专利名称：：一种微生物转化制备(s)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法
技术领域：
：本发明涉及一种重要的手性药物中间体(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的生物转化制备方法，属于生物催化
技术领域：
。(二)
背景技术：
：(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇是一种重要的手性药物中间体，可用于合成NK-1受体拮抗剂，该药物可有效地治疗抑郁及其他精神疾病，在治疗一系列中枢和末梢神经系统抑制中具有纟艮好的潜在疗效。目前所知的制备方法主要有三条路径(1)化学法。主要是以稀有金属(铑、钌等)为催化剂合成(8)-1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇，反应收率和ee值均较高，但稀有金属催化剂的价格昂贵，不适宜工业化生产。(2)酶转化法。采用提取纯化后的酶(如羰基还原酶)进行1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不对称还原，优点是立体选择性好，副产物少。但反应过程中需要解决辅酶再生问题，外加辅酶的价格昂贵。如David等采用来自红平红球菌i/7wfococcMSeo^rapofe的醇脱氢酶酶法合成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇，对映体过量值>99.9%,转化率〉98%。但在需要辅因子NADH的醇脱氬酶酶催化还原过程中还需要加入曱酸脱氬酶(formatedehydrogenase,FDH)以实现辅因子的原位再生，在实际应用中受到一定的限制。(3)微生物细胞生物转化法。即采用完整的微生物细胞作为生物催化剂进行l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不对称还原。微生物细胞含有完整的酶系，该方法不需要对胞内酶进行提纯，催化反应中也不需额外添加昂贵的辅酶，因而减少了工序并降低了成本。但现有已知可用于生物不对称还原制备(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇的菌种(如红酵母等)，对映体过量值不超过88.5%。
发明内容本发明目的是为了提供一种高光学纯度,工艺简单和易于工业化生产的(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的生物制备方法。为达到发明目的本发明釆用的技术方案是一种微生物转化制备(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮为底物、以热带假丝酵母(Qm^/a104的发酵产物为酶源的反应体系中，于2834°C下进行不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(S)-l-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇；所述热带假丝酵母(Ow^/"/rap/c"to)104保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo:M209034,保藏日期2009年2月27日；所述发酵产物为热带假丝酵母104经发酵获得的发酵液或湿菌体；可将湿菌体加入含有l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮底物的緩沖溶液中作为反应体系，或直接按需要量将底物加入热带假丝酵母104发酵液中作为反应体系。所述反应体系中底物初始浓度为10~90mmol/L，发酵产物加入量以其所含菌体的湿重计为50-400g/L。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重。所述反应体系中还添加有终浓度为10~100g/L的麦芽糖作为辅助底物，以促进反应的进行。优选的，所述反应体系的溶剂为0.1M,pH8.0的磷酸緩沖液，将底物和湿菌体加入缓冲液中，作为反应体系。所述不对称还原反应的反应温度为28~34°C,反应时间为16~40小时。在此条件下所得的转化液进行手性气相色谱(GC)分析测定表明，转化产物的主要组分为(S)-1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。所述发酵产物由如下方法制备得到热带假丝酵母104接种至发酵培养基，于温度2834。C下培养16~30小时后，得发酵液，或者将发酵液过滤得到湿菌体。所述发酵培养基为常规适用于热带假丝酵母的液体发酵培养基。本发明中，所述发酵培养基终浓度组成如下葡萄糖4060g/L,酵母粉10~15g/L，氯化铵25g/L,磷酸二氬钾0.52g/L，磷酸氯二钾0.52g/L，硫酸镁0.1lg/L,溶剂为水，pH值68.5。所述产物分离纯化方法如下转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述(S)-l-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。具体的，所述方法如下(1)斜面培养取常规适用于热带假丝酵母的斜面培养基，接种Cam&^frap/cato104菌林(CCTCCNo:M209034),30。C斜面培养35天，作为斜面种子；(2)种子培养取常规适用于热带假丝酵母的种子培养基，接入斜面种子，28~34°C，摇床转速100-250r/min，培养10~30小时，作为种子液；(3)发酵培养种子液以5~10%体积比接种量，接种至常规适用于热带假丝酵母的发酵培养基，2834°C，摇床转速100-250r/min，培养1630小时，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心，收集湿菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩沖液中，同时加入底物l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物质量浓度为10-90mmol/L,菌体浓度为50~400g/L,并添加终浓度为10~100g/L的麦芽糖作为辅助底物，于2834°C、100~250r/min反应1640小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇。^f尤选的，所述方法^口下(1)斜面培养斜面培养基终浓度组成为葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,琼脂20g/L,溶剂为水，pH6.5，121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种C朋cfe/afrap/cato104菌林，30°C培养35天，作为斜面种子；(2)种子培养种子培养基终浓度组成为葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L，NH4C13g/L,KH2P041g/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L，溶剂为水，pH6.5,12rC灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面种子，于2834。C、100250r/min培养1030小时，作为种子液；(3)发酵培养发酵培养基终浓度组成为葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4C13g/L,KH2P04lg/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L,溶剂为水，pH6.5,121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却，以5~10%体积比接种量接种种子液，28~34°C、100-250r/min培养16~30小时，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心、收集菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐緩沖液中，同时加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物质量浓度为10~90mmol/L，菌体浓度为50~400g/L，并添加终浓度为10100g/L的麦芽糖作为辅助底物，28~34。C、100~250r/min反应1640小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。底物1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙酮与产物(S)-1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的气相色谱(GC)测定反应结束后，用适量的乙酸乙酯萃取，用GC-2014气相色谱分析。检测条件检测器为FID,色谱柱型号为HPChiral10%Cyclodextrin(30mx0.25mmx0.25|im),载气为氮气，色i普柱温度60°C-160°C，进样器和检测器温度分别为220。C和25(TC。产物(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇对映异构体过量值(e.e.)测定方法如下产物的对映体过量值由下式计算e.e.=(C5-+x100%式中，G为(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的浓度，Cw为(R)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的浓度。本发明方法相对于传统的化学不对称合成法或酶转化法具有以下优点①生成的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇对映体过量值高，达到99%以上；②生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉;③在整个不对称还原反应过程中不需要添加辅酶;④反应条件温和，环境友好。本发明通过菌种优选，确定以热带假丝酵母(Ca"^/afra/7/ca/z:s)104作为产酶菌林，在单一水相体系中催化不对称还原l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮生成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇，所得产物的对映体过量值在99%以上，具有很好的应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:对实验室保藏菌抹进行了菌种筛选。转化条件为在20mL0.1M,pH8.0的磷酸钠緩冲液中，添加底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮浓度为5Ommol/L,辅助底物麦芽糖浓度为50g/L,湿菌体浓度300g/L，30°C,摇床转速200r/min条件下转化30h,结果见表l。表l:不同菌种催化1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不对称还原结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结论热带假丝酵母Oro//^的p/cafc104(CCTCCNo:M209034)催化1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的产率和对映体过量值较高，将其作为优选菌种。实施例2:(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇的制备斜面培养培养基各组分终浓度为葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L，球脂20g/L,溶剂为水，pH6.5，12rC灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种热带假丝酵母CawiWa104菌株(CCTCCNo:M209034),30。C培养35天，作为斜面种子。种子培养培养基各组分终浓度为葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4C13g/L,KH2P04lg/L,K2HP041g/L，MgS04'7H200.4g/L，溶剂为水，pH6,5,121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面种子，30°C，摇床转速200r/min，培养20小时，作为种子液；发酵培养培养基各组分终浓度为葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L,NH4Ci3g/L,KH2P04lg/L，K2HP04lg/L,MgS04'7H200.4g/L，溶剂为水，pH6.5,12rC灭菌20分钟，灭菌后冷却、接种种子液，接种量10%体积比，30°C，摇床转速200r/min,培养24小时，得发酵液。将发酵液离心、收集菌体，用O.IM，pH8.0的磷酸盐緩冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液中，同时加入底物l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮使底物质量浓度为50mmol/L，湿菌体加量为300g/L,并添加终浓度为50g/L的麦芽糖作为辅助底物，30°C、200r/min反应30小时，反应结束，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，得所述的(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇，产率为70.3%，对映体过量值达99%以上。实施例37:用热带假丝酵母Ca"^fo/rop/ca/^104菌(CCTCCNo:M209034),4姿实施例2方法发酵培养后，将湿菌体加入装有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩冲液的250mL三角瓶中(湿菌体终浓度为300g/L),并添加终浓度为50g/L的麦芽糖作为辅助底物，底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮浓度为1090mmol/L,于30。C,200r/min转化30h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后，采用气相色镨分析(S)-1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇含量与对映体过量值，结果见表2。表2:不同底物浓度对产率和对映体过量值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从表2可知，底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的较佳浓度为50mmol/L0实施例8~13:用Ca"^^104菌(CCTCCNo:M209034),按实例2方法发酵培养后，取湿菌体于装有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩冲液的250mL三角瓶中(湿菌体终浓度300g/L),底物浓度为50mmol/L,并添加终浓度50g/L的不同辅助底物，于30"C，200r/min下进行转化30h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后进行气相色镨分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量与对映体过量值，结果见表3。表3:不同辅助底物对产率和对映体过量值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结论从表3可以看出，较佳辅助底物为麦芽糖。实施例1418:用热带假丝酵母C""^i"fra//cflfo104菌(CCTCCNo:M209034)，按实施例2方法发酵培养后，将湿菌体加入装有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩冲液的250mL三角瓶中(湿菌体终浓度为300g/L),底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮浓度为50mmol/L,并添加终浓度为10100g/L的麦芽糖作为辅助底物，于3(TC，200r/min转化30h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后，采用气相色谱分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量与对映体过量值，结果见表4。表4:不同底物浓度对产率和对映体过量值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从表4可知，辅助底物麦芽糖的较佳浓度为50g/L。实施例14~21:用frap/cato104菌(CCTCCNo:M209034)，按实例2方法发酵培养后，取湿菌体于装有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩冲液的250mL三角瓶中(湿菌体终浓度为50~400g/L),底物浓度为50mmol/L，并添加50g/L的麦芽糖作为辅助底物，于30°C，200r/min条件下转化30h。反应结束后离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后进行气相色谱分析(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇含量与对映体过量值，结果见表5。表5:不同菌体浓度对产率和对映体过量值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论从表4可以看出，较佳菌体浓度为300g/L。实施例27:用Om^/a^c;p/c"to104菌(CCTCCNo:M209034),按实例2方法发酵培养后，取300g/L湿菌体于装有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中，底物浓度为50mmol/L,并添加50g/L的麦芽糖作为辅助底物，于3(TC,200r/min下转化2~48h。反应结束后离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgS04干燥，过滤后进行气相色谱分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量与对映体过量值。结论较佳的转化时间为30h。权利要求1.一种微生物转化制备(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮为底物、以热带假丝酵母(Candidatropicalis)104的发酵产物为酶源的反应体系中，于28～34℃下进行不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇；所述发酵产物为热带假丝酵母104经发酵获得的发酵液或湿菌体；所述热带假丝酵母(Candidatropicalis)104保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNoM209034，保藏日期2009年2月27日。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为10~90mmol/L,发酵产物加入量以所含湿菌体的湿重计为50400g/L。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应体系中还添加有终浓度10~100g/L的麦芽糖。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述反应体系的溶剂为0.1M，pH8.0的磷酸緩冲液。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵产物由如下方法制备得到热带假丝酵母104接种至发酵培养基，于温度2834。C下培养16~30小时后，得发酵液，或者将发酵液过滤得到湿菌体。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下葡萄糖4060g/L，酵母粉10-15g/L,氯化铵25g/L，磷酸二氢钾0.52g/L,磷酸氢二钾0.52g/L，碌lJ臾4美0.11g/L,溶剂为水，pH值6~8.5。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培养适用于热带假丝酵母的斜面培养基接种Caw/Wafrop/cflfc104菌抹，30。C斜面培养3~5天，作为斜面种子；(2)种子培养适用于热带假丝酵母的种子培养基接入斜面种子，2834°C,摇床转速100~250r/min,培养10~30小时，作为种子液；(3)发酵培养种子液以5~10%体积比接种量接种至适用于热带假丝酵母的发酵培养基，2834°C,摇床转速100-250r/min,培养16~30小时，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心，收集湿菌体，用0.1M,pH8.0的磷酸盐緩冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐緩沖液中，同时加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物质量浓度为1090mmol/L，菌体浓度为50~400g/L,并添加终浓度为10~100g/L的麦芽糖作为辅助底物，于2834。C、100250r/min反应1640小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇。9.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培养斜面培养基终浓度组成为葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L,琼脂20g/L,溶剂为水，pH6.5,121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种G3"W^3frap/cafe104菌抹，3(TC培养3~5天，作为斜面种子；(2)种子培养种子培养基终浓度组成为葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L，NH4C13g/L,KH2P041g/L,K2HP041g/L,MgS04.7H200.4g/L，溶剂为水，pH6.5,121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入斜面种子，于28~34°C、100250r/min培养10~30小时，作为种子液；(3)发酵培养发酵培养基终浓度组成为葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4Cl3g/L，KH2P041g/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L,溶剂为水，pH6.5,121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却，以5~10%体积比接种量接种种子液，28~34°C、100~250r/min培养16~30小时，得发酵液；(4)微生物转化将发酵液离心、收集菌体，用O.IM，pH8.0的磷酸盐緩冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M,pH8.0的磷酸盐緩沖液中，同时加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物质量浓度为1090mmol/L,菌体浓度为50~400g/L,并添加终浓度为10100g/L的麦芽糖作为辅助底物，28~34°C、100~250r/min反应1640小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇。全文摘要本发明提供了一种微生物转化制备(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮为底物、以热带假丝酵母(Candidatropicalis)104的发酵产物为酶源的反应体系中，于28～34℃下进行不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。本发明通过菌种优选，确定以热带假丝酵母(Candidatropicalis)104作为产酶菌株，在单一水相体系中催化不对称还原1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇，所得产物的对映体过量值在99％以上，具有很好的应用前景。文档编号C12R1/74GK101519674SQ20091009642公开日2009年9月2日申请日期2009年3月2日优先权日2009年3月2日发明者何军邀,俊唐,孙立明,普王申请人:浙江工业大学