修饰和嵌合的超抗原及其用途的制作方法

专利名称：：修饰和嵌合的超抗原及其用途的制作方法本申请已通过瑞士专利中请NO9601245-5和美国专利申请08/695,692获得优先权，它们是分别于1996年3月29日和1996年8月12日提交的，在此均被引入作为参考。发明领域本发明是关于具有功能活性的修饰超抗原，它是野生型超抗原(SAI)，其中一个或几个氨基酸残基被取代，但仍然保留超抗原功能。当一个或几个这种取代残基(或者是其一个保守的氨基酸残基)出现在另一个野生型超抗原(SAII)相应的位置时，此修饰的超抗原被称为嵌合体(有时称为杂种分子)。嵌合超抗原因此将包含有来自至少二个不同野生型超抗原的部分序列/区段。所谓“相应的”意指，相互取代的残基，部分序列和区段在超抗原I和II中具有功能上相同的位置，这样，取代将导致形成能象超抗原一样行使功能的嵌合体形式。专门术语移植(grafted/grafting/graft)可用于连接超抗原II完整序列的各部分，此超抗原II已具有被取代的超抗原I的相应部分，即使是仅有单独一个氨基酸被取代了。修饰/嵌合超抗原也包括以其它方式修饰的功能性超抗原，例如，在除了与本发明有关的其它各区域内通过氨基酸取代进行修饰，结合于一个寻靶部分，当该部分是多肽/蛋白质时，也包括构成融合形式。实施修饰的程序也可以改变。见下文。超抗原根据最初的定义(大约1988-1993)，超抗原是细菌或病毒蛋白质，它能够与II类MHC(MHCClassII)抗原结合而无需经过细胞内预先处理，并能够通过与T细胞受体(TCR)的β-链可变区(Vβ)结合而被激活T细胞。这种结合将导致T细胞相当大部分/亚群的Vβ系有限制的激活，并且导致IJ类MHC表达细胞的溶解(超抗原依赖性细胞介导的细胞溶解＝SDCC)。葡萄球菌肠毒素(SEA，SEB，SEC1，SEC2，SED，SEE和SEH)是符合上述定义的被熟知的野生型超抗原。另一些实例有中毒性休克症毒素1(TSST-1，也来源于葡萄球菌)，剥落毒素(Exft)，链球菌热原外毒素A，B，和C(SPEA，B和C)，小鼠乳房肿瘤病毒蛋白(MMTV)，链球菌M蛋白，产气荚膜梭菌肠毒素(CPET)，关节炎支原体超抗原等。有关超抗原及其特性的综述参见文献Kotjin等1993。在九十年初曾发现，在超抗原与能够结合于细胞表面结构的寻靶部分结合的情况下，激活和随后的细胞溶解，可能以不依赖II类MHC的方式进行(DohlstenetalWO9201470和AbrahmsenetalWO9601650)。当靶细胞(携带有适合寻靶部分的靶标结构)和效应细胞(T细胞)与此结合物共同温育时，靶细胞将被溶解(超抗原抗体依赖性细胞介导的细胞溶解＝SADCC)，完全不需要II类MHC的表达。根据当前有关超抗原的概念以及在本发明中的应用，如果不另行说明，它应包括能够结合于细胞表面结构(靶标结构)和一条以上多形TCR链，特别是Vβ链的任何化合物(优选的是多肽结构)，并因此而能够激活涉及此结合过程的，表达特异性TCR链的T细胞亚群。这些T细胞将因此而变成对携带有表面结构(靶标结构，靶细胞)的细胞具有细胞毒性。通常被激活的T细胞亚群占T细胞个体总量的约1-20％。技术背景-利用突变和嵌合的超抗原进行的结构功能研究。对包含有点突变形式的嵌合超抗原，以前曾有论述(KappleretalWO9314364，Kappleretal1992，Grossmanetal1991，Hufnagleetal1991，Hartwigetal1993，Fraseretal1993，Mollicketal1993，Irwinetal1992，Hudsonetal1993，和Blancoetal1990)。Mollicketal和Hudsonetal根据对嵌合体的研究显示，SEA和SEE的Vβ特异性定位在存在于羧基末端区域的某些氨基酸序列中(即氨基酸残基200，206和207)。除了主要取决于此区域的Vβ特异性之外，Molliketal还能够证明，为了完全重组与SEA同样活性的SEE，并且此SEA包含有针对Vβ8的SEE移植体，需要一个来自SEE的，含有N-末端70个氨基酸残基的片段。此片段含有类似SEE的II类MHCα链结合位点部分，并且，包含有来自SEE这部分的嵌合SEA/SEE分子，以类似于SEE的方式抑制了SEA对II类MHCDRl的结合。最近，已有入描述了一种SEE-SEA嵌合体，它包含有，与对TCRVβ结合有关的区域交换(Lamphaeretal，J.Immunol.156(March15，1996)2178-2185)。在ABRF’96BiomolecularTechmiquts，HolidayInnGoldenGateway，SanFrantisco，CalifbniaMarch30-April2，1996(Biorketal，M45)中，已对SEE超抗原Fab抗体融蛋白作了论述，其中与T细胞相互作用有关的SEE功能区，已被用相应的非同源SEA功能区代替了。技术背景-超抗原的治疗用途已建议将非结合的超抗原用于治疗，推测它可能是通过免疫系统的普遍激活而具有治疗作用(KallandetalWO9104053，TermanetalWO9110680andWO9324136，Newalletal1991)还有人建议使用结合于寻靶部分的修饰超抗原(DohlstenetalWO9201470，AbrahmsenetalWO9601650，二者均被引入作为参考)。这样有可能通过Vβ获得T细胞激活的广泛治疗用途。迄今研究的结合物具有减弱的II类MHC亲和性，并因此又导致降低了通常与天然超抗原有关的严重的全身性毒性。Termanetal(WO9110680，WO9324136)曾暗示建议以修饰的超抗原和超抗原片段用于癌症治疗。Kappleretal(WO9314634)曾建议使用经突变丧失了其对Vβ或对II类MHC结合亲和性的非结合超抗原(SEB)(从疫苗的角度，并设法中和超抗原的毒性作用)。Abrahrmsenetal(WO9601650)建议，以对II类MHC抗原具有经修饰的结合亲和性的结合超抗原用于癌症治疗，优选的是降低了结合亲和性的超抗原。这类修饰包括单一突变，以及构造不同超抗原间的嵌合体。本发明将解决的作为目标的问题正常情况下的人群血清含有高滴度的超抗原抗体。例如对于葡萄球菌超抗原，相对滴度是TSST-1＞SEB＞SEC1＞SE3＞SEC2＞SEA＞SED＞SEE。这些相对滴定显示在非经肠道给予SE3情况下的免疫原性问题，以及与中和抗体有关的问题。若仅仅根据这些问题，SEE应该是优选的葡萄球菌超抗原。但是，根据以融合蛋白进行的工作，我们已发现，对于T细胞II类MHC非依赖性细胞毒性，超抗原-抗体依赖性细胞的细胞毒性(SADCC)，SEE结合物的能力很差。抗SE的滴度还表明，将一个“高滴度”的超抗原修饰成更像“低滴度”的超抗原可能更有利。本发明的目的第一个目的是，在降低其免疫原性，以及与中和抗原体反应的方面，对以前已知的超抗原进行改进。第二个目的是，提供当用作药物时具有较小副作用的超抗原。第三个目的是提供经改进的超抗原，在治疗患如下疾病的哺乳动物中可用作活性成分癌症，自身免疫性疾病，寄生虫感染，病毒感染，或其它与细胞有关的疾病，在这种细胞的表面能表达II类MHC抗原和/或结构，此抗原和结构对于相应的疾病是特异性的，并且能与掺入超抗原的寻靶部分相结合。导致本发明的发现SEA和SEE的序列同源性分析(图2)揭示，不相同的氨基酸残基都集中在8个不同的区域。在此8个区域之外，构成序列的34％，这二种SE3的同质性为97％，并且保守氨基酸的取代造成剩余的差异。其中4个区域结构上与二个II类MHC结合位点靠近(BAA37-50，D71-78，E136-149，和G189-195)，并且似乎不与TCR相互作用。另外的4个区域(AAA20-27，C60-62，F161-176和H200-207)位于分子的边缘，在推测的TCR结合位点的附近，假定存在于二个亚结构域之间的凹槽中。通过对各个区域进行移植(替换不同的氨基酸残基)，现在我们发现，SEA结合物诱发细胞毒性反应的特性，以及在不存在II类MHC时促进强增殖反应的特性，是存在于SEA的TCR结合功能区中的一个区域内。此区域(A)可以转移给SEE，并且，虽然它对超抗原的Vβ特异性仅有有限的作用，但当II类MHC不存在时对活性有很大的影响(图6，表2)。所有的区域(A，C，F和H)似乎都直接或间接地参与同TCR的相互作用，对鼠T细胞杂交瘤的不同刺激作用证明了这点(表2)由于相似的作用模式因此可以想象到，这些TCRVβ结合特性的类似结构差异，对于与SEA和SEE相似的超抗原也是显而易见的。同样的情况也可能适用于以不同方式组织连接结构的其它类型超抗原，我们的发现已经使我们能够设计构建，作为治疗药剂可能具有极大价值的嵌合超抗原。本发明本发明的第一方面是一种用于治疗哺乳动物疾病的方法，是通过给予治疗有效(免疫激活)剂量经修饰的，优选的是嵌合的超抗原来激活其免疫系统。哺乳动物优选的是人。所述的疾病几乎都与在其表面能表达结合于超抗原的靶结构的细胞有关。在绝大多数情况下，这种靶结构是不同于正常与超抗原结合的TCR抗原表位。结合于靶结构之后，则也有可能与TCR结合并激活T细胞。其例证性实例是II类MHC抗原和可能在与病程有关的细胞上被表达的其它细胞表面结构。包括任何类型癌症的恶性肿瘤(如癌，肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤等)，病毒感染，寄生虫感染和自身免疫性疾病是例证性疾病。需治疗的癌可能位于结肠，乳房，子宫颈，肾，胃，小肠，十二指肠，前列腺，睾丸，皮肤，肺，肝，胰腺，骨骼等部位，还包括在不同部位转移的癌，本发明的活性剂还可以用于所谓的多药物抗性型癌。表达靶结构的细胞还可能是以某种方式控制或调节所治疗疾病发展的细胞。本方法的特征性特点是可以采用一种修饰的超抗原，其中在某一区域(区域I)中一个或多个氨基酸残基被各自的氨基酸取代，该区域在野生型超抗原(SAI)中提供了通过多型性TCR链，特别是TCRVβ与T细胞亚群结合，用于取代的氨基酸残基仍然保有对如此修饰的超抗原的超抗原活性。目前优选的实施方案是一种嵌合的超抗原，其中在第一个野生型超抗原(SAI)的一个区域(区域I)内，一个或几个氨基酸残基已被第二个野生型超抗原(SAII)的一个相应的区域(区域II)内相应的一个或几个氨基酸残基取代了。区域I和II的差别在于其氨基酸序列不同。如此选择超抗原I和II，是为了使区域I和II能够相互取代而不丧失超抗原功能。就此而言必须考虑到如下事实虽然当同决定TCR结合和T细胞激活的其它区域一起交换时，结果可形成具有功能活性的超抗原，但是某种区域I单独可能不能同另一野生型超抗原的相应区域交换。这些有关的区域通常含有20以下氨基酸残基，特别是对于类似于SEA的超抗原。取代的氨基酸残基因此不同于被取代的残基，并且想象还可能包括保守性取代和其它的氨基酸取代，这将导致功能活性修饰的超抗原能与TCRVβ结合，并激活T细胞亚群。这意味着，此创造性修饰的超抗原，在其最广义上包括在上述区域内一个或几个氨基酸已被功能上取代的任何修饰超抗原。名词“保守性取代”指的是，以一个化学相似的残基取代一个氨基酸残基，例如，以一个疏水性残基取代另一个不同的疏水性残基，以一个带电荷的残基取代另一个不同的，但带同样电荷的残基等。作为超抗原I，II等，葡萄球菌肠毒素，特别是与锌配价的，目前是优选的，即SEA，SEE，SED，以及可能还有SEH。所涉及的区域可能具有上述二种功能(见标题“导致本发明的发现”和实验部分)1.本身对超抗原的活性有很大的影响，而对TCR的特异性，特别是对Vβ的特异性仅有局限的作用。对于SEA-型超抗原，指的是区域A(氨基酸位置20-27)。2.对于与多形性TCR链，如Vβ链结合的特异性，有深刻的影响。对于SEA-型超抗原，这指的是区域C(氨基酸位置60-62)，区域F(氨基酸位置110-126，以及区域H(氨基酸位置200-207)。对于类似于SEA的超抗原，这意味着具有一个或几个取代(用于从SEA移植到SEE；SEE/A嵌合体)区域AR20G，N21T，S24G，R27K区域CG60D，P62S区域FH111R，H114Q，G115Y，F117Y，G118N，S124V，G126D区域HD200G，P206S，D207N目前，对每个区域实现所有取代是优选的。对于其它超抗原，想象在相应的位置/区域之间也可能进行类似的取代。典型地可以从一个第一超抗原，如SEE和SED开始，然后，以第二超抗原(如SEA)的相应区域取代其一个或几个特有的Vβ结合区，对第一和第二超抗原优选的选择是，使在正常人血清中对第一超抗原的抗体滴度，比对第二超抗原的低。对于SEA和SEE嵌合体，最佳模型相当于嵌合体SEE/A-A，SEE/A-AH，和SEA/E-BDEG，并对SEE/A-A有绝对的偏爱。参见实验部分和插图。随同区域A，C，F和H一起，其它部分的氨基酸残基也可以被交换。一种类似交换是降低结合II类MHC的能力，因为这种特性与在超抗原治疗中(普遍性免疫激活，伴随着肿瘤坏死因子(TNF)和γ-干扰素的全身性释放)遇到的共同副作用有关。对于超抗原如SEA，SED和SEE，对与锌离子配价能力重要的位置优选地可能被改变，即位置225和227，例如在SEA中，突变的H225A以及特别是D227A，对减少毒性副作用将有阳性影响(见AbrahmsemeralWO9601650和Frasereral1993)。只要不破坏超抗原的功能，对整个分子还可以进行其它的取代作用，例如保守性取代，特别是在与结合于II类MHC和TCR有关的区域之外。为变更对II类MHC的结合而改变DNA序列或在DNA水平上发生任何其它的改变，可以在用于对TCR结合的区域改变之前或改变之后进行。这些其它类型的修饰，在区域I中氨基酸取代发生之前，可同样方便地被引入。因此从本发明的角度，根据权利要求，在着手修饰时使用的“野生型超抗原”概念，主要指的是区域I中的野生型氨基酸序列，并在其外面可能已经存在原有的修饰。根据本专业熟知的技术，可实施构建嵌合和突变的超抗原。从对一个超抗原特异性的区域转换成另一个超抗原的相应区域，可在基因水平上进行，并且可通过取代完整的序列来实现，或者通过那些在所希望的氨基酸序列中，终止序列所需要的特异性碱基的点突变来实现。参见例如实验部分以及前面引用的以往的技术文献。名词“突变”包括，通过对编码被变异蛋白质的DNA序列进行修饰而取代，插入或删除一个或几个氨基酸残基。本发明方法中使用的超抗原，可以是一个如上所述修饰的非结合超抗原，即一个缺乏特异性结合的寻靶部分，但具有借助TCR与II类MHC抗原和T细胞亚群结合的显著能力的修饰超抗原。更优选地，此修饰的超抗原，最好是嵌合超抗原，是与一个寻靶部分结合的。在后一种情况下，优选的变异体是寻靶部分和修饰超抗原之间形成的融合体。此结合物本身就是新颖的，并且是本发明的独到之处。本发明的结合物的结构类似于先前已知的抗体一起抗原结合物(DohlstenetalWO9201470，AbrahmsenetalWO9601650，此二专利文献在此均被引入作为参考)，即该结合物通常符合如下结构式T-B-SA(m)其中T代表寻靶部分，SA(m)代表如前所规定的修饰超抗原，优选的是嵌合超抗原，而B是将T和SA(m)连接在一起的共价桥。原则上T可能包含另外的超抗原部分(SA(m))，并且SA(m)也可能包含另外的寻靶部分，虽然在优选的结合物中仅存在如上面规定的一个寻靶部分和一个修饰的超抗原部分。原则上T可以是能够结合于细胞表面结构，优选的是疾病特异性结构的任何结构。T与它相对的结构通常不同于(a)SA(m)与之结合的VP链表位，也不同于(b)超抗原与之结合的II类MHC抗原表位。寻靶部分主要选自白介素(如白介素-2)，激素，抗体，包括抗体的抗原结合片段，生长因子等。参见如Woodworth，preclinicalandclinicaldevelopmentofcytokinetoxinspresentedattheconference“Molecularapprochestocancerimmunotherapy”，Ashville，NorthCarolina，November7-11，1993。目前，优选的是，T是一个抗体(全长度的抗体)，Fab，F(ab)2，FV，单链抗体和其它任何结合抗原的抗体片段)，特别突出的是针对所谓的C242抗原表位的(LindhohnetalWO9301303)，或更优选地是针对肺癌特异性5T4抗体所结合的抗原表位的抗体活性片段如Fab(SternetalWO8907947)。但是，这并不排除其它癌特异性抗体也可能同样地发挥良好的功能，或者甚至更好。名词“抗体”包括单克隆以及多克隆变异体，优选的是单克隆制备物。T还可能针对不同程度健康细胞上的，调节或控制疾病发展的独特结构。桥B可以如以前所述进行选择(DohlstemetalWO9201470，和AbrahmsenmetalWO9601650)，即B优选地将是亲水性的，并呈现有一个或几个选自酰胺，硫醚，二硫化物等的结构。最卓越的桥是那些通过重组技术得到的，即在基因水平发生的偶联作用。在这种情况下，含有亲水性氨基酸残基如谷氨酰胺(Gln)，丝氨酸(Ser)，甘氨酸(Gly)，谷氨酸(Gln)，脯氨酸(pro)，组氨酸(His)和精氨酸(Arg)的寡肽桥是优选的。特别优选的Bs是由1-10个氨基酸残基组成的肽桥，并对3-7个氨基酸残基的有绝对的偏爱。一个典型的桥是三肽GlyGlyPro，见SEQIDNo1。制备本发明新颖的结合物，原则上可按照二个主要的途径来进行1.重组技术，2.如上述所规定的，将寻靶部分T化学地连接于经修饰的，优选地是嵌合的超抗原(SA(m))。这些方法对普通的专业工作者是熟知的，并且包括许多变异形式。要使修饰的非结合超抗原与寻靶部分T化学地相连接，通常是利用这些化合物中许多位置存在的功能基因(例如伯氨基或羧基)。由此可见，最后产物将包含连接位置不同的偶联分子混合物，以及杂型-和同型-结合物。至于重组结合物(融合蛋白质)，其连接位置将是一致的。或者是将嵌合超抗原的氨基末端连接于寻靶部分的羧基末端，或者是相反。对于抗体，如完整的抗体和抗原结合片段(Fab，FV，单链抗体等)，轻链或者重链都可以用于融合，目前优选的是重组结合物，最好的是Fab片段，并且是嵌合超抗原的氨基末端连接于抗体重链的第一恒定功能区(CH1)，不排除对轻链或对VH和VL功能区的类似连接，这样也可能得到相当好的结果。用于大规模重组生产本发明修饰超抗原(融合形式以及非结合形式)的主要宿主细胞是大肠杆菌(E.Coli)。在原则上，这种宿主细胞可提供二种途径细胞内产生和分泌。后一种变异体是优选的，因为它便于从外周胞质和从培养基中纯化得到正确折叠的蛋白质。以上并不排除，也可能在其它宿主细胞，例如真核细胞如酵母或哺乳动物细胞产生活性结合物。药剂组合物，剂量和给药途径本发明的第三方面是药剂组合物，它含有如上述规定的，本发明修饰的，优选的是嵌合的超抗原(结合的和非结合的形式)。除了含有的本发明超抗原之外，设计的组合物都是本领域所熟知的。例如，该组合物可能是以冷冻干燥的颗粒物形式，无菌的或无菌生产的溶液形式，片剂，安瓿等形式。可能存在赋形剂如水(优选的是以如PBS缓冲至生理可接受的pH值)或者其它惰性的固体或液体物质。一般地说，该组合物可通过将此结合物与一种或几种赋形剂混合，溶于其中，与之结合，或者与之组合来制备，赋形剂可以是水溶性的或非水溶性的，液态的或非液态的，必要时可同时加入适当的添加剂和佐剂。绝对必要的是，赋形剂和制备条件对修饰超抗原的活性，必须没有损害性影响。正常情况下，本发明的超抗原将按预先调整配的剂量出售和给药，每份含有效量的结合物，据目前提供的结果，认为是在10ng-50mg的范围内，例如在10ng-1mg，或10μg-50mg的范围内。精确的剂量将随病情而改变，并取决于病人的体重，年令，给药途径，疾病类型，寻靶部分、超抗原，连接方式(-B-)等。给药途径将是本领域内通常使用的方法，也就是，使靶细胞杀灭有效剂量的，或者有治疗活性剂量的按本发明修饰的超抗原，与靶细胞接触。对于上面指出的适应症，这主要指的是非肠道给药，例如，对哺乳动物如人注射或输注给药(皮下，静脉内，动脉内，肌内，腹膜内)。所设计的修饰超抗原，优选地是嵌合超抗原，可以被局部或全身给药。用名词“靶细胞杀灭有效剂量”表示，此剂量对于激活和指导T细胞破坏靶细胞是有效的。目前优选的给药途径是根据DohlstemetalWO9201470和AbrahmsenetalWO9601650设计用于超抗原结合物的途径相同，这指的是每天进行1-5小时静脉内输注(优选的是4小时)，并合并给予退烧药剂(朴热息痛)。如此给药重复几天，如4天，密切注意引发针对此结合物抗体的危险性。本发明的超抗原可以作为主要的治疗给药，或者按优选的模式辅助治疗，与手术或其它药物相配合。从治疗的角度我们发现，其有纯的非共价连接抗体重链和轻链的抗体制备物，比含有其中的链是借助于胱氨酸键连接在一起的抗体制备物更优越。因此，本发明的第四方面是一种抗体制备物治疗用途，特别是一种Fab制备物，其中将各链连接在一起的半胱氨酸残基，已被不允许二硫化物形成的氨基酸如丝氨酸取代了。这方面对于本发明最优选的特异性抗体目前有C242mab(Lindholmetal，WO9301302)以及如在上述引证的文献中所规定的5T4mab。在这些优选的变异形式中，一条抗体链是与超抗原融合，如前所述此超抗原能够以Vβ特异性方式激活T细胞亚群。如前面所述或者如DohlstenetalWO9201470或AbrahnseretalWO9601650所述，该超抗原可以是一个野生型的，一个嵌合体或者一个点突变型式(及其组合)。本发明的这方面还包括上述的药剂组合物，但是它含有本发明对此规定的抗体制备物，而不是嵌合超抗原。当前优选的是应用5T4抗体的Fab片段(Sternetal，WO8907947)，并与带有突变D227A的SEE/A-A嵌合体组合。使该优选的Fab二条链中提供链间二硫键(半胱氨酸对丝氨酸)的位置发生突变。当用E.Coli生产时，为了增加抗体/融合蛋白的产率，也可以在Vkappe链中的某些位置进行突变。参见实验部分。材料和方法构造SEA/SEE嵌合基因应用基于聚合酶链反应(PCR)的方法，序列折叠延伸法进行SEA/SEE嵌合体的构建(Hortonetal)。据厂商的推荐，以U/Tme(Perkin-Elmer)施行PCR反应。将PCR产生的片段克隆进行PCR原本中(Stratagene，USA)，并进行测序，以证实序列的正确性。然后将嵌合的超抗原基因亚克隆进入表达载体PKP9889(Abrahmsenetal1995)，将SE结构融合至鼠单克隆抗体C215的Fab片段重链部分。SEA和SEE重组融合蛋白是作为全长度多肽被产生的，与信号肽断裂的共有序列相一致(VonHeijne1986)。蛋白质表达和纯化以大肠杆菌K12的UL635菌株用于表达Fab-SE融合蛋白和SEA突变体(如以前所述，Abrahmisenetal1995)。如以前所述(Abrahmsenetal1995)，通过在5000g下离心收获Fab-SE融合蛋白，上清液组分在蛋白GSepharose(pharmaciaBiotechAB，uppsala，Sweden)上进行纯化。以SDS-PAGE分析表明，亲和性纯化的Fab-SE变异体的纯度＞90％。细胞将人β-细胞的淋巴瘤细胞-Raji株和人结肠癌细胞Colo205培养在完全性R-培养基中(含有如下添加成分的RPMI-164010％胎牛血清(GibcoBRL，LifeTechnologies，Ltd，PaisleyScotland)。1mM谷氨酰胺(HycloneEurope，LtdCramlington)，5×10-3Mβ-巯基乙醇(ICNBiomedicelsINC.CostaMesaCA)，0.1MNaHCO3(SeromedBiochrome)，1×10-2MHepes缓冲液(HycloneEurope.Ltd.Cramlington)，0.1mg/ml庆大霉素(BiologicalIndustriesKibbutgBeitHaemekIsrael)，1×10-3M丙酮酸钠(HycloneEurope，LtdCramlington)。将以人C215和CD80分子转染的CHO细胞培养在添加有0.5mg/mlGeniticin(G418)(GibcoBRL，LifeTechnologies，Ltd.PaislyScotland)的完全性R-培养基中。从来自正常供血者的肝素化血中制备外周血单核细胞(PBM)。如以前所述(Dohlstemetal1991)通过在Ficoll-paque上进行密度离心将该细胞分离出。用MiniMACS柱，按照厂商说明书通过阳性选择将人T淋巴细胞纯化成均质性细胞，此柱结合了以人CD4和CD8(Milteny；BiotecGmbH，Germany)特异性单克隆抗体包被的磁珠。按以前所述(Dohlstenetal1994)的方法产生人SEA和SEE反应性细胞株。借助TCRVβ22特异性单克隆抗体(Immnnotech，France)包被的Dyna磁珠(DynalA.S.Norway)，通过阳性选择法，从初次激发的SEA反应性细胞株产生人TCRVβ22表达细胞株。如借助于流式细胞仪所测定的，富集的细胞中含有大于95％的/TCRVβ22+T细胞(数据未显示出)。鼠T细胞杂交瘤(I1B3，2B4和11.40)按以前所述的方法产生(Fleuryetal1991)。细胞毒性测定如以前所述，在作用4小时或6小时之后，按标准的51Cr释放试验测定细胞毒性(Dohlstemetal1991)。用人Colo205细胞或Raji细胞作靶细胞。以30∶1的效应细胞对靶细胞比率加入效应细胞，SEA或SEE反应性人T细胞株或者TCRVβ细胞株。将51Cr-标记的靶细胞用于细胞毒试验中，在V形底微量滴定板孔中每孔加入2500个细胞/200ml完全培养基。按所标明的加入各种浓度的C215Fab-SEA/E杂交体，g-计数器测定51Cr的释放。按如下公式计算比细胞毒性的百分率100×〔(实验释放c.p.m.-背景释放c.p.m)/(总释放c.p.m-背景释放c.p.m.)〕。淋巴细胞增殖试验在加有不同量C215Fab-SEA/E杂交体的U-形96孔微量滴定板的200ml完全培养基中，将105人应答T细胞在37℃与104个经照射的(20,000Rad)刺激物细胞共同培育72小时，以便测定其增殖作用。通过〔3H〕-胸苷的掺入来测算增殖作用(如Dohlstenetal1988所述)。对Fab-SAg诱发IL-2产生的分析在有2×104Raji刺激物细胞存在下，在含有C215Fab-SEA/E嵌合蛋白质的200ml完全性R培养基中，对鼠T-T杂交瘤细胞(105个)进行培育。48小时之后，收集上清液，并对鼠IL-2的存在进行分析。简而言之，就是用大鼠抗小鼠细胞因子单克隆抗体(mAb)作捕捉抗体来分析细胞因子的含量。纯化的大鼠抗小鼠IL-2，生物素标记的大鼠抗小鼠IL-2，rIL-2均购自pharMingen(SanDiego，CA)。以生物素标记的抗细胞因子mAb，VectastainABC试剂盒(VectorLaboratories，CA)和过氧化物酶底物试剂盒(Bio-RadLaboratories，CA)用于测定细胞因子。用ImmunoReaderNJ2000(InterMedRoskilde，Denmark)在405或450nm测定光吸收度。5T4Fab的突变构建在E.Coli内表达5T4Fab-SEA的载体编码FV的5T4部分是从5T4杂交瘤克隆产生，从DrPeterstern得到(Sternetal.WO8907947)。更详细地说是从mRNA制得CDNA，整个可变区和部分信号序列区，以及重链的第一恒定区和轻链的恒定区均借助PCR进行扩增。寡核苷酸5′-CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC-3′(EQIDNO2)和5′-ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT-3′(SEQIDNO3)用于重链，产生一个553bp的片段，而寡核苷酸5′-ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAKWYYCwGG-3′(SEQIDNO4)和5′-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3′(SEQIDNO5)用于轻链，产生一个724bp的片段。对每条链的三个不同的克隆进行测序，发现是相同的。在第二次PCR步骤中可得到适合于插入表达载体(ref)的DNA片段。为了装备Fab表达质柱，可将5T4的可变区，融合于编码来自鼠IgG1/K抗体C242mAb恒定区的序列(Limdhlometal，WO9301302)。将编码来自葡萄球菌肠毒素A(SEA)超抗原的区域融合在重链之后。结果中给出了5T4抗体VKappa链抗体构架的确证序列。5T4的诱变在编码核抗体构架的区域内导入了7个氨基酸取代。这些取代是phe10Ser，thr45Lys，Ile63Ser，Tyr67Ser，phe73Leu，Thr77Ser和Leu78Val。类似地，在二条键中与功能区二硫键有关的Cys残基被丝氨酸残基取代了，导致在重链中的Cy458Ser突变，以及在轻链中的Cys214Ser突变。这些突变是借助基于PCR的诱变而导入的，并通过测序对得到的DNA序列进行确证。5T4Fab-SEA的发酵罐表达及纯化表达质粒包含卡那霉素抗性基因和一个可以用IPTG诱导的lacUV5-启动子。用蛋白GSepherose和SP-Sepharose(phermhciaBiotec，Uppsala，Sweden)从澄清的培养基中纯化出融合蛋白质，并用SephadexG-25将其配制在柠檬酸缓冲液中，方法基本如以前所述。用SDS-PAGE，逆相HPLC和质谱法所作的品质鉴定表明，经纯化的融合蛋白质，其纯度大于95％，并且具有正确的分子量。结果超抗原的修饰作用用SEA-和SEE反应性人T细胞作效应细胞株，对C215Fab-SEA和C215Fab-SEE抗II类MHC+Raji细胞的超抗原依赖性细胞的细胞毒性(SDCC)进行分析。尽管在SEA和SEE之间存在Vβ特异性的差别，但是这二种超抗原都显示出对二种效应细胞株有类似程度的细胞毒性诱导作用(图1)。为了区别在TCR识别中II类MHC显示的作用和SEA和SEE的直接作用，对它们进行了抗C215表达Colo205细胞的超抗原-抗体依赖性的细胞毒性(SADCC)检测。在此测定中，Fab部分使融合蛋白指向C215-表达靶细胞，并导致将融合的SE分子引向不取决于II类MHC分子的细胞毒性T细胞(CTL)(Dohlstenetal1994)。尽管在SEA和SEE之间，氨基酸序列存在大于80％的相同性，但是，SEA和SEE的TCR相互作用，在这种类型的检测中显示出有质的差异。C215Fab-SEA融合蛋白保持了它使SEA和SEE反应性CTL针对II类MHC-靶细胞的能力(图1)，而C215Fab-SEE，不论是用SEA或SEE反应性CTL，都不能诱发对II-类MHC靶细胞的细胞毒性(图1)。以前曾有其它研究者报导，SEA和SEE间的Vβ特异性差别，主要与前面环中和不规则的a5螺旋中的3个氨基酸差异有关(Irwinetal1992，Hudsonetal1993，Fraseretal1993，和Mollicketal1993)。在此研究中报导的关于TCR相互作用的差异与不同的TCRVβ特异性无关，因为C215Fab-SEA诱发II类MHC非依赖性细胞毒性的能力并不局限于SEA反应性CTL，当用SEE反应性CTL时也能看到。SEA和SEE的序列相同性分析指示，不相同的氨基酸残基都集中在8个不同的区域。在此8个区域之外，构成序列34％的区域中，此2个SES的相同性为97％，并带有可解释仍然存在差异原因的保守的氨基酸取代；4个不相同的区域结构上紧靠2个II类MHC结合位点(B，D，E和G)，并且很可能不与TCR相互作用(图3)。另外的4个区域(AAA20-27，C60-62，F161-176，和H200-207)位于分子的边缘(图3)，在TCR结合位点的附近，位于2个亚功能区之间的凹陷之中(Kapperetal1992)。为了探查SEA和SEE之间在TCR识别中的本质差别，我们通过移植构建了杂交蛋白质，即从SEA将这些区域移植至SEE，作为如双区域杂交体(SEE/A-AH)的单区域嵌合体(SEE/A-A，SEE/A-C，SEE/A-F，SEE/A-H)，并且将SEE上位于II类MHC结合位点附近的区域移植至SEA(SEA-/E-BDEG)(图4)。所有嵌合的SES都作为C215Fab融合蛋白被表达，这些融合蛋白能够在II类MHC不存在时察觉它们活性的差异。在与C215Fab部分的融合过程中，SEA/E杂种蛋白质在Fab定向的细胞毒性测定中显示出差别用SEA-反应性人T细胞作效应细胞，对C215Fab-SEE/A杂交蛋白质对抗II类MHC+Raji细胞的SDCC活性进行了分析。所有C215Fab-SE杂种分子及C215Fab-SEAwt和C215Fab-SEEwt的EC50值均在容许的误差范围之内(如10-12-10-11M，图5)。唯一可测定的差异是对于C215Fab-SEE/A-AH杂种分子，其直线的平稳态稍有降低，表明反应性T细胞丧失了。另一方面，在SADCC实验中，当细胞毒性是针对II类MHC-/C215+Colo205细胞株时，只有C215Fab-SEE/A-A，C215Fab-SEE/A-AH和C215Fab-SEA/E-BDEG象C215Fab-SEAwt一样，能诱发类似的细胞毒性(图5)。在较高的浓度(EC50＞10-10M)，C215Fab-SEE/A-F杂种分子能诱发C215定向的细胞毒性。虽然C215Fab-SEE/A-H杂种分子以象C215Fab-SEAwt一样的类似的半数最高浓度(例如EC5010-13M)能诱发C215定向的细胞毒性，但是，细胞毒性的绝对水平大大降低了(图5)。这种差异可能是由于C215Fab-SEE/A-H局限的Vβ特异性的结果，而对于反应性T细胞II群，诱发C215定向的细胞毒性的能力占优势。为对这种想法作进一步探查，我们制备了人Vβ22寡克隆CTL细胞株。就人Vβ22是SEA而非SEE特异性Vβ类而言，人Vβ22与鼠Vβ3是类似的。光学已证明(Mollicketal1993)，SEAVβ和SEEVβ的大部作用，主要归咨于在SEA和SEE之间区域H中(AA200-207)3个氨基酸的差异。在针对II类MHC+Raji靶细胞的SDCC检测中，用Vβ22寡克隆的CTL细胞株作效应细胞，只有含有SEA-H区的杂种分子能够引起类似C215Fab-SEAwt的反应(例如C215Fab-SEE/A-H，C215Fab-SEE/-AH和C215Fab-SEA/E-BDEG，图6)。能够以整个CTL细胞群作效应细胞而诱发充分SDCC反应的C215Fab-SEE/A-A杂种分子，在此检测中，其半数最高浓度和平稳态浓度都大大降低了(图6)。当Vβ22CTL的细胞毒性是针对II类MHC/C215+Colo205细胞株时，只有包含SEA-A和SEA-H(例如C215Fab-SEE/A-AH和C215Fab-SEA/E-BDEG)区的杂种分子，能够诱发类似于C215Fab-SEAwt的细胞毒性反应(图6)。只含有SEA区域A(C215Fab-SEE/A-A)的杂种分子，诱发具有类似EC50值的较低水平细胞毒性反应。这表明，在以整个T细胞群作效应细胞的SADCC检测中，用C215Fab-SEE/A-H杂种分子所看到的保存活性，并不是在局限的T细胞群中杂种分子诱发反应的结果。对此发现一个更可能的解释是，C215Fab-SE杂种蛋白质诱发SADCC反应的能力主要是归咨于SEA-A区，SEA-H和SEA-F区只有次要的作用。没有证据表明这种性质仅局限于在组合的SEA-SEE反应性T细胞群中的任何T细胞亚群，因为C215FabSEA能够诱发与用SEE反应性CTLs同样的反应，并且C215Fab-SEE/A-A能够完全重现以C215Fab-SEA所看到的反应。在与C215Fab部分的融合过程中，SEA/E杂种蛋白质在Fab定向的增殖测定中显示出差别以前曾有研究显示，通过对II类MHC-/C215+/CD80+细胞株提供C215Fab-SEA，可诱导纯化的静止人T细胞进行增殖(Landoetal1993)。但是，C215Fab-SEA诱导II类MHC非依赖性增殖的能力，用C215Fab-SEE时明显地降低了(表1)。为了查明是否这种质的差异表明对SEA区域A有同样的限制，如通过SADCC所看到的，我们对C215Fab-SE杂种分子的促增殖能力进行了检测，是通过CHODR1+/CD80+或者CHO-C215+/CD80+转染的细胞株将此杂种分子提供给纯化的静止人T细胞。当把Fab-SE结合物提供给CHO-DR1+/CD80+，在不同的SE蛋白质之间未发现任何差异(数据未显示)。但是，在SEE中SEA的区域A，C，和H移植物，可增强其增殖活性，达到与C215Fab-SEE相类似。通过移植SEA的区域A和H得到了最佳的结果，这表明区域A有重要的作用，如对于II类MHC非依赖性细胞毒性所看到的。通过应用阴性选择法，有可能Fab-SEA和Fab-SEE间的差异变得更显著。SE-杂种分子的Vβ特异性为了进一步探明C215Fab-SEA/SEE杂种分子融蛋白质是否与某种Vβ特异性有关，我们使用了表达Vβ1，Vβ3和Vβ11的SEA反应性鼠T细胞杂交瘤。从得到的数据表明，被探查的所有区域均直接或间接地影响其与TCR的相互作用。通过在C215Fab-SEE中移植SEA的区域C和F，使针对SEA和SEE交叉反应性Vβ1，杂交瘤I1B3的活性遭到破坏。与C215Fab-SEE相比较，相同的嵌合体对Vβ3和Vβ11杂交瘤(2.B4和11.40)的活性似乎没有，或仅有微小的作用。通过在C215Fab-SEE中移植SEA的区域A，可使针对Vβ3(2.B4)的活性，与C215Fab-SEE相比较至少提高至100倍。以相同的细胞株，通过在C215Fab-SEE中移植SEA的区域H，观察到更显著的作用。在以前的研究中也已注意到这种借助SEA的区域H影响Vβ3特异性的显著作用(Mollicketal1993)。但是，同样的嵌合体(C215Fab-SEA/A-H)似乎使其针对SEA/SEE交叉反应性Vβ1和Vβ11杂交瘤(I1B3和11.40)的活性降低至1/10。总之，SEA与TCR的相互作用似乎涉及到整个SEA-SEE，可变区A，C，F和H。血清反应性用来自全世界不同区域的混合血清样品及单个人的血清样品，研究了人血清样品对嵌合SEs的血清反应性。通过在SEE中移植SEA的区域A区和H，我们获得了中等程度的血清反应性(图8)。还观察到对抗嵌合体C215Fab-SEE/A的类似的血清反应性。但是，SEE中单独移植物SEA区域A(C215Fab-SEAE/A-A)仅给出类似C215Fab-SEE的血清反应性，表明SEA的区域H区对保持的抗C215Fab-SEE/A-AH血清反应性起决定性作用。这表明，SEA的区域H是SEA中占优势的抗原表位部分。从来自世界其它地区(日本和美国)的混合血清样品，以及来自瑞典的14个单独血清样品的血清反应性部确证了这种相同的普遍模式(数据未显示)。结果融合蛋白质Fab部分的突变5T4FabSEA-构建物的表达发现在发酵罐中E.Coli的5T4Fab-SEA产量水平显著低于我们实验室以前研究的其它Fab超抗原结构的产量水平。为了增加产量水平，因而引入了两种类型的修饰作用。首先是在轻链的构架区引入了7个不同的点突变。它们是phe10Ser，Thr45Lys，Ile63Ser，Tyr67Ser，phe73Leu，Thr77Ser和Leu78Val。第二是，构成连接重链和轻链间二硫键的半胱氨酸残基被丝氨基残基取代了。后一种修饰作用导致产量水平增加至3倍，而7个点突变导致另外12倍的增加。除了显著地增加产量水平外，删除二硫键还能产生更均一的产品，因为这些反应性硫醇基与其它含硫醇试剂反应的可能性被排除了。检查了修饰的5T4分子对其抗原的亲和性以及在SADCC中的生物活性。在这些试验中，未能检测出在突变形式和野生型形式之间有任何差异。在其它几个单克隆抗体Fab片段的重链和轻链中也实施了Cys/Ser突变。产物变成均质性，并且充分保留了抗原结合能力。5T4Vkappa链抗体构架区的序列DAVMTQTPTFLLVSAGDRVTITCKASOSVSNDVAWYQQKPGQSPTLLISY50TSSRYAGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTLQAEDLAVYFCOODYNSPPTFGG100GTKLEIK(SEQIDNO6)底下划线的序列是CDRs。粗体字位置发生了突变phe/oSer，Thr45Lys，Ile63Ser，Ile63Thr，Tyr67Ser，phe73Leu，Thr77Ser，Leu78Val表1</tables>表图1以人SEE和SEACTL测定的II类MHC依赖性和非依赖性细胞毒性。以C215Fab-SEA(■)和C215Fab-SEE(▲)作效应分子的II类MHC依赖性细胞的细胞毒性(A和B)，以及C215依赖性细胞的细胞毒性(C和D)。用SEE-反应性人T细胞株(A和C)及SEA-反应性人T细胞株(B和D)，按标准的4小时51Cr释放测定法分析细胞毒性。靶细胞株是II类MHC+/C215-Raji细胞(A和B)和II类MHC-/C215+Colo205细胞(C和D)。数据来源于代表2次(A和C)至5次(B和D)独立试验的单独测定结果。图2.SEA和SEE的同质性排列SEA/SEE可变区紧靠TCR结合位点(A，C，F和H)，并且可变区紧靠二个II类MHC结合位点。图3.SEA的卡通模型SEA晶体(Schadetal1995)的分子绘制模型(Molscriptmodel)(Kraulis.1991)。SEA/SEE可变区紧靠TCR结合位点(A，C，F和H)，并且可变区紧靠二个II类MHC结合位点。锌离子以园球表示。图4.嵌合SE分子的示意图表示对SEA序列的伸展作了压缩，SEA/SEE可变区以A，B，C，D，E.F，G和H表示。图5.以人SEA反应性CTL测定的II类MHC依赖性和非依赖性细胞毒性C215Fab-SEE/A-A(◆)，C215Fab-SEE/A-C(□)，C215Fab-SEE/A-F(◇)，C215Fab-SEE/A-H(●)，C215Fab-SEE/A-AH(△)，和C215Fab-SEA/E-BDEG(○)的(A)II类MHC依赖性细胞的细胞毒性和(B)C215依赖性细胞的细胞毒性。用SEA-反应性人T细胞株，按标准的4小时51Cr释放测定法分析细胞毒性。靶细胞株是II类MHC+/C215-Raji细胞(A)和II类MHC-/C215+Colo205细胞(B)。数据来源于代表5次独立试验的单独测定结果。图6.用人Vb22+CTL测定的II类MHC依赖性和非依赖性细胞毒性以C215Fab-SEA(■)，C215Fab-SEE(◆)，C215Fab-SEE/A-A(◆)，C215Fab-SEE/A-C(□)，C215FabSEE/A-F(◇)，C215Fab-SEE/A-H(●)，C215Fab-SEE/A-AH(△)，和C215Fab-SEA/E-BDEG(○)作效应分子的(A)II类MHC依赖性细胞的细胞毒性及(B)C215依赖性细胞的细胞毒性。用Vb22选择的SEA反应性人T细胞株，按标准的4小时51CT释放测定法分析细胞毒性。靶细胞株是II类MHC+/C215-Raji细胞(A)和II类MHC-/C215+Colo205细胞(B)。数据来源于代表2次独立试验的单独测定结果。图7.II类MHC依赖性和非依赖性细胞增殖作用。(在优先申请中未提供)Fab-SE杂种分子对II类MHC依赖性(A)和非依赖性(B)T细胞增殖的作用。以对II类MHC+/C215-CHO-DR4/C215转染子(A)和对II类MHC-/C215+CHO-CD80/C215转染子(B)提供的C215Fab-SEA(■)，C215Fab-SEE(◆)，C215Fab-SEE/A-A(◆)，C215Fab-SEE/A-C(□)，C215Fab-SEE/A-F(◇)，C215Fab-SEE/A-H(●)，C215Fab-SEE/A-AH(△)和C215Fab-SEA/E-BDEG(○)，刺激纯化的人T细胞96小时。在72小时之后，对细胞加入〔3H〕-胸苷，作用24小时，测定掺入的标记，以半数量最高浓度(EC50)表示。数据来源于代表2次独立试验的单独测定结果。图8.在混合人Ig中的血清反应性来自南欧健康供血者的5000份以上抗C215Fab-SE融合蛋白质血清的混合物。使杂列稀释的人Ig在室温下分别与C215Fab-SEAwt，C215Fab-SEEwt，C215Fab-SEE/A-A，C215Fab-SEE/A-H和FabSEE/A-AH相互作用1小时。以1ng/孔的浓度固相化在微量滴定板上。通过在每个点扣除对C215Fab的OD值，对结合于血清蛋白的C215Fab进行校正。各点代表二份样品的平均值。进一步的详情参见“材料和方法”表1.以对II类MHC阴性的CHO-CD80/C215转染子提供的各种C215Fab-SE，刺激纯化的人T细胞96小时。在72小时之后，对细胞加入3H-胸苷，作用24小时，测定掺入的标记，以半数最高浓度(EC50)表示。表2.以天然的或者嵌合的Fab结合的超抗原，刺激鼠T细胞杂交瘤48小时。以IL-2的产生来测定其活性，以半数最高浓度(EC50)表示。前一年期间的工作为了使超抗原嵌合抗体融合C242Fab-SEE/A-A的毒性降低至最小，如在WO9601650所述，使嵌合体SEE/A-A在II类MHC结合位点发生突变，并与C215Fab融合。结构是C215Fab-SEE/A-A-D227A，C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-H187A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-W130A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A，C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A和C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A。对所有的融合测定了它们诱发人PBMC增殖的能力，以便鉴定与C215Fab-SEE/A-A-D227A相比较具有降低活性的突变体。对于C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A，C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A和C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A观察到降低的增殖活性。对某些嵌合型融合还在人正常血清中测定了其抗体滴定(C215Fab-SEE/A-A-D227/A，C215Fab-SEE/A-AD70A/D227A和C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A)。与C215Fab-SEE-D227A和C215Fab-SEE-D227A进行了比较。相对于C215Fab-SEA-D227A，各受试嵌合体的滴定都非常低。相对于C215Fab-SEE-D227A，各受试嵌合体的滴定都略高些。这意味着，在相当于位置47，50，70，130，187，227的1个或几个位置，优选的是2个位置发生了取代，如图2中在SEQIDNO7和8中所限定的。因为在这里所阐明的本发明概念的范围内，还可能设计许多变化的和不同的实施方案，并且因为，还可以根据所描述原理的要求，对在此详述的实施方案进行修改，所以应该认为，在此的详述将被理解是例证性的，而没有限制性含义。参考文献AbrahmsenLetal(1995)对超抗原葡萄球菌肠毒素A中二个不同的II类MHC结合位点的特性鉴定。EMBOJ142978-86。Abrahmsenetal(1996)WO9601650(专利申请)。修饰超抗原和寻靶化合物间的一种结合物，以及该结合物的用途。AntonssonPetal(1996)在用于肿瘤治疗中具有降低了血清反应性并保持了定向细胞毒性T细胞能力的葡萄球菌肠毒素A和E嵌合体。ABRF′96BiomoleculerTechniques，HolidayInnGoldenGateway，SanFrancisco，California.March30-April2，1996。Dohlstemetal(1988)用Leu-18和UCHL1单克隆抗体可分辨具有不同的产生IL-2和γ-干抗素能力的人外周血CD4+T辅助细胞的二个亚群。EurJImmunol181173-1178。Blancoetal(1990)葡萄球菌毒素休克症毒素1的突变体通过中和单克隆抗体的促有丝分裂性和识别作用。Infect.Immun.58(1990)3020-3028。DohlstenMetal(1994)单克隆抗体一起抗原融合蛋白用于基于T细胞肿瘤治疗的肿瘤特异性药剂，ProcNatlAcadSciUSA918945-8949。DohlstenMetal(1991)单克隆抗体定向的超抗原一种不同类型的抗肿瘤药剂。ProcNatlAcadSciUSA889287-9291。Dohlstenetal(1992)WO9201470(专利申请)。靶标特异性抗体-超抗原结合物及其制备。FleurySetal(1991)CD4和II类MHC间相互作用的突变分析II类抗原，Cell661037-49。FraserJDetal(1993)葡萄球菌肠毒素A与II类MHC抗原相互作用的结构模型·InHuber，BTPalmer，E(eds)CurrentCommnnicationsinCellandMolecularBiology7.ColdSprmgHorbourLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.PP7-29。Grossmanetal(1991)葡萄球菌肠毒素A中二硫环的突变。对T细胞识别的影响。J.Immunol1473274-3281。HartwigUFetal(1993)影响超抗原链球菌红斑毒素A与II类MHC结合的突变作用。Int.Immunol、5(8)869-875。HortonRMetal(1990)通过重叠延伸反应的基因剪接借助聚合酶链反应裁制的基因。Biotechniques8528-535。Hudsonetal(1993)在葡萄球菌肠毒素A和E中二个邻近的残基决定β-T细胞受体V的特异性。J.EXPMed177175-184。HufnagleWOetal(1991)A型葡萄球菌肠毒素的羧基末端区域是具有充分活性的分子所需要的。InfecImmn，592126-2134，IrwinMJetal(1992)肠毒素的一些残基决定T细胞受体Vb结合特异性，Nature359841-3Kallandetal(1991)WO9104053(专利申请)使细胞表达II类MHC抗原的药剂组合物是针对毒性细胞的。KapplerJWetal(1992)确定超抗原葡萄球菌肠毒素B功能范围的突变。JEXPMed175387-396。Kappleretal(1993)WO9314634(专利申请)，突变超抗原的保护作用。KotjinBLetal(1993)超抗原及其在人类疾病中的潜在作用。AdvImmunol5499-166。KraulisPJ(1991)MOLSCRIPT绘制蛋白质结构详细图形和模式图的程序。JApplCryst24946-950。LemphearJGetal(1996)葡萄球菌肠毒素E靠近氨基末端和羧基末端的残基独立地介导TCRVβ-特异性相互作用。Jlmmunol1562178-2185(March15，1996)。LandoPAetal(1993)IJ类MHC非依赖性T细胞增殖需要B7和被针对超抗原的共同刺激作用，但其细胞毒性不需要，Immaunology80236-241。Lindholmetal(1993)9301302(专利申请)。肿瘤，碳水化合物抗原特异性单克隆抗体和细胞株。MollickJAetal(1993)在细菌超抗原上决定T细胞受体β链特异性位点的定位。J.EXPMed177283-293。Newalletal(1991)在体内试验中，通过葡萄球菌肠毒素B激活T细胞，可阻止恶性肿瘤的过度生长。ProcNatlAcadSciUSA881074-1078。SchadEMetal(1995)超抗原葡萄球菌肠毒素A型的晶体结构。EMBOJ143292-3301。Sternetal(1989)WO8907947(专利申请)。与抗原有关的一些改进。Termanetal(1991)WO9110680(专利申请)。肠毒素及相关化合物的杀肿瘤作用。Termanetal(1993)WO9324136(专利申请)。肠毒素及相关化合物的杀肿瘤作用。VonHeijne，G(1986)预测信号序列断裂位点的新方法。NncleicAcidRes，14，1883-1490。序列表(2)SEQIDNo1的信息(i)序列特征(A)长度3个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNo1GlyGlyPro1(3)SEQIDNo2的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQIDNo2CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC(4)SEQIDNo3的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQIDNo3ACTAGTCGACATGGATGGAGCTTTATCATIYTCTT(5)SEQIDNo4的信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQIDNo4ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG(6)SEQIDNo5的信息(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQIDNo5GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA(7)SEQIDNo6的信息(i)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNo6AspAlaValMetThrGlnThrProThrPhe1510LeuLeuValSerAlaGlyAspArgValThr1520IleThrCysLysAlaSerGlnSerValSer2530AsnAspValAlaTrpTyrGlnGlnLysPro3540GlyGlnSerProThrLeuLeuIleSerTyr4550ThrSerSerArgTyrAlaGlyValProAsp5560ArgPheIleGlySerGlyTyrGlyThrAsp6570PheThrPheThrIleSerThrLeuGlnAla7580GluAspLeuAlaValTyrPheCysGlnGln8590AspTyrAsnSerProProThrPheGlyGly95100GlyThrLysLeuGluIleLys105(8)SEQIDNo7的信息(i)序列特征(A)长度233个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNo7SerGluLysSerGluGluIleAsnGluLysAspLeu510ArgLysLysSerGluLeuGlnGlyThrAlaLeuGly1520AsnLeuLysGlnIleTyrTyrTyrAsnGluLysAla253035LysThrGluAsnLysGluSerHisAspGlnPheLeu4045GlnHisThrIleLeuPheLysGlyPhePheThrAsp505560HisSerTrpTyrAsnAspLeuLeuValAspPheAsp6570SerLysAspIleValAspLysTyrLysGlyLysLys7580ValAspLeuTyrGlyAlaTyrTyrGlyTyrGlnCys859095AlaGlyGlyThrProAsnLysThrAlaCysMetTyr100105GlyGlyValThrLeuHisAspAsnAsnArgLeuThr110115120GluGluLysLysValProIleAsnLeuTrpLeuAsp125130GlyLysGlnAsnThrValProLeuGluThrValLys135140ThrAsnLysLysAsnValThrValGlnGluLeuAsp145150155LeuGlnAlaArgArgTyrLeuGlnGluLysTyrAsn160165LeuTyrAsnSerAspValPheAspGlyLysValGln170175180ArgGlyLeuIleValPheHisThrSerThrGluPro185190SerValAsnTyrAspLeuPheGlyAlaGlnGlyGln195200TyrSerAsnThrLeuLeuArgIleTyrArgAspAsn205210215LysThrIleAsnSerGluAsnMetHisIleAspIle220225TyrLeuTyrThrSer230(9)SEQIDNo8的信息(i)序列特征(A)长度233个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNo8SerGluLysSerGluGluIleAsnGluLysAspLeu510ArgLysLysSerGluLeuGlnArgAsnAlaLeuSer1520AsnLeuArgGlnIleTyrTyrTyrAsnGluLysAla253035IleThrGluAsnLysGluSerAspAspGlnPheLeu4045GluAsnThrLeuLeuPheLysGlyPhePheThrGly505560HisProTrpTyrAsnAspLeuLeuValAspLeuGly6570SerLysAspAlaThrAsnLysTyrLysGlyLysLys7580ValAspLeuTyrGlyAlaTyrTyrGlyTyrGlnCys859095AlaGlyGlyThrProAsnLysThrAlaCysMetTyr100105GlyGlyValThrLeuHisAspAsnAsnArgLeuThr110115120GluGluLysLysValProIleAsnLeuTrpIleAsp125130GlyLysGlnThrThrValProIleAspLysValLys135140ThrSerLysLysGluValThrValGlnGluLeuAsp145150155LeuGlnAlaArgHisTyrLeuHisGlyLysPheGly160165LeuTyrAsnSerAspSerPheGlyGlyLysValGln170175180ArgGlyLeuIleValPheHisSerSerGluGlySer185190ThrValSerTyrAspLeuPheAspAlaGlnGlyGln195200TyrProAspThrLeuLeuArgIleTyrArgAspAsn205210215LysThrIleAsnSerGluAsnLeuHisIleAspLeu220225TyrLeuTyrThrThr230权利要求1.一种结合物，是由a)一个被修饰的野生型超抗原和b)一个寻靶部分共同形成的，其中所述的被修饰超抗原含有第一个野生型超抗原的某一氨基酸序列，在该序列至少一个区域内的一个或几个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代了，该修饰超抗原仍然保持着激活T细胞亚群的能力，此区域是i)存在于第一个野生型超抗原所述的氨基酸序列内，并且ii)在决定与TCR的结合和激活T细胞亚群中发挥功能。2.权利要求1的结合物，其中所说的至少一个区域在决定对TCRVβ的结合中发挥功能。3.权利要求1-2中之任一结合物，其中所述的野生型超抗原是SEA，SED或SEE，或者类似的其它超抗原。4.权利要求1-3中之任一的结合物，其中的野生型超抗原是SEE，而所述的至少一个区域是选自SEQIDNO8中所定义的区域A，C，F，和H。5.权利要求1-4中之任一的结合物，其中的野生型超抗原是进行了如下氨基酸残基取代的SEER20G，N21T，S24G和R27K，在此这些位置是按图2中SEQIDNO8所定义的。6.权利要求1-5中之任一的结合物，其中修饰的超抗原是一种由a)所述第一个野生型超抗原和b)一个或几个另外的野生型超抗原，共同形成的嵌合体，其中，在所述的第一个野生型超抗原至少一个区域中的一个或几个氨基酸残基的每一个，都被存在于所述一个或几个另外的野生型超抗原相应区域中的相应氨基酸残基取代。7.权利要求6的结合物，其中的第一个和另一个野生型超抗原是选自SEA，SED，SEE，和类似的其它超抗原。8.权利要求7的结合物，其中所述的至少一个区域是选自相应于如图2中SQEIDNO7或8所规定的区域A，C，F和H。9.权利要求8的结合物，其中在相应于如图2，SEQIDNO7和8中所定义的区域A中20，21，24，和27位置的至少一个氨基酸残基，被以所述的一个或几个另外的野生型超抗原区域A中相应的氨基酸残基取代了。10.权利要求6-9中之任一的结合物，其中所述的第一个野生型超抗原是SEE，而一个或几个另外野生型超抗原是SEA。11.权利要求7-10中之任一的结合物，其中所述的一个或几个氨基酸取代是在相应于如图2中，SEQIDNO7和8所定义的20，21，24，27(对于区域A)和/或60，62(对于区域C)和/或111，114，115，117，118，124，126(对于区域F)和/或200，206，207(对于区域H)位置，在所述第一个超抗原是SEE，而一个或几个另外的超抗原是SEA的情况下，优选的是区域A所有4个位置中的残基都被取代。12.权利要求1-11中之任一的结合物，其中的野生型超抗原是选自那些为结合于II类MHC需要锌离子的超抗原，并且，其中存在于该结合物中的所述第一个野生型超抗原具有一个序列，此序列中在与结合于锌离子有关的位置中的一个氨基酸残基被取代，以便降低这种结合能力，特别强调的是图2，SEQIDNO7和8所定义的位置225和/或227。13.权利要求1-12中之任一的结合物，其中所述的寻靶部分是一个抗体，特别是抗体活性片段。14.权利要求1-13中之任一的结合物，其中的寻靶部分是Fab片段。15.一种通过激活哺乳动物免疫系统来治疗哺乳动物疾病的方法，此方法包含对哺乳动物给予治疗有效剂量的一种超抗原，此超抗原包括通过取代至少在一个区域中的一个或几个氨基酸残基而修饰的第一个野生型超抗原，此区域i.是存在于第一个野生型超抗原的氨基酸序列中，并且ii.在决定与TCR结合并随后激活T细胞亚群中发挥功能。16.权利要求16的方法，其中所述的修饰超抗原，是由第一个超抗原和一个或几个另外的野生型超抗原共同形成的嵌合超抗原，这意味着，在第一个野生型超抗原所述的至少一个区域中的一个或几个氨基酸残基的每一个，都已被存在于所述一个或几个另外的野生型超抗原相应区域中的相应氨基酸残基取代。17.权利要求15-16中之任一的方法，其中疾病与表达表面靶结构的细胞有关，这种靶结构在一种结构上不同于TCR结合表位的表位与超抗原结合，其与表面结合结构的结合允许与TCR结合，随后激活T细胞亚群。18.权利要求15-17中之任一的方法，其中的疾病包括癌症，病毒感染，寄生虫感染和自身免疫性疾病。19.权利要求15-18中之任一的方法，其中所述的野生型超抗原是选自SEA，SED，SEE和类似的其它超抗原。20.权利要求19的方法，其中所述的至少一个区域是选自相应于图2，SEQIDNO7和8所定义的区域A，C，F或H的区域。21.权利要求15-20中之任一的方法，其中所述的第一个野生型超抗原是SEE，而所述的至少一个区域是选自图2，SEQIDNO8中所定义的区域A，C，F和H。22.权利要求21的方法，其中所述的至少一个区域是区域A，并且其中进行了如下氨基酸残基的取代R20G，N21T，S24G和R27K，在此的位置是按图2，SEQIDNO8所定义的。23.权利要求15-22中之任一的方法，其中所述的至少一个另外的野生型超抗原是SEA。24.权利要求15-23的方法，其中所述的超抗原是一种如权利要求1-14中之任一所规定的结合物。25.权利要求24的方法，其中的野生型超抗原是选自那些为了结合于II类MHC而需要结合于锌离子的超抗原，并且，在与结合于锌离子有关的位置，第一个野生型超抗原某序列中的一个氨基酸残基被取代，以便降低对II类MHC的结合能力。26.权利要求25的方法，其中所述的有关位置相当于图2，SEQIDNO7和8中所定义的227，突出的是突变D277A。27.据权利要求24-26中之任一的方法，其中的寻靶部分是一个Fab片段，其中提供链间键合的每个半胱氨酸残基，已被用不能提供链间键合的氨基酸残基取代了，优选的取代氨基酸残基是丝氨酸。28.一种含有修饰抗体的药用组合物，此抗体中提供天然抗体中链间胱氨酸键合的半胱氨酸已被取代，以便阻止胱氨酸的形成。29.权利要求28的药用组合物，其中的取代残基是丝氨酸残基。30.权利要求29的药用组合物，其中的抗体是一个Fab片段。31.权利要求30的药用组合物，其中该抗体被融合于一个肽部分，此肽部分能提供以Vβ特异性方式对T细胞的激活。全文摘要一种由一个寻靶部分和一个修饰的超抗原共同形成的结合物,其特征在于,该超抗原是一种野生型超抗原(SAⅠ),其中在决定与TCR,优选地是TCRVβ结合并激活T细胞的一个超抗原区域中(区域Ⅰ),一个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代了,而仍然保持着激活T细胞亚群的能力。在一个优选的实施方案中,该修饰超抗原是由至少二个野生型超抗原(SAⅠ,SAⅡ等)共同形成的嵌合体,其特征在于,在决定与TCR结合,并激活T细胞的一个区域中,一个或几个氨基酸残基已在不同的野生型超抗原间交换了。一种利用修饰/嵌合超抗原的治疗方法如在以前的文章中已详细说明。一种用作药剂的抗体制备物此抗体中提供链间二硫键的半胱氨酸残基已被突变,以便阻止链间二硫键桥的形成。优选地是突变成丝氨酸残基。文档编号C07K19/00GK1194651SQ97190630公开日1998年9月30日申请日期1997年3月26日优先权日1996年3月29日发明者P·安顿森,J·汉森,P·布耶尔克,M·多尔斯藤,T·卡兰德,L·阿布拉姆森,G·福尔斯堡申请人:法马西亚及厄普约翰公司