神经营养蛋白的纯化的制作方法

专利名称：神经营养蛋白的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及从伴有变体、杂质和污染物(尤其由细菌或哺乳动物细胞发酵产生的)的材料中纯化获得神经营养蛋白(尤其是NGF家族中的那些蛋白，更特别地是神经生长因子(NGF)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)和神经营养蛋白-3(NT-3))的一种改进方法。
背景对于生产人和动物药物制剂、酶和其它专用化学物质来说，大量生产相对纯的、具有生物活性的多肽和蛋白在经济上是很重要的。为了生产许多蛋白质，重组DNA技术已经成为选用的方法，因为在哺乳动物宿主细胞、细菌及其它宿主细胞中能表达大量的外源蛋白质。
Angeletti和Bradshaw在Pro.Natl.Acad.Aci.USA68:2417(1971)中首先描述了哺乳动物NGF(小鼠NGF)的一级结构。从小鼠NGF cDNA的核苷酸序列中已经推导出了其前体前NGF原(pre-pro-NGF)的一级结构(Scott等，Nature302:538(1983)；Ullrich等，Nature303:82l(1983))。
同源的人NGF(hNGF)基因也已鉴定出来(Ullrich,Symp.on Quan.biol.,ColdSpring Harbor48:435(1983)；美国专利5,288,622,1994年2月22日公开，纳入本文作参考)。在氨基酸和核苷酸水平上，它与小鼠NGF的同源性分别约为90％和87％。由于天然存在的人NGF的量很少，因此不能从天然来源来大量制备人NGF以进行详细的生化特性分析。
与NGF相关的其它神经营养因子已被鉴定出来。这些因子包括脑衍生神经营养因子(BDNF)(Leibrock等，Nature,341:149-152(1989))、神经营养蛋白-3(NT-3)(Kaisho等，FEBS Lett.,266:187(1990)；Maisonpierre，等，Science,247:1446(1990)；Rosenthal等，Neuron,4:767(1990))和神经营养蛋白4/5(NT-4/5)(Berkmeier等，Neuron,7:857-866(1991))。GDNF(TGF-β超家族中的一个远缘成员)和neurturin(＂NTN＂)是两种最近鉴定出来的、结构上相关的、交感神经和中枢神经系统神经元的潜在存活因子(Lin等，Science260:1130-1132(1993)；Henderson等，Science266:1062-1064(1994)；Buj-Bello等，Neuron15:821-828(1995)；Kotzbauer等，Nature384:467-470(1996))。
产生重组蛋白的方法涉及用编码蛋白的DNA转染宿主细胞并使该细胞在有利于重组蛋白表达的条件下生长。原核细胞大肠杆菌已经成为一种有益的宿主细胞，因为可能使它以低本高产量来生产重组蛋白。已有许多美国专利描述了关于编码蛋白DNA在细菌中表达的通用方法，它们包括美国专利No.4,565,785-关于包含非细菌基因和胞外或周质载体蛋白的细菌基因的重组DNA分子；美国专利No.4,673,641—关于外源多肽与聚集体形成多肽的共同产生；美国专利No.4,738,921—关于具有trp启动子/操纵子以及与多肽(如IGF-I)的trp LE融合的表达载体；美国专利No.4,795,706-关于包括外来蛋白的表达控制序列；以及美国专利No.4,710,473—关于特异性环状DNA质粒(如编码IGF-I的质粒)。
基因工程生物药物通常是从含有各种不同宿主细胞污染物的上清液中纯化获得的。特别是已有报道，用多种不同方法通过不同程度的努力可将NGF纯化至不同程度。例如参见，Longo等，IBRO Handbook,12卷，3-30页(1989)；美国专利5,082,774(它公开了CHO细胞生产NGF)；Bruce和Heinrich(Neurobio.Aging10:89-94(1989)；Schmelzer等，J.Neurochem.59:1675-1683(1992)；Burton等，J.Neurochem.59:1937-1945(1992))。这些成就主要是试验室规模。
然而，制备性分离获得具有药物纯度和高产量(基本上不含变体)的重组人NGF却是本领域技术所难以实现的。
因此，本领域需要一种有效的方法来选择性地从其变体和其它分子、以及pI高的其它多肽中分离出神经营养蛋白(尤其是神经营养蛋白NGF和NGF家族)。大规模纯化神经营养蛋白的方法应适用于各种来源的原料以供临床需求，这些原料包括发酵液、裂解的细菌或哺乳动物细胞。而且，由于本发明的发明者已经发现了以前未知的、很难分离的神经营养蛋白变体(例如NGF变体)，因此本文所述的方法特别适于用来提供商业上有用数量的重组神经营养蛋白，其包括人NGF(rhNGF)、rhNT-3、和rhNT-4/5及其基本上无不需要变体的所需基因工程突变体。现在，本发明的这些和其它目的对于本领域技术人员来说是明显可知的。
概述本发明的一个实例提供了一种用疏水作用层析(HIC)来纯化神经营养蛋白、尤其是NGF家族中的神经营养蛋白的方法，这些神经营养蛋白包括NGF、NT-3、NT-4/5和BDNF，(它们均能被高度同源的受体家族(trk)识别)，较佳的是rhNGF、rhNT-3、rhNT-4/5、rhBDNF或其所需的基因工程形式。由于本发明者发现在神经营养蛋白的重组生产时会产生某些不需要的神经营养蛋白变体(如本文所述的)，因此，使用HIC可以将化学上不同的或甚至是错折叠形式的神经营养蛋白与所需的、正确折叠的、完整的神经营养蛋白分开。可以除去的变体是在疏水性上与成熟的、正确折叠的神经营养蛋白不同的那些变体，包括经部分加工的前体序列、含有糖基化的成熟和前体的形式(存在于真核细胞培养中)、以及错折叠和部分折叠的变体(当采用体外折叠步骤时通常来自细菌培养)。例如，HIC特别可用来从成熟NGF混合物中除去部分加工的NGF前体序列、糖基化的NGF和前体(存在于真核细胞培养中)、和错折叠和部分折叠的变体(通常来自细菌细胞培养和体外折叠步骤)。NGF在Asn45处有一个通过N连接的糖基化位点。在细菌表达的重折叠的rhNT-4/5情况下，HIC可将正确折叠的NT-4/5与错误折叠的形式分开。本文所述方法的结果是，神经营养蛋白基本上没有这些变体。对于神经营养蛋白的纯化，HIC树脂功能性基团最好是苯基，但是也可用辛基和丁基。特别佳的实例包括HIC树脂苯基Toyopearl树脂、苯基Sepharose Fast Flow LowSubstitution树脂、TSK-苯基5PW树脂等。
在另一个实例中，提供了一种用制备性阳离子交换层析来纯化神经营养蛋白、尤其是NGF家族中的神经营养蛋白(较佳的是rhNGF、rNT-3、rhNT-4/5、或其所需的基因工程形式)的方法，该方法将电荷改变的变体(如氧化的、异天冬氨酸(isoasp)和脱酰胺形式)从成熟的神经营养蛋白中分离出来。特别佳的实例采用SP-Sepharose High Performance,Fractogel EMD SO3或聚天冬氨酸树脂，其中PolyCAT A是特别佳的。最佳地可大规模采用SP-Sepharose High Performance或Fractogel EMD SO3树脂。
在本发明的还有一个实例中，可采用HIC和阳离子交换层析来制备所需的神经营养蛋白(例如重组的成熟NGF、较佳的是人NGF)组合物，该组合物是基本均一的，即基本上不含加工和电荷变体(如错折叠的和化学变体)，而且蛋白质成分基本上也是纯的。
在本发明的一个实例中，提供了一种改进的分离方法，利用反相液相层析从相关的不需要的变体(如发酵液、蛋白酶裂解的变体、糖基化变体、错折叠变体)中分离出神经营养蛋白(尤其是NGF家族的神经营养蛋白，较佳的是重组人NGF、NT-3、NT-4/5及其所需的基因工程形式)。更佳的是，NGF是120/120或118/118均二聚物形式。因此，本文所述方法的结果是神经营养蛋白最好几乎没有变体。
在另一个实例中，提供了一种包括用生理pH的洗脱条件来从相关变体中纯化神经营养蛋白、尤其是NGF-家族的神经营养蛋白的方法。
在还有一个实例中，提供了一种使神经营养蛋白均一性有相当大改善的纯化方法。
在另一个实例中，本发明提供了一种从变体中分离出NGF-家族神经营养蛋白的方法，该方法包括a)将pH约5-8的含神经营养蛋白及其变体的缓冲液加入疏水作用层析柱中；b)洗涤该层析柱；c)用pH约5-8的缓冲液洗脱神经营养蛋白；d)将含有神经营养蛋白的洗脱液在pH约5-8下加入阳离子交换层析柱中；和e)用pH约5-8(较佳的为6)的盐梯度缓冲液将神经营养蛋白从柱上洗脱下来。神经营养蛋白最好是rhNGF。
在本发明的一个较佳实例中，提供了硅胶层析步骤，该步骤能有效地从神经营养蛋白级分(较佳的是NGF级分)中除去宿主细胞蛋白。
在本发明的另一个例子中，提供了一加工步骤，其中对120氨基酸的NGF进行胰蛋白酶样蛋白酶处理，以便从VRRA C-末端上除去末端RA二肽，形成118个氨基酸的种类。固相化的胰蛋白酶柱是较佳的。
本发明还涉及本发明方法制得的神经营养蛋白组合物和制剂，以及这些组合物和制剂的应用。本发明提供了一种神经营养蛋白的组合物，该组合物基本上是均一的，即基本上不含加工和电荷变体(如错折叠和化学变体)，而且蛋白成分上是基本上纯的。较佳的是，以这种形式提供的成熟的人NGF、成熟人或大鼠NT-3和成熟的人NT-4/5。在一个较佳的实例中，NGF是120(氨基酸)形式，更佳的是118形式，最佳的是均二聚体如118/118。
附图简述

图1显示了SP-Sepharose HP层析谱。将12kL发酵液在HIC层析后的含NGF混合物加入25全配(omnifit)SPSHP树脂的SP-Sepharose High Performance树脂柱(柱尺寸为1.0×35cm；床体积为27.5毫升)中。缓冲液A是0.2M NaCl、20mM琥珀酸盐、pH6.0(23ms)。缓冲液B是0.7M NaCl、20mM琥珀酸盐、pH6.0(63ms)。首先将该柱以缓冲液A平衡。将345毫升(0.24毫克/毫升)的HIC合并物调节至含25mM琥珀酸盐、pH6.0(17ms)，加入其中的362毫升，使每毫升树脂载荷量为3毫克；加入82.5毫克NGF。加样速度为每小时40厘米。用22倍柱体积、梯度从30％到80％的缓冲液B(0.35至0.60M NaCl；37至57ms)洗脱NGF。洗脱速度为每小时60厘米。将280nm的吸光值和mS/cm对级分编号和洗脱体积(毫升)作图。测定含有NGF的级分并合并。在此例中，合并级分43至60，获得99毫升样品(NGF浓度为0.38mg/ml)，得率为46％。
图2显示了Phenyl Sepharose Fast Flow合并物以及SP-Sepharose HP合并物的SP-NRP HPLC阳离子交换(HPIEX)分析结果。每一合并物的层析谱已作标记。
图3显示了SP-Sepharose HP层析步骤中所选级分(主要的合并物以及主峰合并物的前缘和峰尾缘)的C4RP-HPLC分析结果。这三个信号是重叠的，如标记所示。可以看出，含有成熟NGF的主峰与含有变体NGF的几个次峰分开。
图4显示了人前NGF原(SEQ ID NO:1)的序列。图中示出的是成熟NGF(1位)的第一个氨基酸和120NGF形式的最后一个氨基酸(120位)。较佳的NGF氨基酸序列是118个氨基酸的成熟形式(从1位到118位)。另外示出的变体形式是成熟的120变体(1位到120位)；成熟的117变体(1位到117位)；R120变体(-1到120位)；和N端和C端发生误加工产生的部位，包括成熟的114(氨基酸1到114)、115(氨基酸1到115)和117(氨基酸1到117)变体。主要的误加工(蛋白水解误加工)变体在NGF原序列中氨基酸R(-39)和S(-38)间有N端断裂。可能的起始Met用下划线表示。其它N端变体包括NGF的截短形式，最常见的是在氨基酸H8和R9间以及R9和G10间发生断裂。
图5示出了神经营养蛋白人NGF(SEQ ID NO:2)、小鼠NGF(SEQ ID NO:3)、BDNF(SEQ ID NO:4)、NT-3(SEQ ID NO:5)和NT-4/5(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。框出的区域表示涉及半胱氨酸打结基序的同源性含半胱氨酸区域(De Young等，Protein Sci.5(8):1554-66(1996))。
图6示出了rhNT-4/5在DEAE-Sepharose Fast Flow(DEFF)树脂柱上的层析图。标记为“NT45DE1:1_UV”的层析谱是280nm UV吸光测定结果。标记为“NT45DE1:1_Condl”的层析谱是洗脱级分的电导率测定结果。合并的含神经营养蛋白的级分用标有“合并物”的水平箭头表示。
图7示出了rhNT-4/5在SP-Sepharose Fast Flow树脂柱上的层析图。标有“NT45SFF1:1_UV”的层析谱是280nm下的UV吸光度测定结果。标有“NT45SFF1:1_Cond1”的层析谱是洗脱级分的电导率测定结果。合并的含神经营养蛋白的级分用标有“合并物”的水平箭头表示。
图8示出了rhNT-4/5在文中所述条件下进行的典型的制备性C4-RP-HPLC层析图。对280nm的吸光度进行监测。合并的含神经营养蛋白的级分用标有“合并物”的水平箭头表示。
图9提供了在重折叠期间所示时间监测NT4/5样品的分析性HPLC层析图。柱条件如文中所述。“NT-4/5Std.”表示、正确折叠的、完整的NT-4/5(用作标准品)的洗脱方式。标有“SSFF(0.5m)”的模式表示在重折叠前用0.5M NaCl将NT-4/5从S-Sepharose Fast Flow柱上洗脱下来的分析结果。当NT-4/5重折叠时，洗脱模式接近标准模式。
图10示出了在疏水作用层析柱Phenyl Toyopearl 650M柱上将完整的、正确折叠的NT-4/5从错折叠的变体中分离出来的层析谱。疏水性低于正确折叠的NT-4/5的错折叠变体洗脱于流通液中，而疏水性较高的错折叠变体(峰B)则在高于洗脱正确折叠NT-4/5(峰A)所需的有机溶剂浓度下被洗脱。
图11示出了NT-4/5和变体从阳离子交换树脂SP-Sepharose上的洗脱模式。监测280nm吸光度。峰A含有氨甲酰基化的和修剪的变体，而峰B含有完整的、正确折叠的NT-4/5。合并的含有NT-4/5的级分用标有“合并物”的水平箭头表示。
图12表示在文中所述条件下rh NT-4/5dd典型的制备性聚CAT A树脂层析模式。
图13表示在还原条件下16％SDS-PAGE(Tris-甘氨酸系统，预先倒好，购自Novex,Inc.,San Diego,CA)分析，以评价从文中所述rh NT-4/5纯化方法所示步骤中取出的样品的纯度和均一性。凝胶用考马斯亮蓝R250染色检测蛋白质(Andrews,Electrophoresis,Oxford University Press:New York,1986)。标有“加入DE”的泳道含有PEI混合物样品，将该样品加入DE-Sepharose Fast Flow柱；标有“DE FT”的泳道含有流经通过DE-Sepharose Fast Flow柱的样品；泳道“S合并物”含有从S-Spharose Fast Flow树脂柱上洗脱下的重折叠前的NT-4/5合并级分样品；泳道“重折叠合并物”含有重折叠完成后的合并物样品；泳道“C4合并物”含有制备性C4RP-HPLC后的合并级分样品；以及泳道“PolyCAT A合并物”含有PolyCAT A HPLC柱中所得NT-4/5合并级分的样品。
图14表示含有细菌产生的、磺酰基化的rhNT-3的混合物经S-Sepharose FastFlow层析后各级分的UV吸光度模式。
图15表示含有体外重折叠形式的rhNT-3的混合物的Macroprep High S阳离子交换层析图。树脂购自Biorad。柱尺寸为9×9cm。将700毫升含有重折叠形式(重折叠36小时后)的SSFF合并物(pH6.8)以约310毫升/分钟的流速加入Macroprep柱中。条件在文中给出。
图16示出了阳离子交换纯化的、重折叠rhNT-3的Phenyl Sepharose Fast FlowHigh Substitution(疏水作用层析)层析以除去错折叠的变体。
图17示出了HIC-rhNT-3合并物的SP-Sepharose High Peformance层析。
详述部分定义本文所用的术语“神经营养蛋白”指一种神经营养蛋白，尤其是NGF家族的神经营养蛋白，其包括NGF、NT-3、NT-4/5和BDNF，它来自各种物种，包括小鼠、牛、羊、猪、马、鸟、尤其是人，可以是天然序列或基因工程形式，可来自任何来源，即无论是天然的、合成的还是重组制得的。例如，“NGF”指来自任何物种的神经生长因子，这些物种包括小鼠、牛、羊、猪、马、鸟、尤其是人，它可以是天然序列或基因工程变体形式，可来自任何来源，无论是天然的、合成的还是重组制得的。较佳的，神经营养蛋白是重组制得的。在一种较佳的方法中，例如在哺乳动物细胞、细菌细胞中克隆获得神经营养蛋白，使其DNA表达。本文提出的过程和方法也可用于神经营养蛋白GDNF和neurturin。
适于人用的是人天然序列、成熟的NGF，更佳的是120个氨基酸的序列，还要佳的是118个氨基酸的序列。更佳的，天然序列NGF是重组制得的。美国专利5,288,622提供了人前NGF原和人成熟NGF的较佳的氨基酸序列，该文特别纳入本文作参考。没有附加的翻译后修饰的120个氨基酸形式是均二聚体形式中较佳的形式(即120/120)。更佳的是没有附加翻译后修饰的118(个氨基酸)的形式，尤其是它的均二聚体(即118/118)。
“基本上纯”是指全部神经营养蛋白(如NGF)相对于总蛋白的纯度，其中至少有70％的神经营养蛋白，更佳的至少有80％，还要佳的可提高到至少90％、95％或99％。特别佳的纯度为至少95％。“几乎纯”指组合物中所需的神经营养蛋白至少有90％或更多。
“基本上不含神经营养蛋白变体”指组合物中所需神经营养蛋白种类相对于全部神经营养蛋白(包括不需要的神经营养蛋白种类)的百分数为至少为70％，更佳的至少有80％，还要佳的可提高到至少90％、93％、95％或99％。“几乎不含”指组合物含有至少90％或更多的所需神经营养蛋白。特别佳的水平为至少有95％的神经营养蛋白为所需种类(如正确折叠的完整的118/118rhNGF)。其它不需要的种类或形式可能是发酵或纯化过程中产生的误加工形式或化学变体(例如电荷变化的变体)，或宜为所有这些不需要的物质(如本文所述)。例如，当NGF在细菌中合成后在体外折叠时，“种类”或“变体”可包括错折叠或部分折叠的形式。
“错折叠”变体指神经营养蛋白变体，它与神经营养蛋白的不同在于其半胱氨酸残基的配对不同，或者特定的半胱氨酸残基缺失或被封闭。错折叠变体也可以有与神经营养蛋白相同的半胱氨酸配对，但是由于错折叠，其三维构象不同。
“化学”变体指一种在化学上与神经营养蛋白不同的变体，例如由于氨基甲酰化、脱酰胺化、氧化、糖基化、或蛋白水解而使电荷发生改变。
本发明中柱层析用缓冲液的pH范围通常约为5到8。控制pH在此范围内的缓冲液包括，例如，柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、MES、ADA、BIS-TRISPropane、PIPES、ACES、咪唑、二乙基丙二酸、MOPS、MOPSO、TES、TRIS缓冲液如TRIS-HCl、HEPES、HEPPS、TRICINE、甘氨酰胺、BICINE、甘氨酰甘氨酸、和硼酸盐缓冲液。较佳的缓冲液是MOPSO缓冲液。
本文所用的术语“醇”和“醇溶剂”指醇技术用语的常用含义，较佳的是1至10个碳原子的醇，更佳的是甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或叔丁醇，乙基甘油、丙二醇、乙二醇、己二醇、聚丙二醇和聚乙二醇，最佳的是乙醇或异丙醇。这些醇是溶剂，当其加入水溶液中时，它能通过降低溶液的极性来增加溶液的疏水性。
MOPOS是3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸。HEPES是N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸。试剂级醇为95份(体积)专用变性醇制剂3A(Specially Denatured Alcoholformular3A)和5份(体积)异丙醇。MES是2-(N-吗啉)乙磺酸。UF/DF指超滤/渗滤。TMAC是氯化四甲铵。TEAC是氯化四乙铵。NGF-120指全长120/120神经生长因子。NGF-118指均二聚体的118个残基的成熟NGF分子。氧化的NGF指NGF变体分子Metsulfoxide37，本文报道说，它的生物活性大约为成熟的天然NGF的80％。Isoasp NGF指NGF的同分异构变体分子Asp93。脱酰胺NGF指NGF的Asn45变成Asp45。RNGF指NGF分子的N端还有一个额外的精氨酸残基。CHO指中国仓鼠卵巢细胞。
本文描述的树脂包括MACROPREP HIGH S阳离子交换树脂(BIO-RADLaboratorise；强阳离子交换树脂；SO3官能团；标称粒径为50m；标称孔径为1000A)；硅胶(未衍生)；Phenyl Sepharose Fast Flow Substitution树脂(Pharmacia；高度交联的6％琼脂糖；粒径为45-165微米)；SP-Sepharose HP树脂(Pharmacia；高度交联的6％琼脂糖；粒径为34微米)；Phenyl Toyopearl 650M树脂(TosoHaas；粒径为40-90微米)；和Fractogel EMD SO3-650S(EM Separations,E.Merck(德国)的美国合作伙伴；粒径为25-40m)。
发明实施方式神经营养蛋白属于碱性小蛋白家族，它在神经系统的发育和维持中起关键作用。该家族中第一个被鉴定出的、可能是最为人所了解的成员神经生长因子(NGF)。参见美国专利No.5,169,762,1992年12月8日授权。最近，已经鉴定出具有相同功能、与NGF序列相关但是不同的多肽。例如，脑衍生神经营养因子(BDNF)(也称为神经营养蛋白-2(NT2))已由Leibrock等克隆和测序(Nature,341:49-152 )。几个研究组鉴定出了原来称为神经元因子(NF)、现在称为神经营养蛋白-3(NT3)的神经营养因子。(Emfors等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:5454-5458 ；Hohn等，Nature,344:339 ；Maisonpierre等，Science,247:1446 ；Rosenthal等，Neuron,4:767 ；Jones和Reichardt,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:8060-8064 ；Kaisho等，FEBS Lett.,266:187 )。神经营养蛋白-4/5(称为NT4或NT5)已被鉴定出来(Hallbook等，Neuron,6:845-858 ；Berkmeier等，Neuron,7:857-866 ；Ip等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3060-3064 )。美国专利5,364,769(1994年11月15日授权)公开了人NT-4/5及其重组体表达的方法，纳入本文作参考。另外还报道了嵌合和泛嗜性神经营养蛋白，如美国专利5,488,099(1996年1月30日授权，Urfer等，EMBO J.13(24):5896-909(1994))和WO95/33829(1995年12月4日公开，纳入本文作参考)中所报道的，其中神经营养蛋白已被修饰成能结合一个以上的受体或含有天然神经营养蛋白中(正常时)不存在的显著的受体结合活性。特别感兴趣的是称为MNTS-1和D15A NT3的神经营养蛋白。其它感兴趣的是具有NGF氨基酸主链但被修饰成结合trkA以外的受体(如trkB或trkC)的神经营养蛋白。较佳的是，NGF中的氨基酸被NT-3中负责结合NT-3的trk受体的相应位置的氨基酸取代。这种NGF突变体有NT-3样受体结合活性，并保留了NGF药物动力学和纯化性能(Urfer等，Biochemistry36(16):4775-4781(1997))。这些NGF突变体也可缺失trkA结合活性(Shih，等，J.Biol.Chem.269(44):27679-86(1994))。这些NGF突变体是特别适合用作本文所述发明的神经营养蛋白。
重组人神经营养蛋白的分离(如rhNGF)涉及将蛋白从各种不同宿主细胞污染物中分离出来。每一步都涉及能使分离充分的特殊缓冲液。由于用常规层析介质将存在的几种神经营养蛋白存在一起纯化，因此最后或次最后的神经营养蛋白加工步骤较为复杂。当回收和纯化过程中包括重折叠步骤时，变体包括错折叠形式的神经营养蛋白。变体还包括化学上与神经营养蛋白不同的那些变体，如氨基甲酰化、脱酰胺化或蛋白断裂形式。在NGF例子中，这些种类主要由二聚形式(均二聚体(如120/120或117/117，当需要118/118时)或异二聚体(如120/118、117/118))、化学修饰变体(异天冬氨酸、单氧化、糖基化变体)、N端和C端截短形式及其二聚体组成。
本发明能大规模生产神经营养蛋白，尤其是rhNGF，其产量足以满足治疗用途，例如，治疗Alzheimer疾病、外周神经疾病(包括与糖尿病和艾滋病相关的神经疾病等)。
鉴于NGF与其它神经营养蛋白(尤其是NGF家族中的)在序列和构象上的相似性，本发明的方法可用来制备基本上不含误加工、错折叠或部分折叠、糖基化和/或电荷变体的这些神经营养蛋白。在本发明中，明确了有利于从这些以及其它密切相关的变体中选择性分离出神经营养蛋白的层析柱树脂和条件。神经营养蛋白包括NT-3、NT-4/5、NT-6、BDNF和其基因工程的形式，包括它的异二聚、嵌合或泛嗜性形式。较佳的，神经营养蛋白是人的或与人高度同源的氨基酸序列，与人序列的同源性较佳的应大于80％，更佳的大于90％，最佳的大于95％。基因工程的神经营养蛋白应保留与其模仿的天然神经营养蛋白trk受体结合功能的至少50％，较佳的至少75％，更佳的至少80％。这些工程改造形式是保留了天然神经营养蛋白足够高的pI或疏水特性因而保留了本文方法中相似性能的那些形式。
如下所述，本文所述方法已经成功适用于rhNGF、rhNT-3和rhNT-4/5。例如，在大肠杆菌中制得的rhNT-4/5的包含体分离，然后从包含体中还原和溶解。还原的NT-4/5用DE Sepharose Fast Flow和S-Sepharose Fast Flow层析部分纯化。S-Sepharose Fast Flow合并物在含胍缓冲液中重折叠24小时。NT-4/5的错折叠形式通过本文所述的大规模层析被除去。氨基甲酰化和剪接(误加工形式)的NT-4/5通过柱形式的PolyCat A HPLC树脂或SP-Sepharose HP树脂的高效阳离子交换层析被大规模除去。将纯化的rhNT-4/5超滤和渗滤到配制用酸性缓冲液中。
本发明的一个实例涉及从神经营养蛋白相关变体中纯化出神经营养蛋白，通常在神经营养蛋白已经从大多数其它杂质中纯化出来，更典型的是在最后或接近最后的步骤中而在配制前脱盐或渗滤之前。混合物中有关的变体不仅包括发酵产生的残余变体，还包括神经营养蛋白在储藏或加工时降解产生的变体。
适用于本发明实施例用的神经营养蛋白可用任何方法制得，但是最好是用重组方法制得。本文讨论的编码神经营养蛋白的核酸分子可从几种来源获得，例如，利用已知DNA序列通过化学合成，或利用本领域技术人员已知的标准克隆技术。携带神经营养蛋白(如hNGF)编码序列的cDNA克隆可用根据神经营养蛋白已知序列特别设计的寡核苷酸杂交探针来鉴定。
在获得具有神经营养蛋白编码序列的DNA分子时，将该分子插入适于在所选宿主细胞中表达的克隆载体中。将此克隆载体构建成能提供编码序列有效转录、翻译和加工所需的合适的调节功能。
如果神经营养蛋白是用重组方法制得，则表达编码神经营养蛋白的DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括细菌，如古细菌类和真细菌类。较佳的细菌是真细菌类，如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科如埃希氏杆菌属(如大肠杆菌)、肠细菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属(如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(如粘质沙雷氏菌)和志贺氏菌属；芽胞杆菌属如枯草芽胞杆菌和藓样芽胞杆菌(如DD266,710中公开的藓样芽胞杆菌，1989年4月12日公开)；假单胞菌属如绿脓假单胞菌；链霉菌属；固氮菌属；根瘤菌属；明颤细菌属(Vitreoscilla)和副球菌属。合适的大肠杆菌包括大肠杆菌W3110(ATCC27,325)、大肠杆菌94(ATCC31,446)，大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC31,537)。这些例子是列举性的而无限制性。
全文纳入本文的是PCT出版物WO95/30686,1995年11月16日公开。该出版物是特别关于NGF的细菌合成和体外折叠的描述。该方法的产物适用于本发明的纯化方法。
也可采用上述任一细菌的突变型细胞。当然，必需考虑细菌细胞中复制子的复制能力来选择合适的细菌。例如，大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属种类的细菌适于用作宿主，当用熟知的质粒(如pBR322、pBR325、pACYA117或pKN410)来提供复制子时。大肠杆菌株W3110是较佳的宿主或亲代宿主，因为它是常见的重组DNA生产发酵的宿主菌株。宿主细胞宜分泌最少量的蛋白水解酶。例如，株系W3110可以修饰成使编码宿主内源蛋白的基因中发生基因突变，这些宿主的例子包括具有完整基因表型tonAΔ的大肠杆菌W3110株系1A2；具有完整基因型tonAΔptr3的大肠杆菌W3110株9E4、具有完整基因型tonA ptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169ΔdegPΔomp T kan<r>的大肠杆菌W3110株系27C7(ATCC55,244)；具有完整基因型tonA ptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169ΔdegPΔompTΔrbs ilvG kan r的大肠杆菌W3110株系37D6；大肠杆菌W3110株系40B4，它是具有无卡那霉素抗性degP缺失突变的株系37D6；以及具有美国专利No.4,946,783(1990年8月7日公开)所述突变型周质蛋白酶的大肠杆菌株系。
人NGF已在大肠杆菌中表达。美国专利No.5,288,622中描述了编码hNGF的β-亚基的基因序列和分离及其在大肠杆菌中表达成异源蛋白。本文所述的方法也适于提供哺乳动物细胞产生的成熟人NGF。利用重组技术，人β-NGF被表达而不含其它哺乳动物蛋白。hNGF在大肠杆菌中的表达采用了两个基因，故而而表达的融合蛋白中含有变化的氨基末端，这在Iwai等，Chem.Pharm.Bull.34:4724(1986)中有所描述。
除了原核生物，真核生物如丝状真菌或酵母是编码神经营养蛋白载体的合适表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母菌或常见的面包酵母是最常用的。然而，本文通常还可得到和使用其它许多属、种和株系，例如Schizosaccharomyces pombe[Beach和Nurse,Nature,290:140(1981)；EP139,383,1985年5月2日公开]；克鲁维酵母属宿主[美国专利No.4,943,529；Fleer等，Bio/Technology,9:968-975(1991)]如K.lactis[MW98-8C,CBS683,CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.,737(1983)],K.fragilis[ATCC 12,424],K.Bulgaricus(ATCC16,045),k.wickeramii(ATCC24,178),K.waltii(ATCC56,500),K.drosophilarum[ATCC36,906；Van den Berg等，Bio/Technology,8:135(1990)],K.thermotolerans和K.marxianus；yarrowia[EP402,226]；Pichia pastorts[EP183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.,28:265-278(1988)]；念珠菌属；Trichodermareesia[EP244,234]；粗糙链孢霉[Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263(1979)]；Schwanniomyces如Schwanniomyces occidentalis[EP394,538,1990年10月31日公开]；和丝状真菌，如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium[WO91/00537,1991年1月10日公开]、和曲霉属宿主如构巢曲霉[Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun,112:284-289(1983)；Tilburn等，Gene,26:205-221(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA,8l:1470-1474(1984)]和黑曲霉[Kelly和Hynes,EMBO J.,4:475-479(1985)]。
适用于表达编码神经营养蛋白的DNA的合适宿主细胞也可从多细胞生物中获得。这些宿主细胞具有复杂加工和糖基化活性。理论上，任何高等真核细胞是适用的，不论是来自脊椎还是无脊椎细胞培养。无脊椎细胞例子包括植物和昆虫细胞。许多杆状病毒株和变体、以及来自诸如草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊)、白纹伊蚊(蚊)、黑尾果蝇(果蝇)和家蚕等相应的许可昆虫宿主细胞已获鉴定。例如参见，Luckow等，Bio/Technology,6:47-55(1988)；Miller等，Genetic Engineering,Setlow,J.K.等编辑，卷8(Plenum Publishing,1986),277-279页；和Maeda等，Nature,315:592-594(1985)。多种转染用病毒株是公众可得的，例如苜蓿丫纹夜蛾NPV和家蚕NPV的Bm-5株系，这些病毒可用于本文中，尤其可用来转染草地夜蛾细胞。如美国专利No.5,272,063(1993年12月21日授权)中报道的，已经在昆虫细胞中产生了人NGF。
棉、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养可用作宿主。植物细胞通常是与根癌土壤杆菌某些株系(先对其操作，以使包含编码神经营养蛋白的DNA)一起培育而受转染。在植物细胞培养物与根癌土壤菌培育时，编码神经营养蛋白的DNA转移到植物细胞宿主中从而使其被转染，并在合适的条件下使编码神经营养蛋白的DNA表达。另外，可得到与植物细胞相容的调节和信号序列，例如胭脂氨酸合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列(Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.,1:561(1982))。此外，从T-DNA780基因上游区域分离出的DNA片段能激活或提高植物可表达基因在含重组DNA的植物组织中的转录水平(EP321,196,1989年6月21日公开)。
有用的哺乳动物宿主细胞系例子是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系[供悬浮培养生长的293细胞或其亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.,36:59(1977)]；乳仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR[CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)]；小鼠足细胞[TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980)]；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TR1细胞[Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982)]；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤细胞系(Hep G2)。较佳的方法是在CHO细胞系中表达。含有前NGF原的人NGF外显子通过合适的启动子和载体可用来表达分泌的、成熟的NGF(包括118和120形式)(美国专利No.5,288,622)。能稳定地转染和分泌成熟形式NGF的稳定的CHO细胞培养可用于本发明中，如本文实施例所述。
用上述表达或克隆载体来转染(最好是转化)宿主细胞，将细胞培养在常规营养培养基中，培养基经过适当的变化，以便诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。转染指宿主细胞摄取表达载体，无论编码序列实际上是否表达。有许多转染方法是本领域普通技术人员所知道的，例如磷酸钙和电穿孔。当该载体在宿主细胞内表现出操作特征，则通常认为转染是成功的。
转化指将DNA诱导入生物体中以使DNA作为染色体外元件或染色质整合体而能复制。转化应根据所用的宿主细胞采用适于该细胞的标准方法进行。用氯化钙的钙处理(如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989]1.82节中所述的)或电穿孔通常用于原核生物或含有大量细胞壁屏障的其它细胞。根癌土壤杆菌的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等，Gene,23:315(1983)和WO89/05859(1989年6月29日)中所述。另外，植物可用超声处理来进行转化，如WO91/00358(1991年1月10日)中所述。
对于没有细胞壁的哺乳动物细胞来说，Graham和van der Eb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀方法是较佳的。Axel在美国专利4,399,216(1983年8月16日授权)中描述了哺乳动物细胞宿主体系转化的总体方面。转化入酵母通常是根据Van Solingen等，J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao等，Pro.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法进行。然而，也可采用将DNA导入细胞的其它方法，例如通过胞核显微注射、电穿孔、细菌与完整细胞的原生质体融合或聚阳离子，如聚凝胺(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)、聚鸟氨酸等。对于各种转化哺乳动物细胞的方法，参见Keown等，Methods in Enzymology(1990)卷185,527-537页，和Mansour等，Nature,336:348-352(1988)。
较佳的是，将hNGF的基因插入载体中，使其有甲硫氨酸起始密码子，较佳的有两个甲硫氨酸起始密码子中的一个(如Ullrich等，Nature,303:821-825(1983)所鉴定的)。hNGF基因有可作为翻译起始密码子的两个几乎毗邻的甲硫氨酸密码子(Ullrich等，Cold Spring Harbor Symposia on Quant.Biol.XLⅧ,p.435(1983)；US5,288,622)(1位指成熟hNGF的N端丝氨酸残基)。相反，小鼠颌下腺的NGF(研究最透彻的神经生长因子)在187位也有甲硫氨酸(除121位和119位外)。在哺乳动物细胞表达的较佳实例中，存在前NGF原序列。
如果用原核细胞来生产神经营养蛋白，可将它们培养在合适的培养基中，其中启动子是组成型的或是通常如Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York1989)中所述的人工诱导的。除了碳、氮和无机磷酸源外，培养基中还可加入合适浓度的任何所需的补充物，它可单独加入或以与另一补充物或培养基混合(如复合氮源)加入。
如果用哺乳动物宿主细胞来生产神经营养蛋白，则它们可培养在各种培养基中。商业上可购得的培养基，如Ham′s F10(Sigma)、极限必需培养基([MEM],Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改进的Eagle培养基([DMEM],Sigma)适用于培育宿主细胞。另外，Ham和Wallace,Meth.Enz.,58:44(1979)；Barnes和Sato,Anal.Biochem.,102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利No.Re.30,985(所有这些公开被纳入本文作参考)中描述的各种培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基的任何一种可以按需添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM药物)、微量元素(定义为无机化合物，通常的最终浓度在微摩尔范围内)、以及葡萄糖或等价能源。还可加入适当浓度的本领域技术人员所知的任何其它必需补充物。培养条件(如温度、pH等)是以前宿主细胞表达所选用的那些条件，它们对本领域普通技术人员来说是明显的。
总的来说，在Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach,M.Bulter编辑(IRL Press,Oxford University Press,Oxford,1991)中可以找到使哺乳动物细胞体外培育达到最大产量的原理、方案和实践方法。无论神经营养蛋白产生于胞内、产生于周质间隙或直接分泌到培养基中，均可采用上述方法。
通常，培养适当时间后收集培养液，进行标准鉴定试验，例如免疫测定(如ELISA和Western印迹分析)或生物试验(P12细胞分化(Greene,L.A.,TrendsNeurosci.7:91(1986)))。测定本文公开的变体的种类和程度的试验是本领域中所知的，或者在实施例中另有提供或描述(例如参见Schmelzer等，J.Neurochem.59(5):1675-83(1992)和Burton等，J.Neurochem.59(5):1937-45(1992)，这些内容纳入本文作参考)。
在进行HIC之前，最好对由细胞制得的神经营养蛋白组合物进行至少一次纯化步骤。根据待回收的神经营养蛋白和所用的起始培养物，合适的纯化步骤例子包括本文所述的那些，包括亲和层析、其它蛋白纯化手段，如硅胶层析、肝素Sepharose层析、在阴离子或阳离子交换树脂层析(如聚天冬氨酸层析柱)、层析聚焦和制备性SDS-PAGE。
在一个实例中，当神经营养蛋白被直接分泌到培养基中时，通过离心来将培养基与细胞碎片分开，然后使澄清的发酵液或培养基在硅胶上纯化。对于硅胶层析，通常是使发酵液通过非衍生硅胶颗粒，使得神经营养蛋白多肽粘附在硅胶颗粒上；洗涤硅胶颗粒以除去污染物；用含有醇或极性非质子溶剂和碱土、碱金属或无机铵盐的缓冲液将多肽从硅胶颗粒上洗脱下来。
在本发明的一个较佳实例中，采用Macroperp High S阳离子交换层析将神经营养蛋白从其变体以及减少的大量污染物中分离出来。该树脂可用作哺乳动物细胞培养神经营养蛋白纯化的早期步骤，最好是用来对收获的细胞培养基进行分级。在另一个实例中，Macroperp High S阳离子交换层析最好是在蛋白重折叠步骤后立即使用。通过调节条件使神经营养蛋白与柱结合，该阳离子交换柱的高流动性使得大体积稀释的重折叠蛋白或收获的细胞培养基神经营养蛋白很容易被浓缩，然后进行以后的层析步骤(如HIC或SP-Sepharose)。而且，树脂的阳离子交换性能可除去未结合的大量蛋白和一些误加工变体和化学修饰变体(例如改变电荷、MET37-氧化的变体)。最重要的是，当疏水性与天然神经营养蛋白不同的错折叠变体或化学修饰变体(如误加工变体、糖基化变体(哺乳动物细胞培养产生))存在时，Macroprep树脂能至少部分除去这些疏水性变体，从而大大浓积了天然神经营养蛋白(如本文所测定的)。尽管不意味着有限制性，据信树脂支持物的主链含有促进神经营养蛋白与树脂间非特异性相互作用的疏水成分，它可如本文所述的那样加以利用。通常，对于pH5-8(更佳的为6-8)的洗脱缓冲液来说，要用0-3MTMAC的浓度。当乙酸钠存在于洗脱缓冲液中来提高离子强度时，可用较低的TMAC浓度。氯化物是较佳的乙酸根离子替代物。
在神经营养蛋白产生于周质间隙的一个实例中，离心培养基或裂解液除去颗粒状细胞碎片。如必要，分离膜和可溶性蛋白级分。然后，可从可溶性蛋白级分以及培养裂解液的膜级分中纯化获得神经营养蛋白，这取决于神经营养蛋白是膜结合的、可溶的、还是以凝聚形式存在。随后使神经营养蛋白溶解，再用合适的缓冲液使其重折叠。下面将详述从周质分离来产生重折叠蛋白的这种分离方法。
将不溶性、非天然神经营养蛋白通过合适的方法从原核生物宿主细胞中分离到合适的分离缓冲液中，例如，一种方法包括将细胞暴露在合适离子强度的缓冲液中以使大多数宿主蛋白溶解，但其中凝聚的神经营养蛋白是基本上不溶的，破碎细胞以释放包含体，通过(例如)离心来回收它们。该方法是熟知的，在例如美国专利No.4,511,503中有所描述。
简言之，细胞悬浮在缓冲液中(pH通常为5至9，较佳的为6至8，采用的离子强度约为0.01至2M，较佳的为0.1至0.2M)。任何合适的盐，包括氯化钠，可用来维持足够的离子强度值。然后，用常用的方法(例如机械方法，如Manton-Gaulin压力微量流化器、French压碎机、超声振荡器，或化学或酶方法)来使悬浮在该缓冲液中的细胞裂解破碎。
细胞破碎的化学和酶方法例子包括原生质球法(spheroplasting)，具体是用溶菌酶来裂解细菌壁(Neu等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,17:215(1964))；以及渗透压休克，涉及用高渗涨力的溶液处理活细胞并用低渗涨力冷水洗涤，以释放多肽(Neu等，J.Biol.Chem.,240:3685-3692(1965))。第三种方法(美国专利No.4,680,262)涉及使转化的细菌细胞与有效量的2-4个碳原子的低级烷醇在足以杀死和裂解细胞的温度下接触一段时间。
在破碎细胞后，通常离心悬浮液，使包含体沉淀。在一个实例中，该步骤是在标准离心机中以500至15000xg(较佳的约12000xg)离心充分的时间，取决于体积和离心机的设计，通常约10分钟至0.5小时。所得沉淀基本上含有所有的不溶性多肽级分，但是如果细胞破碎过程不完全的话，它还可含有完整的细胞或破碎的细胞片段。通过将沉淀重新悬浮在少量相同缓冲液中，用相差显微镜检测悬浮液，就能测定细胞破碎的完全程度。破裂细胞片段或全细胞的存在表明还需另行破碎以除去片段或细胞和相关的非折射体多肽。在该进一步破碎后，如果需要，还可再次离心悬液，回收沉淀、重悬并进行分析。重复该过程直至肉眼检测表明沉淀物中没有破裂的细胞片段或直至进一步处理不能减小所得沉淀的大小。
在另一个实例中，通过在合适缓冲液中溶解，从周质间隙分离出神经营养蛋白。该步骤可以进行原位溶解，该方法包括在重组制得神经营养蛋白后在发酵容器中直接加入试剂，从而避免了为获得神经营养蛋白而进行收获、匀浆化和离心的额外步骤。残余的颗粒可通过离心、过滤或其组合的方法来除去。
如果神经营养蛋白是未折叠的，则通过对非天然神经营养蛋白层析(包括RP-HPLC)可适当地测定未折叠程度。非天然物质增加的峰面积表明有多少非天然神经营养蛋白存在。
一旦从溶解的包含体或较后纯化步骤中获得了神经营养蛋白，可适当地重折叠成下述的活性构象。
如果神经营养蛋白在重折叠前不是可溶形式，则它可通过与含有离液剂和还原剂(其量必须使神经营养蛋白显著溶解)的碱性缓冲液培育而溶解。该培育过程在神经营养蛋白浓度、培育时间和培育温度能使神经营养蛋白在碱性缓冲液中溶解的条件下进行。
神经营养蛋白在缓冲液中的溶解程度的衡量可通过测定浊度、分析离心后上清液和沉淀之间在还原性SDS凝胶上的神经营养蛋白级分、蛋白测定(如Bio-Rad蛋白测定试剂盒)或HPLC来进行。
溶解用碱性缓冲液的pH范围通常至少约为7.5，较佳的范围为约8-11。提供的pH在后一范围内的合适的缓冲液例子包括甘氨酸、CAPSO(3-[环己氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-[环己氨基]-1-丙磺酸)、CHES(2-[N-环己氨基]乙磺酸)和Tris HCl(三[羟甲基]氨基甲烷盐酸盐)。本文中较佳的缓冲液是甘氨酸或CAPSO，较佳的浓度约20mM下，pH约为8.5-11，更佳的约10-11。
溶解用缓冲液中神经营养蛋白的浓度应使得神经营养蛋白能基本溶解且部分或完全还原和变性。或者，神经营养蛋白最初可能是不溶的。确切用量将取决于(例如)，缓冲液中其它组分的浓度和类型，尤其是还原剂的类型和用量，离液剂的类型和用量，以及缓冲液的pH。例如，如果还原剂(如DTT)的浓度同时提高保持到DTT神经营养蛋白比为3∶1至10∶1，则神经营养蛋白的浓度可提高至少三倍。希望在稀释重折叠前制得更浓的溶解蛋白溶液。因此，神经营养蛋白的较佳浓度至少约为30mg/ml，更佳的范围为30-50mg/ml。例如，神经营养蛋白可在5-7M尿素、10mM DTT中溶解至浓度约为30-50mg/ml，并稀释成(例如)约1mg/ml用来折叠。
在神经营养蛋白溶解后，将其置于或稀释到含5-40％(v/v)醇或非质子溶剂、离液剂、碱金属、碱土金属或铵盐的重折叠缓冲液中。缓冲液可以是任何第一种缓冲液，其中CAPSO、甘氨酸和CAPS是较佳的，pH为8.5-11，特别是浓度约为20mM，最佳的是CAPSO和甘氨酸。神经营养蛋白可用重折叠缓冲液稀释，较佳的为至少5倍，更佳的为至少约10倍。或者，可用重折叠缓冲液对神经营养蛋白进行透析。重折叠可在约2-45℃下(更佳的约2-8℃下)进行至少约1小时。溶液还可任选地含有还原剂和渗透剂。
还原剂可适当地选自上述溶解步骤所述浓度范围内的那些还原剂。其浓度尤其取决于碱土金属、碱金属或铵盐、神经营养蛋白和溶剂的浓度。较佳的，还原剂的浓度约为0.5-8mM，更佳的约为0.5-5mM，还要佳的约为0.5-2mM。较佳的还原剂是DTT和半胱氨酸。
可任选地除去重折叠溶液中的氧气，通过加入惰性气体(例如氦和氩)代替氧气。
任选的渗透剂宜为蔗糖(浓度约为0.25-1M)或甘油(浓度约为1-4M)。更佳的，蔗糖浓度约为1M，甘油浓度约为4M。
折叠缓冲液中的神经营养蛋白的起始浓度应使所得的正确折叠与错折叠构象体之比最大(经HPLC、RIA或生物试验测得)。神经营养蛋白的较佳浓度(使正确折叠构象体的产生最大)约为0.1-15mg/ml范围内，更佳的约为0.1-6mg/ml，最佳的约为0.2-5mg/ml。
通过神经营养蛋白RIA滴度、或随RIA滴度增加的HPLC分析、或正确折叠的神经营养蛋白峰大小(与缓冲液中正确折叠的、有生物活性的神经营养蛋白构象体的增量直接相关)，就可恰当地测得培育中产生的重折叠程度。进行培育以使正确折叠的神经营养蛋白构象体的产率以及回收的正确折叠的神经营养蛋白构象体与错折叠神经营养蛋白构象体之比(经RIA或HPLC测得)最大，使多聚的、关联的神经营养蛋白的产率(经质量平衡测得)最小。或者，种类可用下述实施例中提供的方法来测定。胍是较佳的重折叠用变性剂。
在神经营养蛋白重折叠后，本文所述的下列单独或组合的步骤示范了获得更高纯度和均一性的合适的纯化步骤在阳离子交换柱上分级；疏水作用层析(HIC)；和在硅胶上层析。
无论重折叠步骤是否是该方法的一部分，将神经营养蛋白从其变体中分离出来的一个较佳步骤是在疏水作用层析树脂上进行分离。在发酵、纯化或体外蛋白重折叠时，一些蛋白可能被化学修饰、误加工，或可能不会重折叠成其天然的三维结构，而是折叠成稳定性、溶解度、免疫原性或生物活性不同的其它结构。这些变体必须在回收时除去，以避免不希望的副效应(如抗原性)或丧失效力。如果变体是不溶的，则它很容易通过固/液分离手段(如离心和过滤)来除去。然而，如果变体是可溶的，则需要分辨力更高的吸附手段(如层析)来将其除去。当它在原核细胞中产生或在体外重折叠时，神经营养蛋白形成了可溶的、稳定的错折叠变体。错折叠神经营养蛋白的二硫键配对方式和三维结构相对于天然神经营养蛋白发生变化，并且缺乏天然的药物活性。当它在真核细胞培养(如哺乳动物细胞培养)中产生时，变体形式通常是误加工形式。它们通常也缺少天然的药物活性，应被除去。这里已经发现，HIC适于从天然神经营养蛋白中分离除去这些变体。
HIC涉及蛋白通过非共价疏水结合的介导依次吸附并从固体基质上解吸下来。通常，将高盐缓冲液中的样品分子装入HIC柱中。缓冲液中的盐与水分子反应，减少了溶液中分子的溶剂化，从而使样品分子中的疏水性区域外露，然后该区域被HIC柱吸附。分子的疏水性越高，促进结合所需的盐就越少。通常，用递减的盐梯度来将样品从柱上洗脱下来。随着离子强度的降低，分子亲水性区域的外露增加，分子按照疏水性增加的次序从柱中洗脱。在洗脱缓冲液中加入温和的有机改性剂或洗涤剂，也可实现样品洗脱。HIC综述可见Protein Purification,2d版，Springer-Verlag,New York,pgs176-179(1988)。
蛋白与介质结合强度取决于几个因素，包括固定的功能基团的大小和疏水性质、周围溶剂的极性和表面张力、以及蛋白的疏水性。由于需要使固定化疏水性配体分布广泛，HIC基质的结合性能应较低。而且，介质对给定蛋白的结合能力与样品制备物中疏水性杂质的水平成反比。为了从变体和其它杂质中分辨出所需的蛋白并同时使介质结合能力最大化，需要确定合适的HIC固相介质和用于加样、洗涤和洗脱的合适的流动相。
如本文所确定的，分离正确折叠与错折叠神经营养蛋白、误加工形式与完整而正确加工形式的最合适介质是有固定化苯基官能团的那些介质。不同厂商的苯基为基的HIC介质在辨别这些神经营养蛋白形式时表现出不同的效力。采用TosoHaas的Phenyl Toyopearl介质和Phenyl Sepharose Fast Flow Sub(低取代)可获得最佳效果。TSK Phenyl5PW也是适用的。其它HIC固定化官能团可起分离这些形式的作用。例子是辛基，如Pharmacia的Octyl Sepharose CL4B介质，和丙基，如Baker的High Propyl介质。次佳的是烷氧基、丁基和异戊基官能团树脂。
HIC可用来从哺乳动物培养的其它变体中分离出神经营养蛋白。例如，如本文所确定的，表达rhNGF的CHO细胞培养含有不正确蛋白水解加工过的变体，如其中有部分前体序列存在的那些变体，如前体NGF、杂交的前体NGF和剪接的前体NGF序列。在哺乳动物细胞培养基中还发现有糖基化的NGF以及不正确蛋白水解加工变体的糖基化形式。不希望的糖基化形式(在NGF情况下可看作分子量较高的种类(+2000kD))可能在患者体内产生不良的抗原性反应，从而使产品的质量或活性变差。HIC有效地从rhNGF中分离出疏水性变体(主要是N端蛋白水解误加工变体，包括其糖基化形式)。如实施例中所示，在进行苯基-HIC时，含有前体序列和剪接前体序列NGF、NGF和含前体序列NGF这两者的糖基化形式洗脱在NGF峰的前缘。因此，可以获得基本上不含这些种类的rhNGF组合物，该组合物特别适用于随后的步骤如高效阳离子交换层析。HIC适用于其它神经营养蛋白和NGF(不论来源如何)。例如，HIC可用来从二聚体(根据存在的单体形式而产生的均二聚体或异二聚体)中分离出NGF单体，并能区别疏水性不同的体外折叠后获得的或哺乳动物细胞产生并分泌的二聚体。用于HIC的神经营养蛋白混合物的较佳来源是哺乳动物培养，更佳的是CHO细胞培养。最好对培养物先进行至少一步本文所述的纯化步骤。HIC在分离误加工糖基化变体与天然重组神经营养蛋白上特别有效。在rhNGF情况下，糖基化和前NGF原形式的疏水性不如天然NGF，从而在天然NGF前洗脱。错折叠形式的神经营养蛋白(由细菌产生时)也是更具疏水性，它在天然神经营养蛋白前洗脱。
分离神经营养蛋白形式的最佳的HIC树脂是具有固定化苯基官能团的那些树脂。不同厂商的以苯基为基础的HIC介质在辨别这些NGF形式上表现出不同的效力。在Phenyl-HIC树脂中，TosoHass的Phenyl Toyopearl介质是最佳的，Phenyl Sepharose Fast Flow Sub(低取代)和TSK Phenyl5PW是较佳的。较佳的HIC官能团包括烷氧基、丁基和异戊基。
采用HIC，可用各种流动相条件来洗涤并区分性地洗脱神经营养蛋白各形式。这些流动相中可含有几种不同的化学种类，这些化学种类以不同的方式来影响神经营养蛋白与静止相之间的结合。通过降低盐梯度或分步降低(例如)流动相的盐(如硫酸铵、氯化钠、乙酸盐)浓度，在HIC柱上可分辨正确折叠和错折叠的神经营养蛋白(如NT-4/5)。盐能够通过调节流动相的表面张力来影响神经营养蛋白与树脂的结合。能影响表面张力的其它试剂是柠檬酸钠和氯化四甲铵，如实施例中所述。通过采用增加的梯度或分步增加相对极性有机溶剂的浓度来洗脱结合的蛋白，也可在柱层析时分辨出变体。合适溶剂的例子包括乙醇、乙腈和丙醇。神经营养蛋白形式与HIC树脂间的结合强度还取决于流动相的pH，以中性条件为宜。正确折叠和错折叠神经营养蛋白的相对疏水性也取决于溶液的pH。变体与天然神经营养蛋白的分离还可通过在梯度或逐步洗脱时同时改变流动相的几个性能来实现。例如，在洗脱时同时改变流动相的盐浓度和非极性溶剂浓度可提供比只改变盐浓度时更佳的分辨力。
对于HIC，可采用本文所述的盐，包括硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸盐和氯化钾。根据所用的盐，盐浓度通常为0.5M-3M，更佳的为0.5-2.5M，以使神经营养蛋白与树脂的结合。例如，具有0.8-1.5M盐浓度的结合缓冲液对于NGF来说是较佳的，较高的盐浓度会使NGF沉淀在树脂上，从而导致回收率下降。对于NT-3,pH为7、盐浓度为1.0-2.5M的结合缓冲液是较佳的，1.25-1.75M氯化钠是更佳的，盐浓度为1.5M是最佳的。对于NT-4/5,pH为7、盐浓度为1-3M的结合缓冲液是较佳的，盐浓度为2-2.75M更佳，最佳的是2.5M氯化钠。在NT-4/5情况下，当2.5M氯化钠对于加样来说较佳时，则2M氯化钠并有有机溶剂存在(如10％醇，pH7)对于洗脱来说是较佳的。较佳的，用降低的盐浓度来洗脱和分离神经营养蛋白与其变体。为了实现洗脱，洗脱缓冲液中的盐浓度通常低于加样缓冲液，但是当用有机溶剂补充时可以是相同的浓度。
此外，采用有机溶剂还有另一个优点，如本文发现的，即加入有机溶剂改善了洗脱模式，使得峰曲线更窄。除了乙醇以外，还可用本文所述的其它有机溶剂，包括丙醇、异丙醇和低级烷二醇(如丙二醇、乙二醇和己二醇)。5-25％(v/v)(更佳的为5-20％(v/v))的有机溶剂通常能洗脱正确折叠的神经营养蛋白。采用有机溶剂的洗脱可以梯度或分步洗脱。pH范围宜接近中性至微呈酸性，从5-8，更佳的pH为6-8,6.5-7.5，最佳的为7。可采用本文所述的任何缓冲液，包括MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐、柠檬酸盐、铵、乙酸盐，只要缓冲液在所需pH范围内。
由于本发明者发现在重组生产神经营养蛋白时产生了某些不希望的神经营养蛋白变体，如本文所报道的，因此用高效阳离子交换层析(尤其是制备模式)能将电荷改变的变体(如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化和某些剪接形式(如C端截短的NGF形式))与天然神经营养蛋白分离。例如，导致电荷变化的N-端剪接形式(如缺少2-4个N端氨基酸)(在NT-4/5和NT-3情况下在细菌发酵时会产生)现在可被除去。在哺乳动物细胞培养产生的神经营养蛋白情况下，C端截短可在高电荷末端区域内发生。例如，118形式的NGF其C端可被误加工或切断成117、114和115形式。通过高效阳离子交换层析可将它们与天然的118NGF分开。特别佳的实例采用SP-Sepharose High Performance、Fractogel EMD SO3或聚天冬氨酸树脂，其中PolyCAT A是特别佳的。最佳的是，可大规模采用SP-Sepharose High Performance或Fractogel EMD SO3树脂。
本文所述方法获得的组合物是基本纯的神经营养蛋白，更通常的和较佳的是几乎纯的，它基本上不含神经营养蛋白变体，更佳的是几乎不含神经营养蛋白变体。例如在从CHO细胞培养中纯化出NGF后，典型的SP-Sepharose合并物含有约92％的118,4.6％的120,1％脱酰胺的NGF,1％氧化的NGF和1％的异天冬氨酸NGF。每一种类通常的量约为85-93％的118、0-5％的120(很大程度上取决于所用的内源和/或外源蛋白酶水解)、0-5％的117、0-3％的脱酰胺形式、0-2％的异天冬氨酸形式和0-2％的氧化形式。NGF的纯度(所有种类)通常大于99.5％。
在将神经营养蛋白从柱上洗脱下来后，将其与载体适当地配制成一组合物，最好是与生理上可接受载体配制成药物组合物。神经营养蛋白组合物最好是无菌的。本发明的神经营养蛋白组合物也可用于体外，例如，促进培养中神经元的生长和存活。
在5-37℃、pH范围为4.2-5.8下，研究了水溶液中重组人神经生长因子(NGF)的化学和物理稳定性。NGF的化学稳定性随pH增加而增加。在pH5.8琥珀酸盐缓冲液中，NGF的物理稳定性由于蛋白凝聚而降低。根据5℃稳定性数据和37℃下加速降解的研究，发现最优的配方是pH5.5下的乙酸盐缓冲液(见WO97/17087，纳入本文作参考)。反相HPLC是表明稳定性的主要方法，它显示在5℃时Asn-93转变成异天冬氨酸是主要降解途径。由于NGF单体变体随时间重排入各种混合的二聚体中(二聚体交换)，用阳离子交换层析定量分析NGF降解变得复杂。用稀酸处理样品和对照可迅速地平衡二聚体中的单体分布，从而使得可在没有二聚体交换下对NGF降解进行定量分析。评价苄醇和苯酚在两个多用途液体制剂中与rhNGF一起时的相容性和稳定性。这两种制剂由溶于20mM乙酸钠(pH5.5)、136mM氯化钠液中的0.1mg/mL蛋白组成，其中有和没有0.01％Pluronic酸(F68)(作为表面活性剂)。这两种制剂每一种中的苄醇和苯酚的最终浓度分别为0.9和0.25％。根据12个月稳定性的数据，在这些制剂中，rhNGF与苄醇一起比与苯酚一起更稳定。有表面活性剂时苄醇保存的rhNGF制剂与没有加入表面活性剂的制剂一样稳定，这表明无需为稳定目的而在rhNGF多剂量(multi-dose)配方中加入F68。因此，推荐用由20mM乙酸盐、136mM氯化钠、0.9％苄醇(pH5.5)液配成0.1mg/ml蛋白的rhNGF制剂用于多剂量Ⅲ期临床试验。该rhNGF多剂量配方在5℃6个月通过了USP和EP保藏效力测试，与浓度为2mg/mL的液体制剂同样稳定。然而，该制剂应避免受强光照射，因为作为保存剂存在的苄醇对光敏感。
通常，组合物可以含有其它组分，这些组分的量最好对稳定的液体或冻干形式的制品没有不利影响，并且适于有效安全的药物给药。
将神经营养蛋白与药学上可接受的载体一起配制，即该载体在所用的剂量和浓度下对接受者没有毒性，并与制剂中其它组分相容。例如，制剂最好不包括氧化剂和已知对多肽有害的其它化合物。该配制步骤可通过标准方法脱盐或渗滤来实施。
通常，制剂是通过使神经营养蛋白与液体载体、细分的固体载体或两者均匀紧密接触来制得的。然后，如果需要，可将产品制成所需的制剂形式。较佳的，载体是非肠胃载体，更佳的是与接受者血液等渗的溶液。这些载体的例子包括水、盐水、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。这里也可使用非水性载体如固化油和油酸乙酯以及脂质体。
载体适当地含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这些物质应在所用的剂量和浓度下对接受者没有毒性，它们包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括纤维素或其衍生物，海藻糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反离子如钠；和/或非离子表面活性剂，如多氧乙基醚、泊洛沙姆(poloxamer)或PEG。最终的制品可以是液体或冻干固体。
用于治疗给药的神经营养蛋白必须无菌。通过无菌滤膜(如0.2微米膜)过滤，很容易实现无菌。治疗性神经营养蛋白组合物通常置于一容器中，该容器有一个无菌入口，例如静脉注射溶液袋或小瓶，它们有一个可刺入皮下注射针头的塞子。上述制剂也适于体外用。
神经营养蛋白通常以水溶液或重建用冻干制剂的形式保存于单剂或多剂量容器中，例如，密封的安瓿瓶或小瓶中。冻干制剂的例子是，在10毫升小瓶中装有5毫升无菌过滤的1％(w/v)神经营养蛋白水溶液，并将所得混合物冻干。灌输用溶液通过用抑菌注射用水重建冻干的神经营养蛋白来制得。
将治疗有效剂量的神经营养蛋白制剂给予患者。这里的“治疗有效剂量”指对于给药的对象能产生效果的剂量。确切的剂量将取决于待治疗的疾病，它可由本领域技术人员通过已知的手段来确定。通常，本发明的神经营养蛋白制剂以每天约0.01μg/kg至100mg/kg的量给药。较佳的为0.1-0.3μg/kg。另外，如本领域所知的，需要针对年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物反应和疾病严重程度作调整，这可由本领域技术人员通过常规实验来确定。通常，临床医师将给予本发明的神经营养蛋白制剂直至剂量达到能修复、维持、最好能重建神经功能的水平。该治疗的进展很容易通过常规试验来监测。
神经营养蛋白可以任选地与其它神经营养性因子(包括NGF、NT-4/5、NT-3和/或BDNF)结合或共同给药，并与其它常规治疗方法一起用于神经疾病。
在NGF例子中，组合物宜包含药学上有效量的神经生长因子和药学上可接受的含乙酸盐缓冲液。组合物的pH为5至6。缓冲液宜为乙酸钠。乙酸盐浓度宜在0.1-200mM间。组合物中NGF的浓度宜在0.07-20mg/ml间。该组合物任选地还含有药学上可接受的保存剂，如苄醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、或对羟基苯甲酸丙酯。较佳的保存剂是苄醇。苄醇浓度宜在0.1-2.0％间。组合物可任选地含有药学上可接受的表面活性剂。而且，组合物可任选地(但是较佳的)含有生理上可接受浓度的氯化钠。更佳的组合物含有浓度至少约0.1mg/ml的神经生长因子和浓度为10mM-50mM的乙酸根离子。更佳的，组合物含有浓度为0.1-2.0mg/ml的神经生长因子和浓度为10-50mM的乙酸根离子。最佳的组合物含有浓度为0.1mg/ml的NGF、浓度为20mM的乙酸钠，pH5.5，氯化钠浓度为136mM，苄醇浓度为0.9％(v/v)。
另一个实例含有2.0mg/ml NGF、10mM乙酸钠、pH5.5，且氯化钠浓度为142mM。用0.1mg/ml NGF、20mM乙酸钠、136mM氯化钠、0.9％(v/v)苄醇(pH为5.5)来配制是较佳的。如本文所述的，118/118均二聚体是较佳的NGF形式。在pH约6-8下将NGF纯化至维持正常的二聚体形式。然而，(蛋白水解)剪接形式的百分数表示了单聚形式，它是明显的，可通过反相HPLC来测定。分析型HPLC的酸性条件使二聚体解离。NGF的不同二聚体形式(120/120、120/118、118/118)已有描述(Schmelzer等，J.Neurochem.59:1675-1683(1992)，全部纳入本文作参考的内容主要是用于本文研究工作的分析和生物试验以及通用理论)。该出版物报道说，各二聚体形式的体外活性是相同的。然而，相反的是，本文的研究第一次证明，以放射性受体为基础的试验测得，120/120二聚体的活性较差，约为118/118种类的80-90％。在一种形式的试验中，分离获得大鼠PC-12细胞膜，将其用于NGF标准品和各种测试种类间的竞争性结合。RRA具有P75和trkA二个受体。本文还发现，117/117种类具有与118/118种类一样的活性。而且，这里用PC-12为基础的试验确认是受体为基础的试验，结果表明120/120形式的活性约为118/118形式的60％。Burton等，J.Neurochem.59:1937-1945(1992)中全部纳入本文作参考的内容主要是用于本研究的分析和生物试验及其通用理论。
据认为118/118形式在患者人体内的生物利用率高于120/120形式。生物利用率至少增加4-5倍。这一差别是显著的，令人惊奇的，是本领域中没有预计到的。
提供下列实施例是为了便于描述，而非限制性。本说明书中所有引用的出版物均纳入本文作参考。
实施例实施例Ⅰ．118/118NGF均二聚体的纯化本实施例描述NGF的纯化以及每一步骤的原理。在每一个实施例中，本领域技术人员很容易确定和调节层析柱体积和流速，以补偿初始的培养体积和蛋白浓度，这是本领域中所熟知的。
收获细胞培养液用含有120个氨基酸的人NGF的编码DNA序列的表达载体转染重组CHO细胞。为了促进分泌和加工，还存在NGF前序列原。在培养重组CHO细胞后，收获细胞培养基。收获的细胞培养液(HCCF)含有NGF种类120、118和117。通常约40-70％的NGF是118/118均二聚体，其余为异二聚体120/118,120/120,还有少量118/117。如本文所述的，这些种类可用SP-Sepharose HP柱来分离。
用Millipore 10Kd截留膜(互换使用纤维素、复合材料或聚砜)将收获的细胞培养液浓缩约20倍。在浓缩物中加入0.1体积的1.0M Tris,pH8.2。用0.22um滤膜对稀释物进行微量过滤，并转移到盛放槽中于37℃下放置2-18小时。在盛放时用内源蛋白酶将120/120形式催化转变成118/118形式。
硅胶层析将微量过滤物调节至1M NaCl，并加入用1M NaCl、25mM MOPSO(pH7)平衡的硅胶柱上。用1M NaCl、25mM MOPSO,pH7洗柱。合适的pH范围约为pH6-8，较佳的pH为7。然后用25mM MOPSO,pH7洗柱。用低电导率洗涤除去宿主细胞蛋白。用50mM MOPSO,0.5M TMAC,20％试剂级无水乙醇(94-96％特殊变性醇制剂3A(5体积甲醇和100体积200验证(proof)乙醇)和4-6％异丙醇)来洗脱。可采用的其它醇例如有20％丙醇、20％异丙醇和20％甲醇。本文所用的术语“醇”和“醇溶剂”指醇常用术语的含义，较佳的是有1-10个碳原子的醇，更佳的是甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或叔丁醇，最佳的是乙醇或异丙醇。这些醇是溶剂，当其加入水溶液中时，它能通过降低溶液极性来增加溶液的疏水性。乙醇是最佳的。醇的下限是所洗脱的无论何种百分数，上限则要求避免蛋白变性而定。溶剂宜在5-25％间，更佳的为5-20％，还要佳的为5-15％。TMAC是氯化四甲铵，它用来洗脱NGF。TMAC可在0.1-1M之间。而0.3-0.7M是较佳的。用来洗脱NGF的TMAC的量随pH和醇浓度而变。pH越低，醇和TMAC的需量就越少。pH可在约4-8之间。在本实施例中，较佳的pH为7，这就使得在加入下一柱之前只需对合并的级分作最少的调节。pH上限由加入下一柱所需的pH而定，而下限则由有效洗脱NGF所用pH而定。
S-Sepharose Fast Flow(SSFF)层析合并含有NGF的洗脱液，用纯水稀释至电导率低于15.5ms/cm，并调节至pH7.0。该物质不能放置8小时以上，因此还有一些蛋白酶存在；然而，没有发现有将120氨基酸NGF转变成118形式的内源蛋白酶活性。将该物质加入经25mM MOPSO,pH7平衡的S-Sepharose Fast Flow层析柱(阳离子交换树脂S-SEPHAROSE TM琼脂糖Fast Flow TM(Pharmacia))中。用25mM MOPSO,pH7洗柱。合适的pH范围为6-8，较佳的为pH7。然后用0.16MNaCl,pH7洗柱。用0.5MNaCl,pH7洗脱结合的NGF。洗脱盐摩尔浓度在0.3-1.0M范围内，更佳的为0.4-0.6M内。下限由洗脱所有NGF所用的浓度而定，上限由避免去除污染物和避免在柱上引起干扰NGF洗脱的疏水性作用的需求而定。可采用其它盐，KCl是另一种较佳的盐。为获得体积小的合并物，用0.5M NaCl,pH7洗脱是较佳的，在较高的盐浓度(如1M以上)下，紧密结合的污染物会被洗脱。
苯基Toyopearl650M层析合并含有NGF的SSFF柱级分，调节至1M NaCl，并加入苯基Toyopearl 650M柱中。用25mMMOPSO,pH7洗柱。合适的pH范围约为5-8。用10倍柱体积的线性梯度洗脱结合的NGF，起始梯度缓冲液A为25mM MOPSO,pH7,1.0MNaCl，结束的梯度缓冲液B为20％醇，80％25mM MOPSO,pH7。用SAS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析含NGF的级分，确定那些级分携带NGF前体种类。选择并合并含有NGF的级分，基本除去不正确加工的变体，如其中存在部分前体序列的那些，例如前体NGF、杂交前体NGF和剪接的前体NGF序列，以获得基本上不含任何NGF前体序列的NGF组合物。苯基柱还除去了少量的糖基化NGF和糖基化NGF前体序列。前体NGF、剪接前体NGF序列，以及NGF和前体NGF的糖基化形式在NGF峰的前缘洗脱出来。因此，该柱很容易将NGF与各种NGF种类分开，获得基本上不含这些种类的NGF组合物。在该步骤中，用HIC可分离出各种NGF疏水性变体，主要的误加工变体，包括蛋白水解和糖基化变体。
分离NGF各形式的最适用介质是具有固定化苯基官能团的那些介质。不同厂商的苯基为基的HIC介质在分辨这些NGF形式时表现出不同的效力。采用TosoHaas的Phenyl Toyopearl介质可获得最佳效果。H1C树脂苯基Sepharose FastFlow Low Sub(低取代)和TSK Phenyl 5PW有很好的作用。其它HIC官能团并不非常适用，它们在这些条件下的效果稍差一些，包括烷氧基、丁基和异戊基部分。
苯基Toyopearl合并物含有75％的118、10％的120、7％的117、1.8％脱酰胺化NGF、1.4％氧化的NGF和2.0％异天冬氨酸NGF，其余2.8％为其它未经鉴定的NGF种类。
任选地，对合并的级分进行酸处理，在pH低于3.95下进行病毒灭活至少15分钟。
SP-Sepharose HP层析用0.5-1体积的水稀释HIC合并物，将稀释的合并物调节至pH6。将合并物加入SP-Sepharose HP柱中，该柱用0.2M氯化钠、20mM琥珀酸盐，pH6且含有5％试剂级醇溶液平衡(如硅胶柱步骤中所述)。用0.2M氯化钠、20mM琥珀酸盐，pH6且含有5％试剂级醇溶液(制剂SDA-3A醇；醇可任选地存在)洗柱。醇有助于减少NGF与树脂骨架间的非特异性(大多数为疏水性)相互作用。合适的醇范围约为0-10％。加样pH约为pH5-8，选择的pH应达到和维持NGF最大稳定性以及与NGF变体最大程度的分离。用2倍柱体积的平衡缓冲液洗柱。混合11倍柱体积的梯度缓冲液A(0.25M NaCl,0.02M琥珀酸盐，pH6，含有5％醇)和11倍柱体积的梯度缓冲液B(0.5M NaCl,pH6)，用该22倍柱体积的线性梯度液洗脱结合的NGF并使其与变体分离。醇是任选地。118/118NGF通常在0.35-0.40M NaCl浓度处被洗脱。
分析各柱级分的NGF和NGF变体含量。各级分最好如Schmelzer等(1992)(同上)，和Burton等(1992)(同上)所述的C4RP-HPLC来分析。选出级分并合并成基本上不含变化的NGF变体(如带电荷种类，如氧化的、脱酰胺的和异天冬氨酸NGF种类)的NGF组分。前面的HIC柱不能有效除去其它形式的NGF变体(如氧化的和异天冬氨酸NGF)。此HIC柱则能有效地除去错折叠的蛋白和糖基化的蛋白(与HIC树脂的结合比正确折叠的NGD更牢固)，因为它们更具疏水性。因此，阳离子交换树脂(如SP-Sepharose HP)可用来除去未被HIC树脂除去的电荷改变的变体。
SP-Sepharose合并物通常含有约92％的118,4.6％的120,1％的脱酰胺NGF,1％的氧化NGF和1％的异天冬氨酸NGF。通常，各种类的量的范围是约85-93％的118,0-5％的120,0-5％的117,0-3％的脱酰胺形式，0-2％的异天冬氨酸形式和0-2％的氧化形式。NGF(所有种类)的纯度通常大于99.5％。
配制将SP-Sepharose HP合并物超滤/渗滤到制剂缓冲液中制成制剂。最好采用酸性缓冲液，最好是如上所述pH5乙酸盐。118/118NGF组分基本上不含NGF变体，是基本纯的NGF。配制的材料适于治疗神经元疾病，尤其是与糖尿病相关的外周质神经元病和AIDS相关的外周质感觉神经元病。
实施例Ⅱ．大规模纯化120/120NGF均二聚体收获的细胞培养液(HCCF)大致按实施例1所述，从12000升CHO细胞培养中获得HCCF。HCCF中的NGF种类分布为约40-65％的120/120均二聚体和120/118异二聚体，其余为118/118均二聚体。通常对培养基进行迅速加工，以最大程度减少120蛋白水解变成118。
Macroprep High S阳离子交换层析将HCCF加到Macroprep High S阳离子交换层析柱，用1.5M乙酸钠、50mMHEPES,pH7洗涤。用1.5M NaCl,0.25M TMAC,0.2％硫二甘醇，pH7洗脱结合的NGF。然后调节乙酸盐浓度，使Macroprep柱在pH5-8下操作。氯离子是较佳的乙酸根离子替代物。NGF由于TMAC梯度而被洗脱。TMAC是具有离子和疏水性的盐，这是有用的性质，因为一些树脂的主链支架含有促进NGF与树脂间非特异性作用的疏水性成分。通常，对于pH约为6-8的洗脱缓冲液来说，TMAC可采用0-3M的浓度。合并含有NGF的级分。
硅胶层析将合并物直接加样到硅胶层析柱中。硅胶提供混合模式的层析树脂，它有离子性、具有极性以及在蛋白结合性质中起部分作用的疏水性作用。用1M氯化钠、25mM MOPSO,pH7平衡柱。用1M氯化钠、25mM MOPSO,pH7(较佳的pH约为5.0-8.5，更佳的为6-8，最佳的为7)洗柱。用25mM琥珀酸盐、pH3.9,50mMTEAC(氯化四乙铵)洗脱结合的NGF。TEAC是比TMAC更强的洗脱剂。较佳的pH范围约为pH3.5-8。然而，为了防止或减少脱酰胺NGF种类的形成，应避免长时间处于pH7.5以上。通常，缓冲液的pH越低，从硅胶柱洗脱NGF所需的混合性能的盐(如TMAC或TEAC)浓度就越低。在pH4至5附近有良好缓冲性能的缓冲液是适用的。洗脱缓冲液中存在盐是任选的，这样，在施加洗脱缓冲液前，此柱可用无盐MOPSO缓冲液洗涤。
苯基Sepharose Fast Flow层析鉴定含有NGF的级分并合并。将合并物调节至0.7M乙酸盐，pH7,25mMMOPSO。将调节的合并物加入经梯度缓冲液A(0.7M乙酸盐、25mM MOPSO、pH7)平衡的苯基Sepharose Fast Flow层析柱上。进行梯度洗涤，从90％梯度缓冲液A(0.7M乙酸盐、25mM MOPSO、pH7)洗至10％梯度缓冲液B(25mM MOPSO,pH7,20％丙二醇)。可用其它二醇(如己二醇)代替。通常洗涤约2-3倍柱体积或直至达到稳定的OD基线。洗涤除去了一些宿主细胞蛋白。用10倍柱体积的线性梯度(从90％梯度缓冲液A和10％梯度缓冲液B的混合液至10％梯度缓冲液A和90％梯度缓冲液B的混合液)洗脱结合的NGF。可用氯化钠或硫酸钠代替HIC缓冲液中的乙酸盐。pH宜约为5-8，更佳的约为5.5-7.5,pH6-8可接受，最佳的约为7。柱可分离任何残余的前体序列、部分前体序列或糖基化形式，它们以均二聚体的形式或成熟NGF单体与具有部分前体序列的NGF单体的异二聚体形式存在。NGF的前体和糖基化形式在洗脱峰的前缘中，这样，合并的含NGF级分基本上排除了这些种类。
经在分析性HPLC系统上分离和检测，HIC合并物含有约72％的120单体、17％的118单体、2.8％117单体、3.6％R120单体、0.8％异天冬氨酸形式、1.3％氧化形式和1％的脱酰胺形式。
SP-Sepharose HP层析合并HIC步骤的含NGF级分。使柱流出液在合适时间直接流入合并槽(盛放槽)可大规模地实现这一点。将合并物的pH调至pH6，并施加到SP-Sepharose HP层析柱上。用20mM琥珀酸盐，0.2M NaCl,pH6(梯度缓冲液A)洗柱。用22倍柱体积梯度液(从70％梯度缓冲液A和30％梯度缓冲液B的混合液开始，到80％梯度缓冲液B(0.7M NaCl/pH6)和20％梯度缓冲液A的混合液结束)洗脱结合的NGF。pH宜在5-8之间，更佳的为5.7-6.5，最佳的为pH6。典型的层析谱如图1所示。
SP-Sepharose HP合并物通常含有约95％的120形式，3％的R120形式，0.65％的异天冬氨酸形式，0.6％的氧化形式，0.6％的脱酰胺形式。其它未鉴定的NGF形式约为0.6％，其包含具有脱酰胺Asn45的二氧化NGF(Met37和Met92)。图2显示了HPIEX分析，比较了典型HIC合并物(加到SP-Sepharose树脂上)与SP-Sepharose层析后获得的合并物。NGF的三种主要的剪切形式(120、118和117)均可以有变体，但是，在纯化时主要剪切形式(本实施例中为120)的变体(如氧化的和异天冬氨酸形式)会遮蔽对次要形式(本实施例中为118和117)的变体的分析。图3显示了代表性运作所得级分的HPLC分析结果。
SP-Sepharose HP有效地除去了HIC合并物中存在的变体。R120形式在NGFN端上有一个额外的精氨酸残基；rhNGF的N端氨基酸序列通常是SSSHP，但是R120的N端序列却是RSSSHP。因此，R120形式比成熟NGF更具碱性，它可用SP-SHP分离。它也有较低的生物活性，这可能与NGF N端是受体(trkA)结合必需的事实有关。氧化的NGF形式是单氧化的形式，其37位的甲硫氨酸被氧化，产生了在NGF峰前缘洗脱出的更酸性的形式。异天冬氨酸形式的氨基酸93位天冬氨酸有修饰。异天冬氨酸形式稍呈碱性，因此与SP-Sepharose HP树脂的结合稍稍更牢固一些。含有异天冬氨酸93的NGF种类在洗脱峰的后缘洗脱。脱酰胺发生在天冬酰胺(通常是45位的天冬酰胺)残基上。含有脱酰胺Asn(在45位形成Asp)的NGF稍呈酸性，出现在洗脱峰前缘。
Fractogel EMD SO3是SP-Sepharose HP树脂以外分离NGF带电荷变体种类的另一种次佳的树脂。当采用此次佳的树脂时，需要更高浓度的氯化钠来洗脱NGF。
配制如前述实施例所述，将大量材料超滤/渗滤到配制用缓冲液中制成制剂。在最终的大量产品中，120形式的范围通常约为92-97％,R120形式约有1-4％、异天冬氨酸形式约有0.2-1.5％，氧化形式约有0.2-2％，脱酰胺形式约有0.2-2％。117和118形式通常少于约2％。最终的大量产品通常至少为99.5％纯的NGF(包括所有种类)。
实施例Ⅲ．118/118的分离在获得基本上不含NGF变体的基本纯118/118NGF组分的一个较佳实例中，按实施例Ⅱ的方法并作如下改动。在Macroprep High S柱和硅胶柱之间采用一个固定化的胰蛋白酶柱。在调节pH至pH5-8.5(最典型的为6.5-7.5)之间后(如果需要)，将Macroprep合并物直接加入固定化胰蛋白酶柱上。使合并物通过此柱，其此期间大多数NGF转变成118形式。通过C端VRRA断裂成VR，蛋白酶消化将120形式转变成118形式。为了实现有限的、选择性的断裂，采用了胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶，较佳的是胰蛋白酶，更佳的是很容易获得的猪胰蛋白酶，或是牛胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。可采用能提供基本上有限的选择性断裂的任何蛋白水解方法，但是较佳的是固定化胰蛋白酶柱，以使NGF制备物所受污染最少。此柱运作在诱导蛋白酶活性的pH下进行，较佳的pH为5.5-8.5，更佳的为6.0-8.0，最佳的为6.5-7.5。
在该实施例中，如本文所述，通过HIC除去糖基化的NGF。在本文实施例Ⅱ所述的SP-Sepharose HP步骤(但宜采用22倍柱体积的0.3M-0.55M盐梯度)后，获得了较佳的临床用NGF组合物。获得的组合物有大于70％的118单体，少于10％的120单体，少于15％的117单体(经RPHPLC试验测得)。通常，获得的组合物含有大于等于90％118/118rhNGF，更通常地有大于等于93％的118/118rhNGF和小于等于约7％的脱酰胺、异天冬氨酸和氧化的变体。获得更高纯度的一种方式是避免选择含有显著数量变体的级分，例如在神经营养蛋白主峰(如118/118rhNGF峰)前缘和后缘中发现的级分。
实施例Ⅳ．细菌包含体rhNT-4/5的部分纯化和重折叠在本实施例中，以10或60升发酵液为原料，纯化rhNT-4/5。在本实施例所述发酵液中用来生产重组人NT-4/5的宿主是大肠杆菌株系27C7/pmNT5DT；但是其它株系和生物产生的NT-4/5也适用于本文所述的纯化方法。本实施例中所用的表达质粒含有成熟NT-4/5的编码序列，该编码序列在NT-4/5基因在大肠杆菌中表达所需的转录和翻译控制序列的控制下。在NT-4/5表达质粒中，用来在大肠杆菌中表达基因的转录序列由碱性磷酸酶启动子序列提供。λ转录终止子位于NT-4/5终止密码子的毗邻。胞质蛋白的分泌由STⅡ信号序列指引。大多数rhNT-4/5见于细胞周质间隙成折射体。质粒赋予转化的宿主四环素抗性。发酵过程在35-39℃、pH7.0-7.8下进行。使发酵进行25-40小时，在收获前使培养物冷却。用连续流动式装置在60℃下进行热处理以灭活培养物，或在该温度下进行罐内热灭活5-15分钟。用AXα-laval离心机或等效设备离心热灭活的培养物。回收得到大肠杆菌细胞沉淀。
用标准方法裂解在包含体内表达重组人NT-4/5的大肠杆菌细胞，制得包含体内含有的NT-4/5的浆状物。缓冲液中没有加入蛋白酶抑制剂。
为了从细胞碎片中分离出包含体，用旋转式、机械分散装置(例如Turrax)将大肠杆菌NT-5浆状物重悬在0.02M Tris,pH8,5mMEDTA(每克浆状物10ml缓冲液)中。使细胞悬液在6000psi下三次通过微量流化器(microfluidizer)。使所得匀浆物在Sorvall RC-3B离心机中5000rpm下离心45分钟。弃去上清，用turrax中等速度下2-3分钟使沉淀重悬在20mM Tris,pH8,5mM EDTA(抽提缓冲液)中。如上所述离心匀浆物。将沉淀重悬在抽提缓冲液中，并如上所述进行离心。将所得沉淀(指NT-4/5包含体或折射体)保藏于-70℃。
如下所述从包含体中分离出NT-4/5。用turrax中等速度约10分钟使包含体沉淀悬浮于20mM Tris,pH8,6M尿素，25mM DTT(每克包含体10毫升缓冲液)中。在2-8℃下搅拌该悬液40分钟，并在Sorvall RC3B中5000rpm离心约45分钟。在上清液中加入PEI(聚乙烯亚胺)至0.1％，在2-8℃下搅拌30分钟。PEI使核酸和其它酸性电荷分子沉淀。使混合物在Sorvall RC3B中5000rpm下离心约45分钟。将PEI上清液加入DEFF Sepharose Fast Flow柱(10cm×14cm；DEFF是二乙基氨基乙基树脂)中，该树脂用0.02M Tris,6M尿素，10mM DTT,pH8平衡。将1kg溶解的折射体等价物加入DEFF柱中。由于还原和变性的NT-4/5不与DEFF树脂结合，收集含有NT-4/5和6M尿素的流通合并物(图6)，用乙酸使合并物的pH降低至5.0。将经pH调节的DEFF流通合并物加入S-Sepharose Fast Flow柱(S指树脂上的SO3官能团)，该柱用20mM乙酸，pH5(含有6M尿素)平衡，在该条件下NT-4/5与树脂结合。在加样后，用数倍柱体积的平衡缓冲液洗涤S-SepharoseFast Flow柱。用0.5M NaCl,20mM乙酸钠，6M尿素，pH5洗脱结合的NT-4/5(图7)。用20mM Tris,0.14NaCl,pH8透析0.5M NaCl SSFF合并物过夜，该条件使得NT-4/5重折叠(尽管不正确)。错折叠的rhNT-4/5分子凝聚成沉淀。
对凝聚的错折叠rgNT-4/5进行加工，获得正确折叠的NT-4/5。离心，收集凝聚的错折叠rhNT-4/5沉淀。将沉淀重悬于0.2M Tris,pH8,4M尿素，5mM DTT中，2-8℃搅拌大约1或2小时，或搅拌直至沉淀溶解。根据280nm下的消光系数为1.8，将最终的蛋白浓度调节至约10mg/ml蛋白。在溶解的沉淀溶液中加入氧化的谷胱苷肽至最终浓度20mM，然后2-8℃下稍稍搅拌15-30分钟。氧化的谷胱苷肽与NT-4/5的巯基反应，生成NT-4/5-S-谷胱苷肽混合二硫化物。使NT-4/5-SG混合的二硫化物在100mM Tris,20mM甘氨酸，15％PEG-300,1M盐酸胍，pH8.3中稀释至最终蛋白浓度为0.1-0.5mg/ml。为了引导NT-4/5适当地重折叠，在重折叠混合物中加入浓度为2-4mM的半胱氨酸，然后在溶液中通入(鼓泡通过)氮气或氦气5-60分钟，然后密封容器，以排除氧气。使NT-4/5的重折叠在2-8℃下进行18-24小时。
或者，如下进行亚硫酸水解(sulfitolysis)来使rhNT-4/5重折叠。将包含体沉淀(110g)悬浮在1.1升20mM Tris,7M尿素，10mM甘氨酸，100mM亚硫酸钠，10mM连四硫酸钠中，用turrax在中等速度下促溶解10分钟。然后在2-8℃下搅拌混合物(1260毫升)45分钟。加入PEI至最终浓度为0.1％。4℃下再搅拌混合物30分钟，在RC3B离心机中5500rpm下离心45分钟。将上清液加入经20mM Tris,6M尿素，pH8平衡的DEFF柱(4.4cm×25cm)中。用乙酸将DEFF流通液调至pH5，然后加入经20mM乙酸盐，6M尿素，pH5平衡的S-Sepharose Fast Flow柱(4.4cm×25cm)中。用25mM MOPSO,0.5M NaCl,pH7洗脱NT-4/5。
将含有磺酰化rhNT-4/5的SSFF0.5M氯化钠合并物稀释成约0.1mg/ml蛋白，并调至1M盐酸胍，100mM Tris,20mM甘氨酸，15％PEG-300,pH8.3。加入2-4mM半胱氨酸使NT-4/5开始重折叠。重折叠反应基本上在24小时内完成。还可任选地通入惰性气体(如氦气或氮气)代替溶液中的氧气。
实施例Ⅴ．从构象(错折叠)变体中分离出正确折叠的rhNT-4/5将实施例Ⅳ的rhNT-4/5重折叠混合物对pH4或5的溶液透析过夜，以除去胍和其它试剂。为了使溶液澄清，可使溶液在500rpm下离心45分钟，或使其通过0.2μm的滤膜。
加入冰醋酸，将含0.5-5克蛋白的澄清上清液调节至pH3-5，然后加入C4RP-HPLC柱中，或是-20℃冷冻保藏直至准备纯化。在本实施例中，将酸化的澄清溶液加入C4RP-HPLC柱(3cm×50cm)中，折叠的rhNT-4/5在柱中与树脂结合。用0.05％三氟乙酸(TFA)溶剂系统配的乙腈梯度(26-40％的乙腈梯度(在95分钟以上)，以0.05％TFA配，流速为25毫升/分钟)洗脱正确折叠的NT-4/5。以1-1.5分钟的间隔收集级分(图8)。通过比较正确折叠的NT-4/5在分析性C4HPLCVydac(0.21×15cm)柱上的洗脱时间与正确折叠的NT-4/5标准品的洗脱时间来分析级分(图9)。用每分钟2.5毫升的流速和0.5％TFA/乙腈缓冲系统，正确折叠的完整的NT-4/5标准品通常在19分钟时洗脱。合并含有正确折叠rhNT-4/5的级分，调节pH至5-7。该正确折叠的rhNT-4/5合并物还含有氨基甲酰化和N端剪切形式的NT-4/5。
制备性反相液相层析树脂是一种较佳的介质，它的粒径约为10-40微米，孔径约为200-400埃，并有C4、C8或C18烷基。更佳的，树脂的粒径约为15-40微米，孔径约为300埃，是C4硅胶介质。
实施例Ⅵ．从构象(错折叠)变体中分离正确折叠的rhNT-4/5的另一种方法用Millipore-Pellicon超滤系统(具有20平方英尺截留分子量为10kD的纤维素(或聚砜或等价物)膜)将实施例Ⅳ的重折叠rhNT-4/5混合物浓缩大约10倍。使浓缩的混合物对50升50mM乙酸盐，pH5.5,50mM NaCl透析过夜，或渗滤到50mM乙酸盐，50mM NaCl,pH5.5中，然后通过0.2微米膜通过。
将过滤的重折叠混合物调节至2.5M NaCl,20mM MOPSO,pH7，并加入预先用2.5M NaCl,20mM MOPSO,pH7平衡的HIC柱苯基Toyopearl 650M柱(10cm×19cm)中。然后用平衡缓冲液洗柱。一些错折叠形式的rhNT-4/5分子在流通级分中被洗脱，而其它错折叠形式在高浓度有机溶剂(如20-40％试剂级醇)中洗脱。用2M氯化钠，10％试剂醇，pH7将正确折叠的rhNT-4/5从苯基柱上洗脱(图10)。可用其它苯基树脂如苯基Sepharose代替Toyopearl主链。这里所述的可采用的盐包括硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸盐和氯化钾。根据所用的盐，盐浓度通常为1M-3M，当有有机溶剂存在时，2.5M NaCl适用于加样，而2M NaCl适用于洗脱。较佳的，用降低盐浓度来洗脱和分离神经营养蛋白和其变体。为了实现洗脱，洗脱缓冲液中的盐浓度通常低于加样缓冲液，但是在有有机溶剂补充时，浓度可以相同。另外，采用有机溶剂有其它优点，如本文所发现的，加入有机溶剂可改善洗脱模式，使峰曲线变得更窄。除了乙醇以外，还可用本文所述的其它有机溶剂，包括丙醇、异丙醇和低级烷二醇(如丙二醇、乙二醇和己二醇)。5-25％(v/v)(更佳的为5-20％(v/v)，还要佳的为5-15％)的有机溶剂通常能洗脱正确折叠的神经营养蛋白。有机溶剂洗脱可以是梯度或分步洗脱。pH范围宜接近中性至微酸性，从pH5-8，更佳的pH为5.5-7.5，最佳的为7。可采用本文所述的任何缓冲液，包括MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐、柠檬酸盐、铵、乙酸盐，只要缓冲液在所需pH下。
实施例Ⅶ．从化学变体中纯化正确折叠的rhNT-4/5采用SP-Sepharose HP树脂或Poly Cat a HPLC树脂通过高效阳离子交换层析，从化学变体(包括氨基甲酰化和N-端剪切形式的rhNT-4/5)中分离出正确折叠的、完整的rhNT-4/5。
当用C4RP-HPLC柱来除去错折叠变体时，将C4RP HPLC合并物调至pH5-7，加入经20mM琥珀酸盐，pH6,5％试剂醇，0.2M NaCl平衡的SP-SepharoseHP柱(7cm×19cm)中。用平衡缓冲液洗涤结合有NT-4/5的树脂。用22倍柱体积(CV)从0.2M NaCl到0.4M NaCl(pH6)的梯度液(即平衡缓冲液配的盐梯度)洗脱结合的rhNT-4/5，使其与氨基甲酰化和N端剪切形式分离(图11)。合并含有NT-4/5的级分，将其配成0.05M乙酸盐，pH4-5。最好用分析性RP-HPLC或SDS-PAGE，如本文所述的与标准品比较，来鉴定完整的rhNT-4/5并与级分中的变体区分开。
或者，通过在聚天冬氨酸柱(PolyCAT a,PolyLC,Columbia,Md.)(9.4×200cm)上进行高效阳离子交换HPLC来除去变体形式的NT-4/5(图12)。将C4HPLC合并物调节至pH5-6，然后加入Polycat a柱中。层析条件是缓冲液A是20mM磷酸盐，5％乙腈，pH6；缓冲液B是20mM磷酸盐，5％乙腈，0.8M KCl,pH6。在65分钟内用25-60％缓冲液B的梯度洗脱rhNT-4/5(图12)。以1分钟间隔收集各级分，如上所述用分析性C4 HPLC分析。
当用HIC来除去错折叠变体(上述实施例Ⅵ)时，使正确折叠的NT-4/5合并物以20mM琥珀酸盐，0.1M NaCl,5％试剂醇，pH6透析过夜，或者超滤/渗滤(UF/DF)人20mM琥珀酸盐缓冲液中。然后如上所述，将透析的或UF/DF合并物加入SP-Sepharose HP或PolyCAT a柱中。
配制。合并含有正确折叠的、完整的NT-4/5(来自SP-Sepharose HP或PolyCATa HPLC步骤)的级分，在20mM乙酸盐，pH4-5的配制缓冲液配成浓度1-5mg/ml。或者，用超滤/渗滤来配制NT-4/5。
用氨基酸分析、N-端序列分析、质谱法、SDS-PAGE(图13)和生物试验分析最终的本体(bulk)溶液。用激酶受体激活(KIRA)试验来鉴定纯化的rhNT-4/5，该试验是检测NT-4/5激活细胞膜中酪氨酸激酶受体(trkB)的自磷酸化。采用表达具有gD标记的trkB的CHO细胞。WO95/14930(1995年6月1日出版)描述了KIRA试验，其纳入本文作参考。在该试验中，rhNT-4/5的EC50为12.6ng/ml。如本文所述纯化的正确折叠、完整的NT-4/5的EC50通常在5-30之间，更佳的为10-20。
rhNT-4/5相对于非NT-4/5蛋白的纯度通常在90-99％之间。NT-4/5相对于氨基甲酰化和N端剪切变体的均一性在90-99％之间。更通常的且较佳的是，纯度和均一性为99％或更高。
实施例Ⅷ．细菌包含体中的rhNT-3的初步纯化、重折叠和最终纯化为了从细胞碎片中分离出包含体，用旋转式机械分散装置(例如turrax)将大肠杆菌NT-3浆状物(1kg)重悬在10L100mM乙酸钠，pH5中。使细胞悬液在6000psi下三次通过微量流化器(microfiuidizer)。使所得匀浆物在Sorvall RC-3B离心机中5000rpm下离心30分钟。
如下所述，从包含体中分离出NT-3。用turrax中等速度使包含体沉淀在100mM Tris,100mM NaCl,5mM EDTA,100mM亚硫酸钠，10mM连四硫酸钠，7.5M尿素，pH8.3(每克包含体10毫升)中悬浮约10分钟。在2-8℃下搅拌该悬液约1小时。加入PEI(聚乙烯亚胺)至约0.1％(最终浓度)，在2-8℃下搅拌30分钟。使混合物在Sorvall RC3B中5000rpm下离心约30分钟。用Gelman Preflow柱体过滤上清液。过滤的上清液用3倍柱体积S-Sepharose Fast Flow平衡缓冲液(50mM乙酸钠，5M尿素，pH5)稀释。将稀释的过滤的上清液(电导率低于7ms)加入经50mM乙酸钠，5M尿素，pH5平衡的S-Sepharose FF柱中。首先用50mM乙酸钠，5M尿素，pH5洗柱，然后用50mM MOPS,5M尿素，10mM甘氨酸，pH7.0洗柱。用10倍柱体积梯度液(从0-0.6M NaCl，在50mM MOPS,5M尿素，10mM甘氨酸，pH7配)从柱中洗脱出亚硫酸化(sulfitolyzed)的NT-3。
S-Sepharose FF合并物以重折叠缓冲液(含有0.1M Tris,2M尿素，0.1M NaCl,15％PEG300,10mM甘氨酸，25mM乙醇胺，pH9.1)稀释成约0.1mg/ml蛋白，使部分纯化的NT-3重折叠。加入半胱氨酸至约5mM，开始重折叠，在2-8℃下搅拌2-5天。重折叠缓冲液中可任选地喷入氦气或氩气来减少重折叠溶液中的氧浓度。
将重折叠合并物的pH调至7，过滤，并加入经50mM HEPES,pH7平衡的Macroprep High S阳离子交换层析柱上。在将pH调节过的重折叠合并物加入Macroprep柱中后，首先用50mM MOPS,pH7洗柱，再用50mM MOPS,0.1M TMAC,0.3M NaCl,pH7洗柱。NT-3用50mM MOPS,0.25M TMAC,1.5M NaCl,pH7洗脱。
然后在苯基Sepharose Fast Flow High Substitution柱上进一步纯化Macroprep合并物。苯基柱用50mM HEPES,1.5M NaCl,pH7平衡，将macroprep合并物直接加入苯基柱中。用平衡缓冲液洗柱，然后用15倍柱体积从50mM HEPES,1.5MNaCl,pH7到50mM HEPES,10％试剂醇，pH7的梯度液洗脱正确折叠的NT-3。用C4HPLC或SDS-PAGE分析各级分，合并含有正确折叠NT-3的级分。
将苯基合并物稀释至低于25mS(通常用约2倍体积的水)，并加入预先经25mM MOPSO,pH7中平衡的SP-Sepharose HP柱中。首先用平衡缓冲液洗柱，然后用20倍柱体积从0.35M TMAC到0.65M TMAC(以25mM MOPSO,pH7配)的梯度液将NT-3洗脱下柱。合并含有rhNT-3的级分(通过C4HPLC试验来判断)。
在10000分子量膜上将SP-Sepharose HP合并物浓缩至大约1mg/ml，然后用6体积的10mM乙酸盐，140mM NaCl,pH5.0渗滤。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Genentech,Inc.
(ⅱ)发明名称神经营养蛋白的纯化(ⅲ)序列数目6(ⅳ)通信地址(A)收件人Genentech,Inc.
(B)街道1 DNA Way(C)城市圣佛朗希斯科(D)州加利福尼亚(E)国家USA(F)邮编94080(ⅴ)计算机可读形式(A)记录介质类型3.5inch,1.44Mb软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WinPatin(Genentech)(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)在先申请资料(A)申请号60/030838(B)申请日1996年11月15日(ⅶ)在先申请资料(A)申请号60/047855(B)申请日1997年5月29日(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Torchia,PhD.,Timothy E.
(B)登记号36,700(C)参考/案卷号P1063R2PCT
(ⅸ )通讯信息(A)电话650/225-8674(B)电传650/952-9881(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度241氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly1 5 10 15Ile Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His20 25 30Thr Ile Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp35 40 45Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala50 55 60Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg65 70 75Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser80 85 90Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe95 100 105Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys110 115 120Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val125 130 135Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr140 145 150Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile155 160 165Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg170 175 180Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys185 190 195His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala200 205 210Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile215 220 225Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg230 235 240Ala241(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度120氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys1 5 10 15Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp20 25 30Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn35 40 45Asn Ser Val Phe Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp50 55 60Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His65 70 75Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu
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(A)长度118氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser1 5 10 15Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp20 25 30Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser35 40 45Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro50 55 60Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His65 70 75Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu80 85 90Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile95 100 105Asp Thr Ser Cys Val Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg110 115 118(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度119氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp1 5 10 15Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile20 25 30Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn35 40 45Ser Pro Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala50 55 60Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp65 70 75Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr80 85 90Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp95 100 105Thr Ser Cys Val Ser Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr110 115 119(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度130氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala1 5 10 15Val Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala20 25 30Val Asp Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro35 40 45Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg50 55 60Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly65 70 75Gly Gly Cys Arg Gly Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys
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权利要求
1．一种从含有其它蛋白的混合物中分离神经营养蛋白的方法，该方法包括用疏水作用层析树脂将神经营养蛋白与混合物中的其它蛋白分离开来。
2．根据权利要求1所述的方法，其中混合物包括该神经营养蛋白的错折叠变体、蛋白水解加工不正确的变体或糖基化变体。
3．根据权利要求1所述的方法，其中分离包括将含有神经营养蛋白、该神经营养蛋白的错折叠变体、蛋白水解加工不正确的变体或糖基化变体的混合物加样到疏水作用层析树脂上，在使神经营养蛋白与变体分离的条件下从树脂中洗脱出神经营养蛋白。
4．根据权利要求1所述的方法，其中树脂包含有苯基官能团。
5．根据权利要求1所述的方法，其中加样到疏水作用层析树脂上的混合物的pH为5到8。
6．根据权利要求1所述的方法，其中加样到树脂上的混合物的盐浓度为0.5M到3M。
7．根据权利要求6所述的方法，其中加样到树脂上的混合物的盐浓度为0.5M到2.5M。
8．根据权利要求7所述的方法，其中加样到树脂上的混合物有盐浓度为0.7M的乙酸盐或1.0M到2.5M的氯化钠。
9．根据权利要求3所述的方法，其中洗脱缓冲液包含有有机溶剂。
10．根据权利要求9所述的方法，其中有机溶剂体积占5％到20％。
11．根据权利要求3所述的方法，其中洗脱缓冲液的pH为pH5到pH8。
12．根据权利要求3所述的方法，其中洗脱包括降低的盐梯度。
13．根据权利要求1所述的方法，其中神经营养蛋白是NGF超家族中的蛋白。
14．根据权利要求12所述的方法，其中神经营养蛋白是NGF、NT-4/5或NT-3。
15．根据权利要求1所述的方法，其中神经营养蛋白从细菌培养制得，在使用疏水作用树脂前使其在体外重折叠。
16．根据权利要求1所述的方法，其中神经营养蛋白从哺乳动物细胞培养中分离获得。
17．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括用高效阳离子交换层析树脂从神经营养蛋白的化学变体中分离出神经营养蛋白。
18．根据权利要求17所述的方法，其中高效阳离子交换层析分离步骤包括将包含神经营养蛋白和该神经营养蛋白化学变体的混合物加样到高效阳离子交换层析树脂上，在能使神经营养蛋白与化学变体分离的条件下将神经营养蛋白从树脂上洗脱下来。
19．根据权利要求18所述的方法，其中阳离子交换树脂是SP-Sepharose HP树脂、聚天冬氨酸树脂、聚磺乙基阳离子交换树脂或Fractogel EMD SO3树脂。
20．根据权利要求18所述的方法，其中对来自阳离子交换树脂的含神经营养蛋白的洗脱液进行脱盐或进行透析，然后用载体配制。
21．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括用硅胶树脂从其它蛋白中分离出神经营养蛋白。
22．一种从蛋白混合物中分离神经营养蛋白的方法，该方法包括用硅胶树脂从其它蛋白中分离出神经营养蛋白。
23．一种从神经营养蛋白化学变体中分离神经营养蛋白的方法，该方法包括用高效阳离子交换层析来从其化学变体中分离出神经营养蛋白。
24．根据权利要求23所述的方法，其中在分离前神经营养蛋白及其变体几乎是纯的。
25．根据权利要求23所述的方法，其中树脂是SP-Sepharose HP树脂、聚天冬氨酸树脂、聚磺乙基阳离子交换树脂或Fractogel EMD SO3树脂。
26．根据权利要求23所述的方法，该方法还任选地包括用制备性反相液相层析树脂从该神经营养蛋白错折叠变体中分离出神经营养蛋白的步骤。
27．根据权利要求26所述的方法，其中树脂含有C4官能团。
28．一种神经营养蛋白组合物，它用权利要求1、22或23所述的方法制得。
29．一种组合物，它包含载体和几乎不含变体、几乎纯的、均一的神经营养蛋白。
30．根据权利要求29所述的组合物，该组合物是无菌的。
31．一种纯化神经营养蛋白的方法，该方法包括下列步骤(a)将含有神经营养蛋白和其变体的混合物加样到pH5-8的疏水作用层析树脂上；(b)用pH5-8的缓冲液洗涤树脂；(c)用含有浓度为5-25％体积/体积的醇或极性非质子溶剂、pH5-8的缓冲液洗脱神经营养蛋白；(d)将含有神经营养蛋白的洗脱液在pH5-6下加样到高效阳离子交换层析树脂上；和(e)用含有浓度为0.2M至0.5M阳离子、pH5-6的缓冲液将神经营养蛋白从阳离子交换层析树脂上洗脱下来。
全文摘要
本发明提供了大规模纯化适用于临床使用的神经营养蛋白(包括成熟NGF)的方法。该方法提供了从各种不需要的误加工、错折叠、糖基化或电荷形式中分离出神经营养蛋白的手段。另外本发明还提供了基本上不含这些变体的神经营养蛋白(包括成熟的NGF)组合物。
文档编号C07K14/48GK1237184SQ97199682
公开日1999年12月1日 申请日期1997年11月14日 优先权日1996年11月15日
发明者L·E·伯顿, C·H·施梅尔策, J·T·贝克 申请人:基因技术股份有限公司