专利名称：一种螺旋霉素的微生物转化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的一种酶的微生物转化方法。
临床使用的螺旋霉素属于16-员大环内酯抗生素，其化学结构式为
螺旋霉素Ⅰ-H螺旋霉素Ⅱ-COCH3螺旋霉素Ⅲ-COCH2CH3改变螺旋霉素的化学结构，可以改善其疗效和毒性，例如用化学方法进行酰化反应将螺旋霉素改造成乙酰螺旋霉素，它的体内外活性及临床疗效均优于螺旋霉素，毒性有所降低，现已广泛用于临床。化学改造的丙酰螺旋霉素和其它酰基螺旋霉素已有文献报导，但它们存在一定缺点，如酰化反应定向性差，当进行4″-位羟基酰化时，碳霉糖胺的2′-位羟基也同时被酰化，虽经甲醇解可除去2′-位上的酰基，但其中仍含有双酰基衍生物，以致影响了质量[1]。但是，用微生物方法改造转化螺旋霉素为酰基螺旋霉素的，目前只见日本专利(52-82790)报导，它是通过筛选获得菌株，使螺旋霉素4″-位和3″-位羟基酰化为酰基螺旋霉素，其酰化产物的活性与原螺旋霉素差别不大，而酰化反应必须加进相应的酰基辅酶A。目前尚未见有生产的报导。
本发明是，首先有目的地挑选可能具有专性和较强酰化4″-羟基的酶的微生物;其次要求该微生物必须是无抗菌活性的变株。根据这个原则，考虑了与螺旋霉素同族的麦迪霉素，它的碳霉糖上的4″-碳的羟基酰化反应是在发酵过程中进行。可见，该抗生素的产生菌具有较强的酰化4″-位羟基的酶，但是它产生的麦迪霉素影响分离和纯化。因此，选用麦迪霉素产生菌的无活性变株作为筛选对象，即可为生产创造条件。本发明选用的68T100变株
图1a的获得方法是以麦迪霉素产生菌1748斜面制成孢子悬液，将适宜浓度的孢子涂布在合成培养基平皿上，在41.5℃高温进行培养，待菌落长出后，移单菌落于含有培养基的钢管内，继续培养8天，再将钢管移于含有八叠球菌的平板上检定抗菌活性，以无活性菌落接种斜面，进行体液复试，如仍不出现抑菌圈，此菌落即为无活性变株。
本发明的要点是(1)酰化反应，所用底物为螺旋霉素，采用一般发酵方法，酰化所用微生物为无抗菌活性变株68T100，其形态特征在麦芽汁-酵母膏斜面上，于28℃培养生长5-7天，气生菌丝和孢子丰富，表面浅紫灰色，栗棕色素，孢子丝呈螺旋形，孢子表面光滑(图1a);培养菌体和酰化反应条件菌体培养是将麦芽汁-酵母膏斜面上的菌体，用挖块法接种于发酵培养基(淀粉1-3%，葡萄糖1-3%，(NH4)2SO40.1-0.5%，酵母粉0.3-0.8%，黄豆饼粉0.5-2.0%，K2HPO40.05%、MgSO40.02%、CaCO30.3-0.8%、自然PH(简称SGYS培养基)、27-29℃恒温培养48小时、以5%量的种子转入同样培养基，到对数生长期加400-800μ/ml作为底物的螺旋霉素，开始进行酰化反应(温度27-29°，PH5.0-7.0)，经24-72小时反应终止，用薄层层析和杯碟法(八叠球菌为试验菌)测定酰化产物。(2)酰化产物的分离与鉴别酰化产物的分离，是将发酵液用NaOH调至PH8.0-8.3，用乙酸丁酯抽提，得粗品，通过硅胶柱层析进行分离纯化，得到较纯的4″-0-丙酰螺旋霉素，然后进行鉴别。
实验结果表明用生长中细胞进行酰化反应，在薄层层析图谱上出现四个斑点(图2)，它们与螺旋霉素和乙酰螺旋霉素对照，均不在同一位置，但与乙酰螺旋霉素接近略偏低，经质谱鉴别为4″-0-丙酰螺旋霉素，一般发酵液中转化率(TLC紫外扫描半定量)为75-80%，从发酵液分离纯化的丙酰螺旋霉素的收率为40-50%(按底物加入的量计算所得的丙酰螺旋霉素纯品，并按40公升罐实装量)。酰化产物经硅胶柱层析，所得制品为白色粉末，溶于大多数溶媒，溶点低于螺旋霉素为(122℃-125℃)，[α]16D-43°，TLCRf值为0.59，甲醇溶液的紫外吸收峰在232nmλMeOHmax，红外吸收光谱与螺旋霉素及乙酰螺旋霉素区别不大，元素分析C-61.9%，H-8.34%，N-3.17%，理论值C-61.6%，H-8.6%，N-3.17%，分子量为954，实验所得分子量数据为954(质谱)。核磁共振谱(13C与1H)和质谱结果见表1及图3、4a、b。
表1.核磁共振中4″-0-丙酰螺旋霉素碳原子的化学位移
δ(ppm)δ(ppm)δ(ppm)δ(ppm)δ(ppm)δ(ppm)C1169.9 169.9 169.9 ′C1104.0 104.4 104.0C237.5 37.2 37.2 ′C271.8 69.0 69.2C371.8 71.6 71.7 ′C368.9 68.9 69.2C477.6 77.6 77.8 ′C475.3 74.8 74.9C585.1 84.6 84.5 ′C573.0 72.9 73.0C629.4 28.9 28.9 ′C619.0 19.0 19.0C730.4 30.1 30.2 ′C741.9 42.0 42.0C831.8 31.8 31.9 ′C842.0 41.9 42.0C980.3 79.5 79.7 ′C9C10126.9 126.4 126.7″C196.2 96.2 96.4C11135.0 135.0 135.4″C241.0 40.6 41.0C12132.6 132.0 132.3″C369.3 69.3 69.5C13132.2 131.6 131.9″C477.1 76.3 76.4C1440.7 40.9 40.6″C563.5 65.9 66.1C1568.9 68.7 68.9 ″C618.5 18.3 18.3C1620.4 20.4 20.3 ″C725.9 25.4 25.4C1742.8 42.4 42.5 ″C8174.0C18200.6 200.9 201.3 ″C927.5C1916.1 15.4 15.4 ″C109.2C20170.0 170.4 170.9C2127.7 27.6 27.7 C1100.0 100.4 100.3C229.2 9.0 9.0 ′″C231.3 31.2 31.2C2362.0 62.3 62.4 ′″C318.8 18.3 18.3′″C465.2 64.7 64.9′″C573.8 73.6 73.7′″C618.7 18.5 18.7′″C741.2 40.6 41.0′″C841.2 40.6 41.0＊文献资料〔2〕〔3〕
表1数据表明酰化衍生物(即酰基螺旋霉素Ⅲ)与文献报导的[2][3]螺旋霉素Ⅲ及其酰化衍生物的4″-位碳结合的丙酰基化学位移吻合较好，故可认为酰化衍生物的4″-位碳的羟基被丙酰基取代，即为4″-0-丙酰基螺旋霉素Ⅲ。表1中的9.2ppm，27.5ppm，174.0ppm为丙酰基团，与螺旋霉素Ⅲ比较，4″-位碳从76.2ppm位移到77.1ppm，向低场方向移动0.9ppm，与此同时，5″-位碳从65.9ppm向高场方向移动2.4ppm至63.5ppm。根据上述情况以及质谱碎片峰201m/e，表明丙酰基接于4″-位碳上。通过(图3)1H图谱分析，酰化衍生物的谱峰与它的13C-NMR的结果基本一致。其次，质谱资料(图5a、b)进一步证实，酰化产物为4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ，质谱中分子离子和碎片离子具有以下结构片断分子离子峰为955m/e，碎片(3)(201m/e)表明，在碳霉糖上接有丙酰基，碎片(2)(174m/e)和(4)(318m/e)说明碳霉糖胺上设有接上任何酰基基因，同时根据其它相关的碎片峰，也可说明酰化产物是单丙酰螺旋霉素Ⅲ。
综合以上分析结果以及理化数据，证实螺旋霉素的酰化产物，主要为4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ。酰化产物的抗菌谱和实验治疗如表2、表3所示表2酰化产物的抗菌谱试验菌MICMg/ml酰化产物乙酰螺旋霉素螺旋霉素乙类链球菌A120.39 1.56 0.78肺炎双球菌3＜0.19＜0.19＜0.19金黄色葡萄球菌153.136.253.13福氏痢疾杆菌2512.5025.0012.50大肠杆菌1515100.00100.00100.00绿脓杆菌11＞100.00＞100.00＞100.00变形杆菌9＞100.00＞100.00＞100.00
表2所得结果说明，酰化产物体外试验对乙类链球菌A12和金黄色葡萄球菌15均比乙酰螺旋霉素抗菌效果好。
表3 酰化产物对肺炎球菌及金黄色葡萄球菌体内活性(ED50)试验菌试验样品半数有效剂量mg/kg肺炎球菌酰化产物3.6乙酰螺旋霉素7.5金黄色葡萄球菌15酰化产物128.6乙酰螺旋霉素209.1小鼠口服急性毒性转化产物的＜D503000mg/kg表3结果说明，酰化产物对肺炎球菌和金黄色葡萄球菌的体内疗效(ED50)也比乙酰螺旋霉素好。
采用本发明的优点和积极效果是定向酰化螺旋霉素，可保证产品质量;酰化反应进行不加前体和辅酶A，要求条件比较温和;避免化学工业带来的劳动保护和环境污染问题;用螺旋霉素粗品即可转化，而且转化率可达75%以上;发酵和提炼工艺与一般大环内酯抗生素相似，没有特殊要求;酶源丰富，适于工业生产。
附图图1a无抗菌活性变株68-T100电镜形态，孢子表面光滑、无刺图1b1748产生菌电镜形态，孢子表面呈刺状图2转化产物的TLC图谱(1)-螺旋霉素Ⅰ
(2)-螺旋霉素Ⅱ(3)-螺旋霉素Ⅲ(4)-丙酰螺旋霉素(5)-乙酰螺旋霉素(6)-乙酰螺旋霉素1-(1)(2)(3)+(5)(6)2-(5)(6)3-(1)(2)(3)4-(1)(2)(3)+(4)Rf0.59紫外扫描半定量测定为75%(转化率)。
图3 4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的1HNMR光谱图4a4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的质谱图谱图4b4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的质谱裂解方式参考文献[1]高平泛志等(1970)Jap.J.Antibiotics23.429[2]OmuraS.etal(1975)J.Am.chem.Soc.97，4001-4009[3]OmuraS.etal(1984)J.Antibiotics37(7)76权利要求
1.一种能构酰化螺旋霉素结构中4″-羟基的酶的微生物变株及其酰化螺旋霉素的方法，其特征在于所说的变株具有专一性和较强酰化4″-羟基的酶活性，酰化过程不加任何前体及辅酶。
2.按照权利要求1所说的变株，其特征在于它不具有抗菌活性。
3.按照权利要求1和2所说的酰化4″-羟基的方法，其特征在于将底物螺旋霉素加入对数生长期的无抗菌活性培养物中(培养基成分淀粉1-3%，葡萄糖1-3%，(NH4)2SO40.1-0.5%，酵母粉0.3-0.8%，黄豆饼粉0.5-2.0%，K2HPO40.05%，MgSO40.02%，CaCO30.3-0.8%，自然PH，27-29℃)恒温培养24-72小时，反应终止，用薄层层析测定酰化产物的Rf值为0.57-0.65。
全文摘要
一种螺旋霉素的微生物转化方法，其酰化酶的微生物变株具有专一性和较强酰化4′-羟基的酶活性，将底物螺旋霉素加入对数生长期的上述变株培养物中，酰化过程不加任何前体和辅酶。这种微生物转化方法定向性好，反应条件较温和，可避免化学转化带来的劳动保护与环境污染问题。由于用螺旋霉素粗品即可转化，转化率可达75％以上，酶源丰富，故适于工业化生产。
文档编号C12Q1/533GK1030791SQ87104409
公开日1989年2月1日 申请日期1987年6月27日 优先权日1987年6月27日
发明者刘若莹, 陈燕, 王以光, 王彩芬, 欧斌, 阎桂华, 陈慧贞 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所