PCR反应及专一于18srRNA的引物对扩增虾DNA，的确可见到如预期中的848的bp的片段(图12)。如此提供了一个简单且灵敏度高的方法检测少量虾DNA的存在，因此在构建WSBV基因组文库的过程中，利用此法可以监测WSBV基因组DNA制备的过程中虾DNA污染的情况。图13中PCR反应的分析可见大部分WSBV基因组DNA制备物中均有宿主DNA的污染，然而少量从纯化病毒提出的WSBV基因组DNA样本的没有宿主DNA的污染，例如图13中泳道3。b)基因组文库的构建利用SalI或HindIII限制性内切酶(BRL，LifeTechnologiesInc.)及pUC19质粒载体构建二个基因组文库，PmNOBIIISaI(pms)及PmNOBIIIHindIII(pmh)。例如，取5μlSalI酶切后的WSBVDNA，以含有溴乙锭的0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，确定WSBV基因组DNA已被SalI酶切完全后(图14)，取20μl同一批酶切的DNA片段进行基因文库的构建。用SalI或HindIII酶切筛选转化子中分离出的重组质粒，其中pms基因文库的592个克隆(pms1-pms592)，pmh基因文库的410个克隆(pmh1-pmh245及pmh419-pmh584)通过SalI或HindIII酶切筛选插入片段的存在，插入片段的大小从15kbp到小于100bp不等，如表1。这些基因文库提供了大量WSBVDNA的材料，以供病毒分子生物学更进一步的研究，并且开发核酸及免疫诊断试剂盒。II、扩增从纯化病毒粒子提取的去蛋白WSBVDNA片段依据WSBVSalIDNA片段的基因序列(末显示资料)，设计了几对引物对，并通过PCR反应评价这些引物证明WSBV存在于感染组织的能力。图15A显示出质粒pms146中克隆的SalI-1461bpDNA片段。图15B则表示用做PCR扩增反应的引物对在SalI1461-bpDNA片段中的位置。146F1及146R1引导扩增反应产生1447bpDNA片段，而146F2及146R2则引导扩增出941bpDNA片段，图中亦标明SalI1461bpDNA片段中两个EcoRI位点的位置。图15C显示SalI1461bpDNA片段的详细核苷酸序列，其中还标出了二套引物对(146F1/146R1及146F2/146R2)及两个EcoRI位点的位置。图15D显示自SalI1461bpDNA开发的六对引物对的核苷酸序列，其中146F1/146R1引物对对于WSBVDNA的扩增反应一直是有效且稳定的，而对虾DNA则无反应，因此之后的研究工作选用这对引物进行。图16示出用纯化的WSBV基因组DNA做为模板，用专一于WSBVDNA或虾DNA的引物进行PCR扩增的结果，其中泳道2、5和8表示利用专一于WSBVDNA的引物对146F1/146R1及三种独立制备的WSBVDNA进行扩增反应的结果，结果显示这几个泳道中1447bpPCR产物很亮，证明这三个试验样品中都含有相对大量的WSBV基因组DNA，而由于图16中第6泳道没有可检测到的虾DNA的PCR产物，可以证明至少有一个WSBVDNA的样品是没有虾DNA污染的。在反应混合物中同时使用专一于WSBVDNA的引物对146F1/146R1及专一于虾DNA的引物对143F/145R以证明DNA模板中WSBVDNA所占的大约比例。图16中资料证明，在三种独立制备的WSBVDNA样品中可检测到WSBV特异性DNA片段均是主要的DNA带(泳道4、7和10)，然而三个样品中有二个WSBVDNA的样品(泳道4和10)可以检测到虾DNA的存在，因此DNA模板中含有不同比例虾DNA及WSBVDNA。还可很清楚地看到虽然有虾DNA的污染，但经过蔗糖梯度离心后纯化的WSBV病毒粒子提取的DNA大部分仍是WSBVDNA。同时PCR反应混合物中使用临床上健康虾组织提取的核酸及专一于WSBVDNA的引物对146F1/146R1，扩增反应结果都是负的。(图16，泳道11)，因此证明这套引物对的专一性。III.以自然感染及人工感染WSBV病毒的虾组织提取的DNA进行WSBVDNA片段的扩增反应。图17显示利用pms146质粒DNA和从自然感染WSBV的草虾或斑节虾组织提取的DNA做为DNA模板进行扩增反应的结果，这些DNA模板利用专一于WSBV的引物对146F1/146R1或专一于虾DNA的引物对143F/145R进行扩增反应。从纯的pms146质粒DNA扩增出的DNA与1447bpPCR产物共迁移，证明WSBVDNA存在于每一个自然感染的虾提取的核酸中，如图17泳道2、5和8所示。10μl的上述PCR产物利用内部引物对146F2/146R2可以再扩增产生预期为941bp的PCR产物(图17泳道3、6和9)，结果证明扩增产物与模板间的一致性。利用专一于虾DNA的引物对143F/145R可以非常有效地扩增虾DNA，如图17泳道7和10。图17中泳道5-10的结果显示利用专一于WSBVDNA的引物对146F1/146R1及146F2/146R2即使有很大部分的虾DNA存在，也可以有效地检测WSBVDNA的存在。图18示出PCR反应的扩增结果，此反应利用从人工感染WSBV的草虾组织中提取出的DNA做为DNA模板，并用146F1/146R1做为引物，所有人工感染的虾体均扩增出如预期的1447bp的PCR产物。而对照组的健康虾进行的扩增反应则无1447bp的PCR产物存在。IV.DIG标记的1447bpPCR产物与提取自WSBV感染的草虾或健康草虾的DNA的斑点印迹杂交反应斑点印迹杂交反应的结果证明，所述的PCR产物与WSBV感染虾提取出的DNA能杂交，但不与健康虾提取出的DNA杂交(图19)，此结果证明1447bpPCR产物的专一性。V.DIG标记的1447bpPCR产物与提取自病草虾或病斑节虾的WSBVDNA的Southern杂交。为了确定1447bpPCR产物在WSBV基因组DNA中的位置，用DIG标记的1447bpPCR产物为探针，与WSBV基因组SalIDNA片段进行Soutbern杂交反应，结果证明1447bpPCR产物专一地与WSBV基因组DNA中1461bp长的SalI片段杂交(图20)。从草虾或斑节虾分别制备的WSBV基因组DNA中的1461bpSalI片段均与探针产生正反应。VI.检测疫情流行区收集到节肢动物感染WSBV的情况在试验的生物体中，草虾、斑节虾、螃蟹、桡足类及昆虫(Ephydridaefamily)均呈现WSBV正反应(图21)。计论病虾的头胸甲、附肢及体表内侧均会出现明显白点，并出现活力降低、肝胰腺变红的情况。导致疾病爆发的可能原因有包括弧菌感染、病毒感染、环境管理不良及营良不均衡等多种推测出现。然而依据电子显微镜下的观察，一种杆状病毒被认为是主要的病原。具有白点的病斑节虾及病草虾体内分离出的致病病毒，在目前研究中首先研究其致病力。自然感染及人工感染的虾体中可以见到相似的白点病征及相近的病毒形态，由此可以证明这种病毒的确是导致疾病爆发的病原。这种病毒具有高致病力并持续对虾类造成威胁，健康虾喂食病虾的实验中，推测病毒可以经口传染以及经水传染。除了WSBV外，根据报导有一群不同的杆状病毒可以感染甲壳纲十足类，首先出现在Couch的报导中(Nature，247(5438)229-231，1974；J.Inverteba.Pathol.，24311-311，1974)，并且有些病毒对发病生物有很高的致死率(Lightner&Redman，J.Inverteba.Pathol.，38299-302，1981；Sonaetal.，FishPathol.，15185-191；Lesteretal.，Disaquat.Org.，3217-219，1987；JohnsonP.T.，Disaquat.Org.，5111-122，1988；Johnson&Lightner，Disaquat.Org.，5123-141，1988；Bruceetal.，J.Virol.methods，34245-254，1991；Changetal..FishPathol.，27(3)127-130，1992；Changetal.，J.Invertebr.Pathol.，62116-120，1993；Marietal.，Dis.aquat.Org.16207-215，1993；Wongteerasupayaetal.，Dis.aquat.Org.2169-77，1995)。这些病素在外型上十分相近，大部分的研究者都同意在病毒因组结构方面应该有更多的参考资料，以供确定甲壳类杆状病毒的分类地位。利用分子生物学技术开发快速且可信度高的诊断方法，将在病毒之间认定及比较方面非常有用，并且可用以筛选虾苗及种虾是否为带原者。有鉴于这些原因，目前的研究者重于分析WSBV基因组的结构及发展有效且灵敏的诊断方法。实验中，专一于虾DNA的引物对用于几项分析，在目前研究中使用专一于虾DNA的引物对有以下几项目的(i)分析WSBV基因组制备的纯度，(ii)评价用于提供足以扩增的DNA模板的核酸提取方法，(iii)估算从感染组织提出的所有核酸制备的DNA模板中虾DNA及WSBVDNA所占的比例。我们尝试从不同组识中纯化WBSV病毒粒子，这些组识包括表皮、肌肉及鳃，利用专一于虾DNA的引物对分析，我们从这些病毒粒子中可以得到不同纯度的WSBVDNA，这些分析的例子如图13及图16所示。从肌肉提得的核酸中含有大量的WSBVDNA，但被虾DNA污染也很严重(图16，泳道9)，从感染严重的外骨骼底下的表皮纯化出的病毒粒子则是很好的起始材料，用以提取“非常纯”的WSBV基因组DNA(图16，泳道2和5)，利用专一于虾DNA的引物对及PCR反应，是第一个可以分析虾病毒基因组DNA制备中虾DNA污染与否的工具。利用专一于WSBVDNA的引物对，所有纯化出的WSBV基因组DNA样品都可产生如预期中1447bp的DNA片段的扩增产物，从自然界有白点的病虾及用WSBV人工感染的病虾组织中提得的核酸，亦可得到同样大小的PCR产物，但从临床上健康的虾体提得的核酸则无正反应的结果，这些结果证明目前研究设计的这些专一于WSBVDNA的引物对其专一性非常高。另外，1447bpPCR产物可制备专一于WBSV核酸的探针，利用斑点印迹杂交法检测虾中WBSV的感染情况，如图19。实际上，目前的研究提供了三种足以筛检对虾感染WSBV与否的有效检测方法，如图17、19、20。利用PCR(图17)及Southern杂交(图20)，我们证明导致不同虾体产生白点症的病原实际上十分相近，筛检WSBV感染的虾需要立刻进行，以避免这种病毒疾病进一步扩散。另一方面，目前研究中开发的PCR诊断WSBV的方法，提供了有效的工、具用于比较虾无包含体杆状病毒间的关系，如日本的PV-PJ(Inouyeetal(1994)，supra)、中国大陆的HHNBV(Caietal.，J.Fish.China，19112-117，1995)、泰国的SENBV(Wongteerasupayaetal.(1995)，supra)、目前分离出的PmNOBIII及其他甲壳类的无包含体杆状病毒。根据上述描述，在不背离本发明的实质和范围内可以作出各种改动和变化是显而易见的。因此应理解的是本发明可以以不同于已具体描述的方式进行实施。表1PmNOBIIISalI(pms)和PmNOBIIIHindIII(pmh)基因文库的克隆中的插入片段的大小(kb)续表1</tables>续表1续表1续表1</tables>续表1续表1</tables>续表1续表1</tables>续表1续表1续表1</tables>续表1续表1续表1续表1</tables>续表1续表1续表1</tables>续表1序列表(1)一般信息(i)申请人郭光雄王重雄罗竹芳(ii)发明名称白点症杆状病毒的鉴定、纯化及检测(iii)序列数13(iv)通讯地址(A)收信人(B)街道(C)城市(D)州(E)国家(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5寸软盘，1.44M内存(B)计算机IBMPC、386兼容机(C)操作系统MS-DOS5.0(D)软件PE2(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号(B)申请日(viii)代理人信息(A)姓名(B)注册号(C)编号/文档号(ix)通讯信息(A)电话(B)传真(C)电传(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)长度1461bp(B)类型核酸(C)链性双链(只示出一条链)(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)最初来源(A)生物体WSBV(白点症杆状病毒)(B)病毒株PmNOBIII(vii)现来源(A)文库(B)克隆(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(xi)序列描述SEQIDNO1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATTCGACGGAGTT60GACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGAT120TCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGC180TTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCC240ATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA300GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAA360ATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAAC420ATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGG480ACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTC540TCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT600GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCC660AAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAAC720GAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATG780AACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAG840GTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA900AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAAT960GGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTC1020CTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCT1080CGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTT1140CTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1200TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTC1260GAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGGATATCCTCAACGATATCGAA1320CGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGTCCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCT1380CTAGCTATCAAGAGAGAATTCAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAAC1440ATTACACCCGCATTAGTCGAC(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)长度1447bp(B)类型核酸(C)链性双链(只示出一条链)(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)最初来源(A)生物体WSBV(白点症杆状病毒)(B)病毒株PmNOBIII(vii)现来源(A)文库(B)克隆(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(ix)特征(A)名称/关键词(B)位置(xi)序列描述SEQIDNO2ACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATTCGACGGAGTTGACCCAGC60CTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATAC120AAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAA180GAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCA240CAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGA300GCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGC360CACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAA420GATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAAT480GAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTC540TGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAG600TGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAAC660TGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGA720ACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCA780AACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGT840GAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAA900GGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGT960AGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTC1020AGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGA1080AAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAA1140GGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTAC1200CTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCAT1260CTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGGATATCCTCAACGATATCGAACGTAATAT1320TTCTTCTGACTATACTAACTGTCCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTAT1380CAAGAGAGAATTCAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACC1440CGCATTA(2)SEQIDNO3信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO3ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG(2)SEQIDNO4信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO4TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA(2)SEQIDNO5信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO5GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA(2)SEQIDNO6信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO6TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT(2)SEQIDNO7信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO7TGGGAAGATATGGGGAACGAAT(2)SEQIDNO8信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO8CGAAGAGTAGTGTTAGAAGAGGA(2)SEQIDNO9信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO9AGAAAGGTTAGCGAATGGACTG(2)SEQIDNO10信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO10TTGAAGAGGTCGTCAGAGCCT(2)SEQIDNO11信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO11GAAACGGTAACGAATCTGAACTG(2)SEQIDNO12信息(i)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO12CAGTCCATTCGCTAACCT(2)SEQIDNO13信息(i)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链性单链(5’-3’)(D)拓扑学线性(ii)分子类型寡聚核苷酸探针(iv)反义(xi)序列描述SEQIDNO13CGTCCCCATATCTTCCCA权利要求1.白点症杆状病毒实际上纯的病毒分离物。2.根据权利要求1的白点症杆状病毒，其中病毒包含的基因组具有如图11所示的限制性内切酶酶切片段图谱。3.根据权利要求1或2的白点症杆状病毒，其中病毒基因组合有核苷酸序列如下所示的一段SalIDNA片段。1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC4.根据权利要求1的白点症杆状病毒，其中病毒基因组包含一段具有权利要求3所示核苷酸序列的第9-1455位核苷酸部分序列的SalIDNA片段。5.根据权利要求1的白点症杆状病毒，其中病毒是PmNOBIII或与PmNOBIII相关的病原。6.从感染宿主生物中得到大量实质上纯的无包含杆状病毒的方法，其步骤如下a.从被无包含体杆状病毒感染的宿主生物体得到样品；b.用足够量的蛋白酶抑制剂处理样品以抑制无包含体杆状病毒的降解；和c.纯化病毒。7.根据权利要求6的方法，其中的纯化步骤c由离心完成。8.根据权利要求7的方法，其中的纯化步骤c由蔗糖浓度梯度离心完成。9.根据权利要求7的方法，其中蛋白酶抑制剂在离心之后除去。10.根据权利要求6的方法，其中病毒是白点症杆状病毒。11.根据权利要求6的方法，其中病毒是PmNOBIII或与PmNOBIII相关的病原。12.一种多核苷酸，包含(i)一段如下所示的核苷酸序列1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC(ii)互补于(i)的核苷酸序列的一段核苷酸序列；或(iii)可以和(i)或(ii)的核苷酸序列杂交的一段核苷酸序列。13.一种从权利要求12的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所这的核苷酸片段可以和白点症杆状病毒的基因组DNA杂交。14.根据权利要求13的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段由报道分子地高辛配基标记。15.一种权利要求12的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以在用PCR反应扩增WSBV的基因组DNA时作为引物。16.根据权利要求15的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用地高辛配基标记。17.根据权利要求13至16中任一项所述的核苷酸片段，包括146F1、146R1、146F2或146R2。18.用于检测虾体内白点症杆状病毒病毒感染的方法，包括如下步骤(a)从活虾的一只步足或血液取样；(b)利用以下的方法检测样品中的白点症杆状病毒的存在(i)用权利要求13的核苷酸片段进行Southern杂交反应；(ii)用权利要求13的核甘酸片段进行斑点杂交反应；或(iii)用权利要求15的一对引物进行PCR扩增反应。19.根据权利要求18的方法，其中所述的核苷酸片段用报道分子地高辛配基标记以用于斑点杂交反应。20.一种多核苷酸，包含(i)下列序列中第9至第1455位核苷酸的一段核苷酸序列；1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC(ii)互补于(i)的核苷酸序列；或(iii)可以和(i)或(ii)的核苷酸序列杂交的一段核苷酸序列。21.一种由权利要求20的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以和白点症杆状病毒基因组DNA杂交。22.根据权利要求21的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用报道分子地高辛配基标记。23.根据权利要求22的由多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以在用PCR反应扩增白点症杆状病毒的基因组DNA时作为引物。24.根据权利要求23的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用报道分子地高辛配基标记。25.根据权利要求21至24的任一项所述的核苷酸片段，包括146F1、146R1、146F2或146R2。26.用于检测虾体内白点症杆状病毒病毒感染的方法，包括如下步骤(a)从活虾的一只步足或血液中取样，(b)利用以下的方法检测样品中白点症杆状病毒的存在(i)用权利要求21的核苷酸片段进行Souther杂交反应；(ii)用权利要求21的核苷酸片段进行斑点杂交反应；或(iii)用权利要求23的一对引物进行PCR扩增反应。27.根据权利要求26的方法，其中核苷酸用报道分子地高辛配基标记以用于进行斑点杂交反应。全文摘要本发明涉及一种感染节肢动物，特别是虾类的新病毒性病原体的鉴定、纯化及检测。该病毒命名为WSBV(白点症杆状病毒)。构建了两个WSBV基因组文库，并由其中一个克隆片段的DNA序列设计出专一性引物对，可用于PCR扩增反应以检测对虾类是否受WSBV感染。本发明的结果提供了一有效的检测工具，适用于筛检白点症杆状病毒的带原生物体，特别是虾类，从而可避免此病毒性疾病的进一步蔓延。文档编号C07K14/01GK1155009SQ9610281公开日1997年7月23日申请日期1996年4月5日优先权日1996年1月17日发明者郭光雄,王重雄,罗竹芳申请人:郭光雄,王重雄,罗竹芳