专利名称：微生物生物转化法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物生物转化法对特定药物中间体化合物O-去甲基化。更具体地，其涉及利用特定微生物以对特定药物中间体化合物O-去甲基化。
分析化学学报(Analytica Chimica Acta)(1990)233，199-98中的一篇文章涉及利用雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)对特定正丙基去甲阿朴啡化合物去甲基化。
生物医药与环境质谱(Biomedical and Enviromental MassSpectrometry)(1986)13，223-229涉及利用雅致小克银汉霉制备N-正丙基去甲阿朴吗啡的潜在代谢物。
在酶及微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)(1984)6，242-253中公开的一篇综述性文章的第250-252页，广泛综述了特定微生物的用途，例如利用真菌，诸如小克银汉霉属(Cunninghamella)、曲霉属(Aspergillus)、Thamnostylum、青霉属(Penicillium)和瘤孢属(Sepedonium)的种类以对特定化合物O-去烷基化。
在H.G.Davies等人的《制备有机化学中的生物转化法》第5.5章黄瘤孢(Sepedonium chrysospermum)和雅致小克银汉霉对包括文朵灵和10，11-二甲氧基阿朴啡的特定化合物去甲基化。
在植物化学(Phytochemistry)(1997)44(8)，1479-1482中的一篇文章涉及了黑曲霉(Aspergillus niger)由(±)-桉素的O-去甲基化制备(-)-松脂酚。
1997年4月18日授权的美国专利5,618,707涉及利用Zygosaccharomyces bailii ATCC 38924以将戊酸化合物立体选择性还原为苯基噁唑烷酮产物。
美国专利5,580,764涉及利用来自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、甲虫毕赤酵母(Pichia haplophila)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、Lactobacillus buchmans、黄曲霉(Aspergillus flavus)和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的氧化/还原酶以还原在碳酸酐酶抑制剂合成中的中间体。
图1-4显示利用3种真菌培养物进行微生物法生物转化产生的高压液相层析曲线。
在一个实施方案中，本发明涉及一种由式(II)的化合物制备
式(I)化合物的工艺，包括在一种来自单孢霉属(Monosporium)的
微生物培养物的酶存在下，选择性地将式(II)的化合物去甲基。
优选的工艺中所述微生物是Monosporium olivaceum。
同样优选的工艺中所述Monosporium olivaceum是Monosporiumolivaceum ATCC 36300。
在另一实施方案中，本发明涉及一种由式(II)化合物
制备式(III)化合物的工艺，包括在一种来自Thamnostylum属的微生
物培养物的酶存在下，选择性地将式(II)的化合物去甲基。
优选的工艺中所述微生物是Thamnostylum piriforme。
同样优选的工艺中所述Thamnostylum piriforme是Thamnostylumpiriforme ATCC 8992。
在另一实施方案中，本发明涉及利用式(II)化合物
以制备式(I)的化合物的用途。
优选的用途中式(II)化合物被非选择性去甲基化。
本发明包括利用微生物实现CP-336,156(雌激素激动剂/骨质疏松症)合成中的中间体的O-去甲基化。利用微生物避免了产生甲基溴的化学步骤，甲基溴作为副产物是一种难以收集且处理昂贵的“温室效应”气体。
生物转化可以利用微生物的完整细胞结构、微生物细胞提取物或获自微生物的纯化的酶来进行。
用于本微生物生物转化的起始材料是CP-324,098，其是顺式非对映体的混合物。已发现进行这种反应的三种真菌具有不同的立体选择性。刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)O-去甲基化非对映体的全部两种，以形成称为CP-319,609的外消旋混合物，其是由非对映体CP-336,156和CP-335,992组成。Monosporium olivaceum和Thamnostylum piriforme仅作用于CP-324,098的非对映体中的一种，产生如下所示的一种非对映体产物。
(仅有顺式非对映体)刺孢小克银汉霉无非对映体选择性Thamnostylum piriforme非对映体选择性-“不是期望”的产物(CP-335,992)Monosporium olivaceum 非对映体选择性-期望的产物(CP-336,156)由这三种微生物制备的起始材料和产物如图1-4如示通过手性HPLC测定。所有三种微生物的反应终产物从发酵液中分离，且用NMRMS表征，用手性HPLC以确证其一致性。
用通用术语描述本发明后，下面参考特定实施例。应当理解这些实施例不是意在限制本发明及由所附权利要求确定的范围。
可以从美国典型培养物保藏中心获得Monosporium olivaceumATCC 36300和Thammostylum piriforme ATCC 8992。将如此获得的培养物加入合适的生长培养基，并持续振摇培养直到开始生长。如此制备的培养物用于接种斜面。将部分这样的斜面冷藏作为原种贮存。分别将各个微生物从斜面中接种入含有生长培养基(组分见后)的两只摇瓶中。在温度范围从约22到约32℃范围进行发酵；然而，为了优化结果，优选在约28℃进行发酵。利用合适的有机或无机缓冲液掺入到发酵培养基中，或通过周期性加入碱以控制培养基的pH在约pH6-7。在48至72小时内实现微生物良好生长。将摇瓶中的培养液移入冯巴赫瓶中，其中含有与先前所用生长培养基相同组成的新鲜生长培养基。不同的培养基将改变化合物的产率和其生产速率。优选的培养基组成列于实施例部分。再振摇一天后，加入溶于适当溶剂(如二甲亚砜或二甲基酰胺(dimethyl formamdide)的无菌过滤的雷怕霉素溶液。继续发酵1-6天。优选为继续发酵2天。
用于本发明工艺的合适的培养基含有可利用的碳源或多种碳源、可利用的氮源和无机盐，包括必需的矿物质。通常，许多糖类如葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、甘油、小米凝胶(millet jelly)、糖蜜、黄豆等可用作可利用的碳源。可利用的氮源包括如酵母、酪蛋白水解物、初级酵母、酵母提取物、棉籽粉、大豆固形物、小麦胚芽提取物、蛋白胨、玉米浆和铵盐。可掺入培养基的无机盐养分是常用的钠盐、铁盐、镁盐、钾盐、钴盐、磷酸盐等。当然，所用的技术不意在限制本发明的范围。
适合的生长培养基包括(a)葡萄糖(20g)，酵母提取物(5g)，NaCl(5g)，K2HPO4(5g)和蒸馏水(1000毫升)，其中pH用HCl溶液调整到7；(b)糊精(10g)，牛肉提取物(3g)，ardamine pH(5g)，N-Z胺型E，MgSO47H2O(0.5g)，KH2PO4(0.37g)，CaCO3(0.5g)，蒸馏水(1000毫升)，其中用盐酸溶液pH7.1，随后第二阶段的培养基为葡萄糖(10g)，Hy-CaseSF(2g)，牛肉提取物(1g)，玉米浆(3g)，蒸馏水(1000毫升)，其中pH调整为7.0；(c)葡萄糖(10g)、玉米浆(6g)、KH2PO4(3g)、CaCO3(3.5g)、大豆油(粗，2.2毫升)、酵母提取物(2.5g)、蒸馏水(1000毫升)，其中用HCl溶液调至pH7.0-7.3；(d)麦芽糖浆(20g)、大豆粉(5g)、酪蛋白(1g)、干酵母(1g)、NaCl(5g)、蒸馏水(1000毫升)；(e)乳糖(75g)、Pharmamedia(取代酵母提取物，40g)，CaCO3(10g)、Na2SO3(4g)，蒸馏水(1000毫升)；(f)ISP#3；(h)ISP#4；(I)ISP#5等。程序培养物刺孢小克银汉霉ATCC 9244和ATCC 36190；Monosporium olivaceum ATCC 36300和Thamnostylum piriformeATCC 8992。生物转化法生长培养基(接种和生物转化期)葡萄糖20g/l pH至7.0大豆粉 5g/l酵母提取物 5g/lNaCl 5g/lK2HPO45g/l每125ml三角烧瓶25ml，用于接种物和生物转化。
从斜面或冷冻贮存原种培养物中接种入25ml的培养基中(位于上述125ml三角烧瓶)，28℃振荡培养2至3天。将2.5ml培养物移入三角烧瓶中的25ml培养基中且再振荡培养1天。加入溶于DMSO中且无菌过滤至终浓度0.2mg/ml的CP-324,098。以1天间隔加入其它底物。继续振荡培养1至6天。提取和纯化用两倍于培养液的乙酸乙酯在分液漏斗中提取培养液。通过于1000×g离心5分钟分相，然后将上层乙酸乙酯相小心移出，且蒸发至干燥。甲醇也可很好地作为一种萃取剂。可利用固相萃取和制备性HPLC纯化产物。
手性HPLC试验柱 手性OD，4.6×250mm(Daicel，ChiralTechnologies)流速 0.7ml/分钟样品体积 20μl浓度 0.1mg/ml温度 30℃检测 220nm处紫外线(UV)流动相100ml乙醇(USP，脱水，200标准(proof))，加上900ml己烷，加1ml N’N’-二乙胺样品溶于乙醇。
权利要求
1.一种由式(II)化合物
制备式(I)化合物的方法，
其包括在一种衍生自单孢霉属微生物培养物的酶存在下，去甲基化式(II)化合物。
2.如权利要求1的方法，其中所述微生物是Monosporiumolivaceum。
3.如权利要求2的方法，其中所述Monosporium olivaceum是Monosporium olivaceum ATCC 36300。
4.一种由式(II)化合物
制备式(III)化合物的方法，
其包括在一种衍生自Thamnostylum微生物培养物的酶存在下，去甲基化式(II)化合物。
5.如权利要求4的方法，其中所述微生物是Thamnostylumpiriforme。
6.如权利要求5的方法，其中所述Thamnostylum是Thamnostylum piriforme ATCC 8992。
7.利用式(II)化合物
制备式(I)化合物的用途。
8.如权利要求7的用途，其中式(II)化合物被非选择性O-去甲基化。
全文摘要
本发明涉及利用Monosporium属和Thamostylum属的微生物非对映体选择性O－去甲基化药物中间体,以制造式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物。
文档编号C07D295/00GK1259577SQ9911831
公开日2000年7月12日 申请日期1999年8月27日 优先权日1998年8月28日
发明者S·J·特鲁斯戴尔 申请人:辉瑞产品公司