专利名称：人参细胞简易培养方法
专利说明 本发明是关于人参细胞的培养方法，从人参细胞培养物中提取出人参总皂甙可作为日用化工、保健食品地制剂原料。
现有的人参细胞培养方法一固体培养法(日本专利、昭48-31917)是在培养器皿中加入无机盐、维生素类化合物、蔗糖、植物激素(如2，4-二氯苯氧乙酸、6-呋喃氨基嘌呤等)、琼脂(7-10克/开)等。在温度为120℃，压力为1-1.2磅/cm2下，灭菌15分钟，无菌条件下接入人参细胞种，然后静止培养，培养结束后从琼脂表层取得人参细胞培养物。该方法琼脂用量大，培养成本高，一般只适用于实验室研究和细胞种保存;方法二液体悬浮培养法(日本专利、昭56-12119)是在培养瓶或罐中加入无机盐、维生素类化合物、蔗糖、植物激素(如2，4-二氯苯氧乙酸、6-呋喃氨基嘌呤等)等，另外加入甲瓦龙酸等生物合成的中间体。在高温、高压下进行灭菌，无菌条件下接入人参细胞种，在瓶中需振摇培养，在罐中进行大规模培养需搅拌、供无菌空气。培养结束后，悬浮液过滤，滤渣烘干得人参细胞。该方法由于在蔗糖浓度为1%时加入甲瓦龙酸等生物合成中间体，使人参皂甙含量提高一倍。液体悬浮培养法设备条件要求高，投资量大，一般企业难于实现。
本发明的目的在于提供一种人参细胞简易培养方法，使培养成本降低、投资量减少，以适合中、小企业生产。
本发明在培养容器中放入有一定规格要求的内撑物，加入一定量的培养液，容器加木塞或棉塞。在温度为120℃、压力为1-1.5公斤/(厘米)2下，灭菌20-30分钟，无菌条件下在内撑物上接入选育出的人参鲜细胞种(每升培养液接入40-50克)，在温度为15-28℃下静止暗培养30-50天，培养过程中添加2-3次改良1号或改良2号培养液以维持原液面。培养结束后从内撑物上刮出培养物，在60℃温度下烘干成淡黄色组织块，得人参干细胞(每升培养液可得13-20克)。
本发明所用的内撑物应渗透性好、不含对培养液有影响的物质，不含有毒物质的植物性纤维。
如以木材和纸组成的内撑物，木材需用水浸泡2-3天，浸泡过程中换2-4次水，取出木材风干后使用。该木材选用厚度为2-5厘米的平板，表面积与容器底面积一样，把该平板分割成小块，以能从容器口中放入和取出为宜，小块平板放入后重新拼成原平面，再在平板上放一张与容器底大小一样的普通滤纸即成。
如以玉米棒心(剥掉玉米后的棒)、纱布和纸组成的内撑物，玉米棒心要制成颗粒状，再用纱布包成表面积与容器底面积一样的垫子。玉米棒心需用量为每升培养液50克(按总加入量计算)，纱布需用量以能将玉米棒心做成垫子为宜。垫子上方再放一张与容器底大小一样的普通滤纸。
如以普通棉花、纱布组成的内撑物，用纱布将棉花包成表面积与容器底面积一样的垫子。普通棉花需用量为每升培养液50克(按总加入量计算)，纱布需用量以能将棉花做成垫子为宜。
上述三种物质木材、玉米棒心、普通棉花可反复使用直到无渗透性为止。
培养液(配制见表1)加入量对上浮内撑物而言为容器体积的1/5;对下沉内撑物而言加到内撑物上方平面3毫米为宜。培养20天后添加改良1号或改良2号培养液(配制见表1)，再过10天添加一次改良1号或改良2号培养液，以后可根据培养液耗掉的量决定添加或不添加，改良1号或改良2号培养液的添加量以不超过内撑物上方平面3毫米为宜。
本发明在培养容器内加入内撑物，使在内撑物上生长的人参细胞通过内撑物均匀地从培养液中吸取营养成分。在培养过程中不需振摇，大规模投入生产不需搅拌和供无菌空气，因而设备简单、投资量小、杂菌污染率低。用木材棉花、玉米棒心等作内撑物，耗资低，且可反复使用。如以年产1吨人参干细胞计算，投资5万元，人工10人，可进行常年性生产。改良1号培养液，维生素类只加B1，蔗糖量增加1-2倍，改良2号培养液在改良1号基础上将磷酸二氢钾量增加1倍，不加任何植物激素，使人参细胞得率和人参皂甙含量都有提高。(见表2)本发明培养出的培养物与栽培人参的化学成分、药理活性基本相似(见表3、表4、表5、图3)。
图1是人参细胞在培养瓶中培养的剖视图 图2是人参细胞在培养瓶中培养的俯视图 图3是人参细胞培养物、天然人参、人参皂甙标准品的薄层图谱。
图1中1为500毫升克氏玻璃瓶，2为人参细胞培养物，3为培养液，4为用纱布将棉花包成的内撑物，5为棉塞。
图3是将人参细胞培养物、天然人参、人参皂甙标准品用甲醇溶解，在硅胶G-羧甲基纤维素钠薄层板上点样，以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10下层)展开，用5%硫酸-乙醇显色。图中1为人参皂甙Rb2标准品，2、3、5、6、9为人参细胞培养物，4为人参皂甙Rd标准品，7为人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Ro标准品，8为人参皂甙Rc标准品，10为天然人参。
实施例1，在500毫升克氏玻璃瓶中，放入用纱布将10克已制成颗粒状的玉米棒心包成与瓶底面积相同的垫子，上放同面积普通滤纸一张，加入100毫升培养液(配制见表1)，在温度为120℃、压力为1-1.5公斤/(厘米)2下，灭菌20分钟，无菌条件下接入选育出的人参鲜细胞10克(批号781-2)。在15-28℃温度下静止暗培养，培养20天后加85毫升改良1号培养液(配制见表1)，再过10天再加85毫升改良1号培养液。培养50天后用不锈钢铲将人参鲜细胞(淡黄色)从滤纸上刮出。得人参鲜细胞114克，在60℃温度下烘干至恒重，得人参干细胞4.7克。每升培养液得人参干细胞13-17克(以总培养液加入量计算)。人参总皂甙含量为4.5%。
实施例2，在500毫升克氏玻璃瓶中，放入用纱布将10克棉花包成与瓶底面积相同的垫子，加入200毫升培养液(配制见表1)、在温度为120℃、压力为1-1.5公斤/(厘米)2下，灭菌20分钟，无菌条件下接入选育出的人参鲜细胞10克(批号781-2)，在15-28℃温度下静止暗培养，培养20天后加85毫升改良2号培养液(配制见表1)，再过10天再加85毫升改良2号培养液。培养50天后用不锈钢铲将人参鲜细胞(淡黄色)从棉垫上刮出。得人参鲜细胞183.6克，在60℃温度下烘干至恒重，得人参干细胞7.58克。每升培养液得人参干细胞18-20克，(以总培养液加入量计算)。人参总皂甙含量为6.34%。
表1 培养液、改良1号和改良2号培养液组成成分 注调PH＝5.8表2 不同培养液组成对人参细胞增殖和皂甙含量的影响
表3 培养物与栽培人参的灰分和离子量的比较(%)
表4 培养物与栽培人参的氨基酸含量比较(10-3mg/mg) 表5培养物与栽培人参的药理活性比较
权利要求
1、一种人参细胞的培养方法，其特征是
a在培养容器内放入渗透性好、不含对培养液有影响的物质，不含有毒物质的植物性纤维。
b改良1号培养液，维生素类只加B1，蔗糖量增加1-2倍，改良2号培养液在改良1号基础上将磷酸二氢钾量增加1倍，不加任何植物激素。
全文摘要
本发明是关于人参细胞简易培养方法，即在培养容器中放入有一定规格要求的植物性纤维作内撑物，加入培养液，高温、高压、灭菌后，接入细胞种，静止暗培养30-50天，60℃温度下烘干得人参干细胞。本发明所用的内撑物耗资低、培养中不需振摇，大规模生产不需搅拌和供无菌空气，设备简单、投资量小、杂菌污染率低，培养过程中添加改良1号或改良2号培养液，使人参细胞得率和人参皂甙含量都有提高，本发明适合于中、小企业生产。
文档编号C12N5/00GK1033836SQ8710238
公开日1989年7月12日 申请日期1987年3月24日 优先权日1987年3月24日
发明者丁家宜, 耿惠兴, 汤金希, 濮金兰, 徐德然 申请人:中国药科大学