专利名称：针对尿激酶型纤溶酶原激活剂基因的反义核酸的抑癌作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制人体肿瘤细胞生长和转移的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤生长、浸润和转移的针对尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述的寡核苷酸的组合物，以及将所述的寡聚核苷酸用于制备抑制肿瘤生长、浸润和转移的药物。
本发明所阐述的寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体u-PA基因的一段序列互补，这些寡核苷酸在细胞内特异地与人体u-PA基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交，从而阻止u-PA基因编码的u-PA蛋白表达，达到抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移的作用。
u-PA是一种似纤溶酶的丝氨酸蛋白水解酶，分子量约为50-60KD，为一糖蛋白。含有两个二硫键，C端为丝氨酸蛋白激酶结构域，N端含有一三环域和生长因子结构域。u-PA是在1976年首先由Astedt等发现的(Gandolfo GM et al.Anticancer Res.1996；162155-2160)。
u-PA是由血管内皮细胞表达分泌，由单链无活性尿激酶原(pro-u-PA)经纤溶酶、组织蛋白酶B、L及凝血因子XIIα、前列腺特异性抗原等催化断裂肽键K158-I159而转变成有活性的双链u-PA。(Hoyer-Hansen G，et al，EurJ.Biochem.1997，24321-26)。血浆中u-PA的浓度大约为20pm，大部分为与其抑制剂(PAI-1)所形成的复合物，小部分为pro-u-PA形式。u-PA系统成分的表达在很大程度上受激素、生长因子和胞质分裂素等的调控(Dear DE，et al.Fibrinolysis，1995；9321-330)。
我们所选择的反义核酸是通过与u-PA的mRNA互补杂交，通过多种机制来抑制mRNA表达u-PA蛋白。由于反义核酸可特异性的结合目标mRNA，可以设计出一种反义核酸，要求其与肿瘤发生有关的u-PA的mRNA互补，高度的特异性选择亦可使之不产生目前其他药物所产生的毒副作用。
本发明在细胞培养中筛选出对u-PA特异的反义核酸，结合于u-PA基因的mRNA上，显示出对u-PA的mRNA表达蛋白质的抑制。
近来研究表明，u-PA在多种肿瘤细胞的转移，侵入组织及毛细血管生成等方面有十分重要的作用。肿瘤细胞的转移主要依赖于其对正常组织的侵入能力。1995年底，在美国休斯敦召开的“癌症发展和转移的关键因素”座谈会上，500余名致力于探索癌症转移的专家一致认为癌细胞转移的关键是突破基底膜的“封锁”。这其中主要依靠的是肿瘤细胞产生的许多酶，这些酶可水解基底膜和细胞外基质，使细胞—细胞—细胞—基底膜接触变的松散，从而增强了肿瘤细胞侵入和转移的能力。在此过程中，u-PA起到十分重要的作用。(Rabbani SA，In vivo 98，12(1)135-142)另外，u-PA可以诱导一些细胞因子生成，如TGF-α，VEGF，bFGF等，诱发毛细血管生成，在肿瘤细胞转移后血管生成方面有重要作用(Hinsbergh VM，EXS.97，79391-411)。
u-PA过量表达是许多恶性肿瘤的前兆，如胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等(Schmitt M.J.Obstet Gynaecol.1995，21(2)151-165)。
在恶性肿瘤中，u-PA的水平显著高于正常组织或同一来源的良性肿瘤的水平。而且u-PA、u-PA-R，PAI-1，PAI-2的水平在恶性肿瘤中有相当大的变化并与患者预后有关。在乳腺癌中，u-PA活性高表达者其无瘤生存明显短于u-PA活性低表达者，在所有乳腺癌预后因素中，u-PA抗原水平是最显著的。u-PA及其特异受体(u-PA-R)和抑制物(PAI-1)与肝细胞癌(HCC)浸润、转移及预后也有很大相关性。郑起等(《中华肿瘤杂志》1998，1)发现u-PA、u-PA-R和PAI-1在HCC中表达明显升高，u-PA和u-PA-R与HCC浸润密切相关，u-PA和PAI-1阳性HCC患者预后较差。
u-PA，u-PAR密度与前列腺癌进程有关，在良性增生的前列腺中密度低，而恶性前列腺组织中密度很高，有转移的前列腺癌较未转移的密度高得多(Miyake H，Int J.Oncol.1999 14(3)535-541)。
本发明的目的之一是能够提供一种反义寡聚脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其特征在于可特异性结合u-PA基因的mRNA的不同区域。
本发明的另一目的是提供含有本发明反义寡聚核苷酸的药物组合物。
本发明的另一目的是提供了本发明反义寡聚核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。应用Northern Blotting的方法分别检测了四种细胞系A549、MCF、C33A和U2-OS中u-PA mRNA的含量。其中A549为人肺癌细胞系，MCF为人的乳腺纤维囊病细胞系，C33A为人宫颈癌细胞系，U2-OS为人的骨肉瘤细胞系。A549和C33A均有较高u-PA mRNA含量，而MCF和U2-OS中u-PA mRNA含量很少。这说明肺癌和宫颈癌更适合于本发明中的药物。类似的，其它u-PA mRNA含量较高的肿瘤也适用于本发明中的药物。
本发明还设计了一系列可以结合于u-PA基因的u-PA的mRNA的不同区域的反义核酸分子，在细胞培养中筛选对u-PA基因表达特异性抑制的反义核酸。细胞培养采用A549细胞，设立一个阴性对照PAC23，一个阳性对照PAC40，所有进行筛选的反义核酸分子长度均为20个核苷酸。筛选结果表明其中九个反义核酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为PAC130、PAC131、PAC132、PAC133、PAC134、PAC135、PAC136、PAC137、PAC138，其中PAC136能最大地抑制人体肿瘤细胞生长的活性。
具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的PAC系列反义寡聚核苷酸碱基组成及顺序如下所示PAC1305’-CTC GGT GGC CTG CGG CAG GA-3’20merPAC1315’-AGC AGG GCT CTC ATG GTG GC-3’20merPAC1325’-GCA CTC TTG GAC AAG CGG CT-3’20merPAC1335’-AGG CAG ATG GTC TGT ATA GT-3’20merPAC1345’-GTG ACT TCA GAG CCG TAG TA-3’20merPAC1355’-CCA TCT GTG CAG AGC CTA TC-3’20merPAC1365’-ACA AGT TGC TGG TCA GTA AC-3’20merPAC1375’-CAG CTC TTA CTC ACA CTT AC-3’20merPAC1385’-CTG AGA CAG TGC TGG TCA CA-3’20mer设立阳性对照一个，PAC40，其序列如下所示PAC405’-GAA AAC GTC AGC CAT GGT CC-3’20mer设立阴性对照一个PAC23，其序列如下所示PAC235’-CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA-3’20mer
以上所设计的反义寡聚核苷酸均是长度为20个核苷酸并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标为人体u-PA基因的信使核糖核酸(mRNA)。这段反义核苷酸可以在细胞质中与u-PA基因的信使核糖核酸(mRNA)特异性结合，从而阻断u-PA基因编码的u-PA蛋白的表达，这样可以最终达到抑制肿瘤生长和转移的作用。本发明所设计的反义核苷酸序列是通过与u-PA基因的mRNA的特异性杂交来发挥其特有的生物学特性。从目前来看，核酸杂交中RNA与mRNA的杂交亲和力比DNA与mRNA的杂交亲和力要高，在医学药用价值上具有很高的地位。但是由于人工合成DNA又远远比合成RNA的成本要低的许多，根据医药市场的需要以及临床应用的成本要求，目前在临床试验应用的反义药物均为DNA。合成RNA的成本居高不下，随着科技的不断进步和技术的改进，合成RNA的成本将会在未来有所降低，有望在临床上应用。合成的寡聚核糖核酸(RNA)和核糖核酸RNA单体与脱氧核糖核酸(DNA)单体嵌合相连而成的反义核酸将作为新药进行开发。
本发明设计的反义核酸药物，其序列具有特异性生物学活性。对于某一基因位点互补的反义核酸与互补长度有很大关系，如互补的长一些，则生物学活性就高一些，治病的效果就会好一些，但人工合成的反义核酸的成本就会增加，这样就不符合反义核酸作为药用的目的。此发明均采用经过筛选的20个碱基长度的反义核酸序列，增加或减少一个至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸，同样也会具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的治病作用。同时互补于相同基因位点附近的反义核酸结合部位有不同程度的重叠，这些可以认为具有不同程度的序列同源性，也同样具有不同程度的相同生物学活性。
现在反义核酸研究中各种化学修饰方法很多，之所以采用硫代修饰的反义核酸，主要是硫代的反义核酸的药理学、药代动力学、毒理学等临床前研究是各种化学修饰的反义核酸中研究最为全面的。硫代反义核酸在体内可以有效的防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切降解作用，使反义核酸保持其应有的生物学活性。此外硫代的反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与之杂交的RNA链，因此选用硫代修饰的特定设计的反义核酸都具有不同程度的生物学活性。
综上所述，互补于u-PA基因mRNA不同区域的反义核酸具有抑制人体肿瘤细胞生长和转移的特性，在临床上治疗肿瘤具有很广泛的应用价值。经过化学修饰筛选出不同长度和不同程度同源性的反义核酸序列，可发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。可以将本发明的反义核酸与药用载体结合，用于动物(包括哺乳动物和人)。所用的药用载体可为磷酸盐缓冲液(pH7.4)以及其他常用的载体和缓冲液。图例说明
图1u-PA mRNA在不同细胞系中的含量(Northern Blotting结果)。
应用Northern Blotting的方法分别检测了四种细胞系A549、MCF、C33A和U2-OS中u-PA mRNA的含量。A549为人肺癌细胞系，MCF为人的乳腺纤维囊病细胞系，C33A为人宫颈癌细胞系，U2-OS为人的骨肉瘤细胞系。分别在适当的条件下进行培养，然后用RNAzol B提取细胞总的RNA，以每孔5ug的含量进行电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用DIG标记的u-PA探针进行核酸杂交(Northern blot)分析(如图1)。
由图可见，A549和C33A均有较高u-PA mRNA含量，而MCF和U2-OS中u-PA mRNA含量很少。图2反义核酸Pac系列对u-PA mRNA含量的影响(Northem Blotting结果)将A549细胞株分为对照组(阴性和阳性)和反义核酸处理组，在含10％的胎牛血清HAM’s S/F-12培养液中培养，培养至细胞总数为10万时，将细胞培养液换成无血清培养液，加入20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的不同序列的硫代反义核酸处理5小时，再换成普通培养基，恢复20个小时，然后用RNAzol B提取细胞总的RNA进行u-PA mRNA定量分析。用u-PA基因的探针及G3PDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的探针与经电泳分离并转移到硝酸纤维膜上的细胞总RNA样品进行核酸杂交(Northern blot)分析，以G3PDH基因的mRNA作为内部参照，结果如图2所示。
图中23号样品为阴性对照，40号为针对PKC-α基因的反义核酸，作为阳性对照，其他为不同的Pac系列的反义核酸样品。图中可见Pac系列反义核酸对u-PA mRNA的不同的抑制活性，以Pac136的抑制程度最高。
实施例1反义核酸攻击靶位目标的确定及反义核酸的合成使用美国PE公司应用生物系统部(Applied Biosystems)制造的391-04型DNA-RNA合成仪。以亚磷酸酰胺固相合成硫代的反义核酸。
合成原料购自美国Glen公司，主要原料有四种二异丙基—氰乙基亚磷酸酰胺单体脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)。
四种控制孔径玻璃粉(CPG)。固相合成柱(A、C、G、T)，规模为10微摩尔。
盖帽试剂盖帽试剂A乙酸酐、二甲基吡啶、四氢呋喃盖帽试剂B一甲基咪唑、四氢呋喃硫代反应试剂Beaucage试剂、乙腈脱三苯甲基试剂三氯乙酸、二氯甲烷液体试剂乙腈、三氯甲烷合成规模为10微摩尔，碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100毫摩尔，其它试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。
合成过程仪器本身可以用程序控制。
合成产物用浓氨水(28％)切割下来收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃处理15小时脱去反义核酸分子上的各种羟基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后，挥发除去大部分氨气，冻干得白色粉末状粗品，重新溶于缓冲液中，用Pharmacia Source 30Q层析柱及AKTA层析系统进行纯化，纯化样品用G-15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，冻干得白色絮状反义核酸纯品，储存于-30℃。取少量样品进行如下分析1、用毛细管电泳法测其纯度及分子量；2、用高效液相层析法测其纯度；3、DNA测序法测定其序列准确度；
4、P31NMR(核磁共振)法测定其硫代程度；毛细管电泳法及高效液相法纯度分析结果显示Pac系列反义核酸纯品纯度均大于90％。
序列测定证明Pac系列反义核酸序列与设计序列相同。
P31NMR分析显示Pac系列反义核酸硫代率大于98.5％。
实施例2针对u-PA的Pac系列反义核酸在培养细胞中对u-PA表达的抑制(Northern Blot)选用人体肺癌细胞株A549作为筛选实验用细胞株，参照Miwa.W等的文献(Miwa.W.et，al.1994 Biological Chemistry Lipopeseyler，375(10)705-709)，将试验分组为阴性对照组、阳性对照组、反义核酸处理组。
将A549细胞株在含10％的胎牛血清HAM’s S/F-12培养液中培养，培养至细胞总数为10万时，将细胞培养液换成无血清培养液，加入20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的不同序列的硫代反义核酸处理5小时，再换成普通培养基，恢复20个小时，然后用RNAzol B提取细胞总的RNA进行u-PA基因mRNA定量分析。用u-PA基因的探针及G3PDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的探针与经电泳分离并转移到硝酸纤维膜上的细胞总RNA样品进行核酸杂交(Northern blot)分析，以G3PDH基因的mRNA作为内部参照。Northern杂交分析参照Sambrook.J等编写的Molecular CloningA Loboratory Manual.2nd.ed Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.。结果如图2所示。
图中23号样品为阴性对照，40号为针对PKC-α基因的反义核酸，作为阳性对照，其他为不同的Pac系列的反义核酸样品。图中可见Pac系列反义核酸对u-PA mRNA的不同的抑制活性，以Pac136的抑制程度最高。
实施例3Pac136的化学组成结构参照Nucleic Acids Research.1995，Vol24，No2.P4219-4223的方法对Pac136进行序列测定，结果如下PAC1365’-ACA AGT TGC TGG TCA GTA AC-3’20mer与设计序列一致，以毛细管电泳法测定Pac136的分子量，结果为6424，与理论分子量6426近似相等。
Pac136是20个脱氧核苷以磷酸硫酯键相连的反义核酸，其攻击的靶向目标是u-PA基因的mRNA。
实施例4Northern Blotting杂交方法测定u-PA mRNA在不同细胞系中的含量应用Northern Blotting的方法分别检测了四种细胞系A549、MCF、C33A和U2-OS中u-PA mRNA的含量。A549为人肺癌细胞系，MCF为人的乳腺纤维囊病细胞系，C33A为人宫颈癌细胞系，U2-OS为人的骨肉瘤细胞系。分别在适当的条件下进行培养，然后用RNAzol B提取细胞总的RNA，以每孔5ug的含量进行电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用DIG标记的u-PA探针进行核酸杂交(Northern blot)分析(如图1)。
由图可见，A549和C33A均有较高u-PA mRNA含量，而MCF和U2-OS中u-PA mRNA含量很少。
实施例5含反义核酸的药物组合物作为动物体内给药的反义核酸药物组合物组成如下反义核酸Pac136 10mg/ml一水合磷酸一氢钠1.73mg/ml七水合磷酸氢二钠14.33mg/ml氯化钠 4.4mg/ml注射用水 适量本发明中其它几种反义寡聚核苷酸也采用同样配方。
勿用赘言，本发明的反义核酸很大程度上能通过不同的化学修饰、采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。它可单独使用或与其它药物联合使用进行肿瘤的治疗，这些对在本领域的普通技术人员看来是显而易见的。序列表(1)、一般情况(iii)序列总数9(1).第1号序列情况(i).序列特征
(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第1号序列 PAC130CTC GGT GGC CTG CGG CAG GA 20(2).第2号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第2号序列 PAC131AGC AGG GCT CTC ATG GTG GC 20(3).第3号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第3号序列 PAC132GCA CTC TTG GAC AAG CGG CT 20(4).第4号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第4号序列 PAC133AGG CAG ATG GTC TGT ATA GT 20(5).第5号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第5号序列 PAC134GTG ACT TCA GAG CCGTAG TA 20(6).第6号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第6号序列 PAC135CCA TCT GTGCAG AGC CTA TC 20(7).第7号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第7号序列 PAC136ACA AGT TGC TGG TCA GTA AC 20(8).第8号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第8号序列 PAC137
CAG CTC TTA CTC ACA CTT AC 20(9).第9号序列情况(i).序列特征(A).长度20个碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第9号序列 PAC138CTG AGA CAG TGC TGG TCA CA 20
权利要求
1.一种寡聚反义脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其特征在于可特异性结合人体尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)基因的不同区域，所述寡聚核苷酸序列选自1.PAC1305’-CTC GGT GGC CTG CGG CAG GA-3’2.PAC1315’-AGC AGG GCT CTC ATG GTG GC-3’3.PAC1325’-GCA CTC TTG GAC AAG CGG CT-3’4.PAC1335’-AGG CAG ATG GTC TGT AIA GT-3’5.PAC1345’-GTG ACT TCA GAG CCG TAG TA-3’6.PAC1355’-CCA TCT GTG CAG AGC CTA TC-3’7.PAC1365’-ACA AGT TGC TGG TCA GTA AC-3’8.PAC1375’-CAG CTC TTA CTC ACA CTT AC-3’9.PAC1385’-CTG AGA CAG TGC TGG TCA CA-3’及其同源序列。
2.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1-9有至少70％的同源性。
3.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1-9有至少80％的同源性。
4.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1-9有至少90％的同源性。
5.含有权利要求1中的反义核酸序列及可药用载体的药物。
6.权利要求1中的反义核酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明涉及用化学方法合成系列序列特异的反义核酸,其碱基排列顺序与人体内尿激酶型纤溶酶原激活剂(u－PA)mRNA的一段序列互补。这些寡核苷酸可以在细胞内特异地与人体尿激酶型纤溶酶原激活剂的信使核糖核酸(mRNA)杂交,从而阻止u－PA基因编码的u－PA蛋白的表达,达到抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移的作用,这些反义寡聚核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长、浸润和转移的药物。
文档编号C07H21/04GK1288012SQ9911938
公开日2001年3月21日 申请日期1999年9月14日 优先权日1999年9月14日
发明者胡前进 申请人:北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司