专利名称：肝靶向性高糖密度半乳糖基干扰素偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一类通过分枝桥试剂，使干扰素(一种药用蛋白质)分子中每一个可偶联的位点(通常是游离的氨基)连接上2-5个半乳糖基，从而形成高糖密度的半乳糖基干扰素偶联物。在机体内，该偶联物显示出显著的肝靶向特征。
通过系统的文献检索和查新，尚未查见本发明化学结构类型的半乳糖基干扰素偶联物目前，查见相关的文献和专利报道如下[1]钟裕国等 肝靶向性的半乳糖基干扰素偶联物中国发明专利申请公开说明书 申请号9311196公开号CN1087093A
公开日1994年5月25日[2]滨口直等 糖基化细胞素中国发明专利申请公开说明书 申请号93117879.7开号CN1087916A
公开日1994年6月15日[3]管昌田等 半乳糖基干扰素的合成及其肝靶向性研究中华核医学杂志1996，11(2)234[4]钟裕国等 肝靶向半乳糖基干扰素的合成及其生物学性质研究中国药物化学杂志 1995，5(3)164-8[5]钟裕国等 肝靶向半乳糖基细胞色素C的合成及其肝靶向性研究华西医科大学学报1996，27(2)130-3[6]管昌田等 以NGA作为肝靶向药物载体的可行性研究中华核医学杂志1992，12(2)166-8文献[1]，[2]两个专利其半乳糖基干扰素偶联物的结构均为干扰素分子中可偶联位点连接上1个半乳糖基，与本发明在结构和功能上均有显著的差异；文献[3][4][5][6]是发明人为本发明进行的基础研究和方法学研究，未公开发表本发明专利的内容。
八十年代国外学者证实仅存在于哺乳动物肝细胞膜上的肝结合蛋白(HBP)是无唾液酸糖蛋白的受体(ASGPR)。将人白蛋白用半乳糖基修饰后所得的半乳糖基白蛋白(NGA)，为一人工合成的ASGPR的配体，呈典型的配体——受体识别，并具有配体——受体结合的全部生物学特征，国外将NGA用为肝靶向药物的载体。
干扰素是人体内原性细胞素，为一分子量为1.6万左右的活性蛋白，具有抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性，为当今公认的对乙型、丙型病毒性肝炎进行病因性治疗的首选药物。由于注射给药后随血循环自然分布，转运到肝脏的仅有注入剂量的5-7％，要对肝细胞内的肝炎病毒发生药效，要求大剂量(300万单位/天)长时间(三个月)的药物治疗，因而医疗费用高昂，副反应增多，其疗效不够理想(病毒阴转率仅有30％左右)。
本发明者在国内首次进行了肝靶向干扰素的研究用化学方法，将半乳糖基连接在人白细胞干扰素(INF-α)，基因工程干扰素(rINF α)蛋白分子上，使之具有ASGPR配体和保留INF活性的两重生物学特性。研究结果表明，所制备的半乳糖基干扰素偶联物(Gal-INF-α，Gal-rINF-α1)其肝脏分布率为注入剂量的20-25％，抗病毒活性较未进行半乳糖修饰的原料干扰素提高了2-3倍。这种糖密度为2-3的偶联物，尽管肝靶向性较之原料干扰素已提高了2-3倍，但仍不够理想，从发明人的基础研究中获知，如将糖密度提高到8-12，肝脏分布率可望达到30-50％。
鉴于干扰素分子中，半乳糖修饰的可结合点(游离氨基)有限，为了提高糖密度，发明者设计并合成了可连接多个半乳糖的分枝桥试剂(M1，M2，M3，M4)，并与干扰素(rINFα1，rINF-α2b)进行偶联，通过纯化分离和生物学特性研究实验，所制备的双半乳糖基干扰素(2Gal-rINFα2b，T1)蛋白电泳单带，糖密度＝10，肝脏分布率30-35％。
本发明的目的在于提供一类连接上2-5个半乳糖的分枝桥试剂与干扰素偶联形成高糖密度的半乳糖基化干扰素偶联物，该偶联物具有显著的肝靶向性。进一步开发成为病毒性肝炎的治疗药物，将会减少干扰素的用药剂量、增强疗效，降低不良反应，节省医疗费用，这对乙型、丙型肝炎的临床治疗，可望取得突破性效果。
本发明为一种在芳环分枝桥和脂链分枝桥的两端，分别以甙键、肽键、亚氨酯键偶连不同分子数的半乳糖和干扰素而制备的高糖密度半乳糖基干扰素偶联物，该偶联物的化学结构通式如下。
G＝M1，M2，M3，M4X＝O，NHn＝2-6INF＝rINFα2b，rINFα1G为半乳糖分枝桥试剂，其中M1为双糖芳环桥试剂，M2为双糖脂链桥试剂，M3为三糖脂链桥试剂，M4为芳环芳环桥试剂，其化学结构式如下
上述试剂M1，M2，M3，M4分别与r-INFα1、r-INFα2b偶联经纯化后，分别得高糖密度乳糖基干扰素偶联物T1T2T3T4，其化学结构如下
本发明目标物的制备方法如下芳环分枝桥类型选合成分枝糖试剂M1，偶联干扰素制备目标物T1为例。
双半乳糖芳环分枝桥试剂M1的合成用3，5-二羟基苯甲酸为起始原料与6-氨基己酸甲酯缩合，得3，5-二羟基苯甲酰甲氧羰基己胺，再用二溴乙烷烃化羟基后与硫代半乳糖试剂结合得M1。
双半乳糖芳环桥干扰素偶联物T1的制备将M1用甲醇——甲醇钠溶液水解后，蒸去甲醇，残留物溶于pH＝8的磷酸缓冲溶液中，加入rINFα2b和缩合剂EDC，待缩合反应完成后，将反应液透析至透析外液无糖检出，无菌过滤，冷冻干燥得T1。具体工艺条件及操作过程见实施例1。
脂链分枝桥类型选合成分枝糖试剂M2，偶连干扰素制备目标物T2为例。
双半乳糖脂链桥试剂M2的合成用丙二酸二乙酯为起始原料，经缩合、环化、脱羧还原、加成、开环、碘代等七步得二碘物，再与硫代半乳糖试剂缩合得M2。
双半乳糖脂链桥干扰素偶联物T2的制备将M2置于甲醇——甲醇钠溶液中醇解得亚氨基酯，用氮气挥去甲醇，残留物溶于磷酸缓冲液中，加入rINFα1待缩合反应完成后，将反应液透析至透析外液无糖检出，无菌过滤，冷冻干燥得T2。
本发明目标物的纯度、糖密度和肝靶向性测检(用目标物T1为例)纯度与糖密度检测采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法对双半乳糖基干扰素偶联物(2Gal-rINFα2b即T1)(图1标示A)和原料rINFα2b(图1标示B)和标准分子量蛋白(图1标示C)进行电泳。结果见电泳图(图1)，结果表明，T1和rINFα1的蛋白电泳均为单带(见A.B)两者电泳迁移率有显著差异，达到纯化要求。
糖密度的测算用标准分子量蛋白C作标准曲线，测得T1分子量为18700Da，rINFα2b为15200Da，而M1的分子量为694Da。则每分子T1约含5分子M1(18700-15200/694＝5.04)，而每个M1分子含有两个半乳糖，则T1的糖密度为10。
肝靶向性检测将T1和原料rINFα2b分别用放射性同位素131I(氯胺T法)进行核素标记得131I-T1和131I-rINFα2b分别注射入家兔静脉中，用Siermens Basicar r照相机作家兔全身放射显影，各自拍摄收集5-30分钟叠加照片(图2，图3)。图2为原料(131I-rINFα2b)照片，为自然分布的血池显象，其中肝、肾、膀胱的放射显像，清晰可见。附图3为131I-T1象，可明显的看到核素在肝区浓集，肾和膀胱显象微弱。两者对比，可直观的看到T1的肝靶向性。
小鼠体内分布实验将T1和rINFα2b分别用125I标记(氯胺T法)，所得的125I-T1和125I-rINFα2b分别注入各组小鼠尾静脉，定时处死小鼠，解剖并完整收集小鼠各脏器，测定各脏器官中的放射量，计算其占注入总放射量的百分率，结果见表1.表2。检测结果表明125I-T15分钟肝分布峰值为36.50±2.54，125I-rINFα2b为11.97±0.25，T1的肝摄取率为原料rINFα2b的3.1倍。
以上小鼠体内分布实验的结果充分表明了基因工程干扰素α2b采用该偶联方法接上半乳糖基后，所形成的双半乳糖基基因工程干扰素α2b偶联物(2Gal-IFNα2b)与原料基因工程干扰素α2b(IFNα2b)相比，具有明显的肝靶向。实施例1双半乳糖芳环桥干扰素(rINFα2b)偶联物(T1)的制备
双半乳糖芳环桥试剂M1的合成将6-氨基已酸甲酯在HOBT催化下，用DCC与3.5-二羟基苯甲酸(1)缩合，生成中间体(2)。在碱性条件下与1，2-二溴乙烷发生烃化反应，得中间体(3)。随后将二溴代物200mg(0.41mmol)溶于15ml丙酮和6ml蒸馏水中后，加入2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-异硫脲氢溴酸盐800mg(1.67mmol)，碳酸钾274mg(1.99mmol)，室温搅拌10分钟后，加入亚硫酸氢钠172mg(1.65mmol)，该反应混合物避光室搅拌24小时后，减压浓缩，加入30ml氯仿于残余物中，15ml水洗一次，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，所得残余物经硅胶柱层，石油醚-乙酸乙酯(1∶1)洗脱，洗脱液浓缩、结晶，得白色粉末状固体M1150mg，mp57-58℃，收率29％。IR3414，2940，1750，1647cm1；HNMR(200HMZ；CDCL3)6.91(2H，d，ArH)，6.54(1H，S，ArH)，5.43(2H，d，HC-S)5.05(2H，dd，2X-CHOAc)4.60(4H，dm，2X，-CHOAC)，4.19(6H，m，2XCH2OAc，2X-CHO)4.00(4H，dd，2XCH2OAr)，3.65(3H，S，CH3OCO-)，3.40(2H，m，NCH2)，3.16(2H，m，CH2S)2.95(2H，m，CH2S)，2.32(2H，t，CH2CO2)2.14(6H，s，2XCH3CO)，2.10(6H，s，2XCH3CO)，2.05(6H，s，CH3CO)，1.98(6H，s，CH3CO)，1.6l(4H，m，-CH2-，CH2-)，1.42(2H，m，CH2)ppm。
双半乳糖基芳桥干扰素(rINFα2b)偶联物(T1)的制备将分枝糖试剂M1200mg，0.16mmol溶于20ml无水甲醇中，随后加入0.1N的甲醇钠的甲醇溶液4.0mol(0.4mmol)，室温搅拌6小时后，减压浓缩，残余物中加入4.0ml水，继续室温搅拌10小时，加入pH＝8.0的磷酸缓冲液(4ml)，用1N的盐酸调pH＝8.0后，加入EDC 36mg(0.16mmol)，搅拌混匀后，加入4mg基因工程干扰素a2b于4℃搅拌24小时后，将反应液加入已预先处理的透析袋中，用0.1M的含0.73％氯化钠的磷酸缓冲液透析，每六小时更换一次透析外液，直至用苯酚——硫酸法检测透析外液无糖为止透析液无菌过滤，冷冻干燥得T1。
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(图1)，可分别测出偶联物T1(2Gal-IFNa2b)和所用原料干扰素(IFNa2b)的分子量，分别为18700Da和15200Da，而修饰基团为694Da，故由此算出偶联物T1中的分枝半乳糖为5，而每个分枝半乳糖试剂含两个半乳糖残基，所以偶联物T1(2Gal-IFNα2b)糖密度应为10。
用上述方法制备，纯化并确认了结构及糖密度为10的偶联物T1(2Gal-IFNα2b)作为试验用样品进行其在动物体内的肝靶向性研究。
将该偶联物T1(2Gal-IFNα2b)用氯胺T法进行125I标记，并用Sephadex G50层析注，以PBS洗脱进行纯化处理，三氯醋酸沉淀法测定其放化纯度达99％以上，并用同样的125I标记的原料干扰素(125I-IFNα2b)为对照物，分别从体重为15-20g的小鼠尾静脉注入，作小鼠体内分布实验。试验组每只小鼠注入标记过的偶联物T12ug，对照组每只小鼠注入标记过的对照物2ug后，分别于5’、10’、15’、30’、60’、120’等不同时相断头处死。解剖取出各脏器，测定各脏器的放射性，结果以各脏器中的放射性蓄积量占注入量的百分比表示(见表1、表2)。
由表1可看见，125I-2Gal-IFNα2b主要分布于肝、肾、肠道以及血液中，肝脏摄取量在5分钟达到高峰，占总放射性的36.5％。肠道放射性从5’至30’逐渐上升，并且在30’时达到高峰，随后放射性开始下降。由此可推测肠道的放射性主要来自于肝脏。肾脏的放射性在5分钟内达到最大摄取10.2％，随后逐渐减少，说明125I-2Gal-IFNα2b可从肾脏排泄。另外，在对照组125I-IFNα2b中(见表2)，肾脏放射性分布较高，5分钟达到峰值10.49％与125I-2Gal-IFNα2b主的峰值相当，表明其同样也可从肾脏排泄，但肝脏摄取量在5分钟同样也达峰值时，仅为11.97％。随后逐渐下降。125I-2Gal-IFNα2b与125I-IFNα2b的肝摄取峰值之比为3.05∶1，并且两者在120分钟后，125I-2Gal-IFNα2b的肝的摄取率仍高于125I-IFNα2b。表1125I-2Gal-Interferonα2b的小鼠体内分布实验结果时间(mins)5 10 15 3060 120血 12.00±0.93 9.17±2.74 8.93±0.12 8.95±1.126.56±0.45 6.56±1.94心脏0.50±0.130.48±0.16 0.46±0.13 0.32±0.030.26±0.02 0.33±0.12肝脏36.50±2.54 31.2±2.37 23.87±1.93 9.99±1.876.53±0.18 4.37±0.36脾 0.75±0.270.87±0.16 0.53±0.13 1.13±0.020.63±0.07 0.37±0.01肺 1.48±0.281.37±0.39 1.33±0.21 1.48±0.461.11±0.17 0.87±0.29肾 10.20±1.18 8.42±0.48 6.63±0.32 5.15±0.623.78±0.12 2.79±0.32肠 4.06±2.114.51±1.18 4.02±0.09 6.17±0.514.67±1.23 1.49±1.79表2125I-2Gal-Interferonα2b的小鼠体内分布实验结果时间(mins)5 10153060 120血 15.94±0.37 11.96±0.75 10.06±0.49 8.05±0.526.53±1.09 3.82±0.59心脏 0.85±0.080.51±0.010.50±0.070.34±0.030.28±0.03 0.20±0.01肝脏 11.97±0.26 10.97±1.87 7.03±1.375.75±1.673.53±0.50 2.42±0.12脾 1.12±0.250.93±0.120.81±0.290.56±0.310.43±0.12 0.37±0.03肺 3.62±1.182.00±0.092.21±0.241.72±0.561.71±0.28 0.85±0.18肾 10.49±1.28 7.42±1.446.16±0.693.65±0.762.01±0.03 1.39±0.14肠 7.99±4.208.28±0.619.49±3.736.57±0.776.59±0.77 4.36±0.97实施例2双半乳糖基胺链桥干扰素(rIFNα1)偶联物(T2)的制备
双半乳糖基胺链桥试剂M2的合成用丙二酸二乙酯为起始原料，经甲醛缩合，丙酮环化后加热脱羧得(7)，用锂铝氢还原后与丙烯结合得(9)，经脱保护开环后磺酰化得双磺酸二醇酯(11)，用碘化钠处理(11)得二碘化物(12)，将二碘化物(12)379mg(1mmol)溶于20ml丙酮和12ml蒸馏水中后，加入2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-O-吡喃半乳糖基)-2-异硫脉氢溴酸盐920mg(4mmol)随后加入碳酸钾579mg(4.2mmol)，室温避光搅拌20小时后，减压浓缩反应液，加40ml氯仿于残余物中，20ml水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(2∶1)洗脱，得无色油状物M2450mg，收率53％。IR2936，2334，1752cm-1；HNMR(200MHzinCDCl3)5.42(2H，d，2XCHS)，5.15(2H，t，2XCHOAC)，5.03(2H，dd，2XCHOAC)，4.50(2H，d，2XCHOAC)，4.13(4H，m，2XCH2OAC)，3.96(2H，m，2XCH..0)，3.59(4H，m，2XOCH2)，2.85(4H，m2XSCH2)，2.61(2H，t，CH2CN)，2.15(6H，s，2XCH3CO)，2.07(6H，s，2XCH3CO)，2.06(6H，S，2XCH3CO)，2.04(6H，s，2XCH3CO)，1.97(6H，s，2XCH3CO)，1.92(1H，m，CH)ppm双半乳糖基脂链桥干扰素(rINFα1)偶联物(T2)的制备将9.2mg(0.1mmol)M2溶于40ml无水甲醇中，室温搅拌下，加入8mg甲醇钠，室温搅拌48小时后，用氩氮流挥干甲醇，将20ml磷酸缓冲液(pH8)加入残留物中，溶解后用1NHCl调至pH8，于4℃下，加入干扰素(rINFα1)4mg，4℃搅拌24小时，反应液透析除去游离糖及无机盐，无菌过滤，冰冻干燥得T2。实施例3三半乳糖基脂链桥干扰素(rINFα2b)偶联物(T3)的制备
三半乳糖基脂链桥试剂(M3)的合成用树枝状季戊四醇为起始原料，与丙烯腈加成后得四腈物(14)，随后醇解得四酯(15)，用硼烷部分还原得醇酯(16)，磺酸酯化得(17)，将(17)与2-s-(2，3，4，6-四-O乙酰-β-O-吡喃半乳糖基)-2-异硫脲氢溴酸盐缩合，产物经硅胶柱层析纯化得(M3)其结构鉴定光谱数据如下IR2932，1752，1748cm-1；HNMR(200MHzn CDCl3)，5.43(3H，d，3XCHS)，5.17(3H，t，3XCHOAC)，5.04(3H，dd，3XCHOAC)，4.32(3H，d，3XCHOAC)，4.05(6H，m，3XCH2OAC)，3.92(3H，m，3XCHO)，3.68(3H，s，CH3OCO)，3.67(2H，t，OCH2)3.32..3.4Z(14H，m，7XOCH2)，2.76(6H，m，3XSCH2)，2.55(2H，t，CH2)，2.16(9H，s，3XCH3CO)，2.11(9H，s，3XCH3CO)，2.09(9H，s，3XCH3CO)，2.00(9H，s，3XCH3CO)ppm，三半乳糖基干扰素(rINFα2b)偶联物(T3)的制备将M3200mg溶于20ml无水甲醇中，加入0.1N的甲醇钠甲醇溶液4.0ml(0.2mmol)室温搅拌8小时，减压浓缩，残余物中加入4.0ml水继续室温搅拌10小时，加入pH＝8.0的磷酸缓冲液10.0ml，用1N的盐酸精细调至pH8后，加入EDC 40mg搅拌均匀后加入4mg基因工程干扰素(rINFα2b)，于4℃搅拌反应24小时，将反应液加入已预先处理的透析袋中，用0.1M的含0.73％氯化钠的磷酸缓冲液透析，每六小时更换一次透析外液，直至用苯酚一硫酸法检测透析外液无糖反应为止。反应液经无菌过滤后，冷冻干燥得(T3)。
图1是本发明双半乳糖—干扰素α2b(A)、干扰素α2b(B)和标准分子量蛋白(C)的电泳图。图2是本发明131碘-干扰素α2b家兔全身放射显像图(5-30分)。图3是本发明131碘T1(双半乳糖基干扰素α2b)家兔全身放射显像图(5-30分)。
权利要求
1.一种肝靶向性高糖密度半乳糖基干扰素偶联物，其特征在于芳环分枝桥和脂链分枝桥的两端，分别以甙键、肽键、亚氨酯键偶连2-5个半乳糖和干扰素而生成高糖密度分枝桥干扰素偶联物，其化学结构通式如后。
2.据权利要求1所述的偶联物，其特征在于偶联的半乳糖在偶联物分子中所占的分子比即糖密度应为4-20∶1。
3.据权利要求1所述的偶联物，其特征在于偶联物在哺乳动物的肝脏摄取率应大于给药剂量的30％。
G＝双半乳糖芳环桥试剂(M1)双半乳糖脂链桥试剂(M2)X＝O，NH 三半乳糖芳环桥试剂(M3)n＝2-6 三半乳糖脂链桥试剂(M4)INF＝人白细胞干扰素(INFα)基因工程干扰素α1(rINFα1)基因工程干扰素α2b(rINFα2b)
全文摘要
本发明提供的是一种高糖密度半乳糖基干扰素偶联物,它是通过分枝桥试剂,使干扰素(INF)分子中的每一个可偶联位点连接上2—5个半乳糖基而形成的偶联物。该偶联物与原药干扰素相比较具有显著的肝靶向性和药理活性,可望开发成为病毒性肝炎的病因性治疗药物,其化学结构通式如上式。
文档编号C07K14/435GK1268517SQ9911748
公开日2000年10月4日 申请日期1999年12月28日 优先权日1999年12月28日
发明者钟裕国, 吴勇, 管昌田, 石和平 申请人:华西医科大学