专利名称：一种n－乙酰基半胱氨酸衍生物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及N-乙酰基半胱氨酸衍生物与应用。
背景技术：
蛋白质药物如胰岛素、干扰素具有作用专一、高效等特点，在人类疾病治疗中发挥重要的作用。随着人类基因组计划的完成，蛋白质组学研究的全面展开，将会有越来越多的蛋白质药物用于疾病治疗。然而蛋白质药物稳定性差，易于产生抗原抗体反应和蛋白酶降解，肾脏排除速度快，血浆清除率高，体内半衰期较短，因此限制了蛋白质药物的临床应用。
二十世纪90年代末，国外医药研究人员开始利用一名为“聚乙二醇化”的新技术来改造蛋白质药物。聚乙二醇[Poly(ethylene glycol)，PEG]具有很强的亲水性和柔韧性，在水溶液中具有较大的排水体积，通常是无毒性、无免疫原性的。“聚乙二醇化”技术是将聚乙二醇分子连接到蛋白质分子表面上，从而可以保护蛋白质不受免疫系统和酶类的进攻。与蛋白质相比较，PEG-蛋白质结合物的免疫原性和抗原性降低，同时血浆清除率降低，体内半衰期延长。
Davis等人在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质如胰岛素和酶结合以得到结合物，其中的蛋白质免疫原性较小并保留了大部分的生理活性。Nakagawa等人在美国专利4,791,192中公开了将PEG与胰岛活化蛋白质结合以降低其副作用和免疫原性。Abuchowski等人在″Enzymes as Drugs″(1981)中阐述了PEG修饰的多肽能够显著降低了免疫原性和抗原性，延长体内半衰期，修饰后的多肽如酶类产品将会在多种治疗领域中发挥作用。将PEG和其它聚合物与重组蛋白质结合可降低免疫原性，增大半衰期。参见Nitecki等人的美国专利4,902,502；Enzon，Inc的国际申请PCT/US 90/02133；Nishimura等人的欧洲专利申请154,316以及Tomasi的国际申请PCT/US 85/02572。Veronese等人在文献(Applied Biochem andBiotech，11，141-152(1985))中公开了用氯甲酸苯酯类化合物活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和过氧化物歧化酶。King等人在文献(Int.Archs.Allsrgy Appl.Immun.66，439-446(1981))描述了一种用O-(RO-PEG)-S-甲酰氨基甲基-二硫代碳酸酯中间体使蛋白质与PEG键合的方法。
Alipsky等人在US5,122,614中强调PEG修饰蛋白质的过程中，PEG的活性基团应满足如下条件1)活性基团的活性要高，可以在温和的条件下使PEG与蛋白质快速发生结合反应；2)修饰反应后，活性部位释放出来的副产物应是无毒性性的，或可以很容易从产品中分离出去。
此外，修饰反应应有较高的专一性，避免产生低活性或无活性的PEG-蛋白质结合物；修饰步骤应尽量简单，纯化步骤应尽可能的少。
在PEG与蛋白质的修饰反应中，常用的活性基团包括琥珀酰亚胺的酯基(N-hydroxysuccinimide，NHS)、醛基、三氟磺酸酯基、对硝基苯碳酸酯基及苯肼三唑碳酸酯基等。其中，对硝基苯碳酸酯基的主要缺点是反应副产物毒性高；苯肼三唑碳酸酯基的活性低、修饰反应时间长(48-72hr pH8.5)，而且价格昂贵(Beauchamp，et al.Analyt.Biochem.131，25-33(1983))；醛基主要用于多肽氨基末端的修饰，专一性高，但通常需要进行两步反应即修饰反应和还原反应；琥珀酰亚胺的酯基活性高、反应条件温和，是目前应用最广的活性基团，其不足之处是尽管以修饰多肽上的氨基为主，但还可以修饰组氨酸上咪唑基、络氨酸上的羟基等。
发明内容
本发明的目的是提供一种N-乙酰基半胱氨酸衍生物。
本发明所提供的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，具有式I结构， 式I其中，POLY为分子量范围在1000Da～500,000Da之间的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。
优选的所述N-乙酰基半胱氨酸衍生物结构式为式II， (式II)
其中，n为25-4000之间的正整数；R为氢、碳原子数为1-10的烷基、苄基、CH2＝CH2-CH2-、CH2＝CH-CO-、或(CH3)3-O-CONH-CH2-CH2-；Y为-O-、-S-、-NHCO-、-CONH-、-COO-、-OCO-、-NHCO2-、或-O2CNH-；R1为H或甲基；R2为H或甲基；m为0-5之间的正整数。
式II中n优选为113-1500之间的正整数；R1优选为H，R2优选为H；R优选为甲基；Y优选为-O-；m为0-5之间的正整数，m更优选为1-5之间的正整数，更有效地，m为2。
本发明的N-乙酰基半胱氨酸衍生物还可以为结构式为式III的化合物， (式III)其中，n1、n2分别为25-4000之间的正整数，优选为113-1500的正整数；m1、m2分别为0-5的正整数，优选为1-5之间的正整数，更优选地，m为2。
本发明N-乙酰基半胱氨酸衍生物均可以用本领域的常规方法合成，例如，mPEG类的N-乙酰基半胱氨酸衍生物(R为甲基，R1、R2为H)制备过程主要包括1)mPEG-OH的活化，例如用甲磺酰氯与mPEG-OH反应，将其活化生成mPEG-甲磺酰酯；2)将所得mPEG-甲磺酰酯与羟基(巯基)酸酯反应生成mPEG-酸酯，mPEG-酸酯经水解反应生成mPEG-酸；3)mPEG-酸在甲苯、二氯甲烷等有机溶剂中与亚硫酰氯反应生成mPEG-酰氯；4)mPEG-酰氯与N-乙酰半胱氨酸(NAC)反应即可以得到mPEG-NAC。
或者，也可以采用另外一条合成途径1)mPEG-OH或mPEG-NH2三光气、丙烯酰氯、双酰氯化合物等反应，直接得到mPEG-酰氯；2)mPEG-酰氯与N-乙酰半胱氨酸(NAC)反应即可以得到mPEG-NAC。
本发明的另一个目的是提供本发明N-乙酰基半胱氨酸衍生物的用途。
本发明所提供的N-乙酰基半胱氨酸衍生物主要用于修饰蛋白质或多肽中的氨基，修饰产物稳定，有利于蛋白质或多肽产品的长期保存，可以作为蛋白质或多肽的修饰剂。
本发明的功能化PEG(N-乙酰基半胱氨酸衍生物)的优点可以体现在以下几个方面其一，主要修饰蛋白质或多肽中的氨基，从而具有较高的选择性和专一性；其二，具有较高的反应活性，可以在温和的条件下与蛋白质或多肽发生修饰反应，修饰过程操作简便；其三，反应后生成的主要副产物是NAC，没有任何毒副作用；其四，PEG一般与多肽间形成稳定的连接物，有利于产品的长期保存，可以广泛用于蛋白质、多肽等药物的修饰。
图1为mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC修饰干扰素α-2a的电泳图。
图2为mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC修饰牛血红蛋白的电泳图。
具体实施例方式
以下实施例对于本专业技术人员而言，很容易从中推出式II中R为其他的低级烷基如乙基、丙基、异丙基等的N-乙酰基半胱氨酸衍生物的制备工艺。
实施例1、制备mPEG5k-O-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为氧原子；m为0；n为113)取5.0g的mPEG5k溶于30ml二氯甲烷和15ml甲苯的混合液中，加入三光气1.53克，混合均匀，加入无水三乙氨0.8ml，搅拌反应过夜。将反应液减压抽真空，浓缩至干后加入150ml冷乙醚沉淀。将沉淀溶解到10ml甲苯和15ml二氯甲烷的混合液中，加入N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)0.33克，滴加三乙胺0.3ml，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干，加50ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG5k-O-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-O-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)；证明所得化合物正确。
实施例2、制备mPEG10k-O-CH2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为氧原子；m为1；n为227)a)甲氧基聚乙二醇10000-乙酸(mPEG10k-O-CH2-COOH)的合成取mPEG10k10.0克溶于150ml甲苯，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为100ml时停止加热，溶液冷却到室温。将溶液加入到含有叔丁醇钾0.3克的20ml叔丁醇和20ml甲苯的混合液中，氮气保护下向内加入2.1mmol的2-溴代乙酸叔丁酯，反应在室温搅拌过夜。将反应液过滤，抽真空浓缩至干。
将残渣倒入100ml的稀盐酸中搅拌过夜，溶液反应后用氢氧化钠调节pH值到3左右。用二氯甲烷进行抽提，每次120ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，过滤后减压浓缩至干，得到mPEG10k-O-CH2-COOH。
b)mPEG10k-O-CH2-CO-NAC的合成将mPEG10k-O-CH2-COOH溶解到150ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出50ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空，浓缩至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入80ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG10k-O-H2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.21(s，2H，-O-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)；证明所得化合物正确。
实施例3、制备mPEG20k-O-CH2-CH2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为氧原子；m为2；n为454)a)mPEG20k-O-(CH2)2-CN的合成取20.0g的mPEG20k溶于30ml 0.5N氢氧化钠的水溶液中，室温搅拌2小时。溶液冷却到4℃后，加入丙烯氰10ml，搅拌反应2小时后，用盐酸调节pH至中性。溶液用二氯甲烷分三次抽提，每次50ml。合并抽提液，用硫酸钠干燥。过滤后，真空减压浓缩至干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-CN。
b)甲氧基聚乙二醇20000-丙酸(mPEG20k-O-(CH2)2-COOH)的合成将上步制备得到的mPEG20k-O-(CH2)2-CN溶解到80ml浓盐酸中，室温搅拌72小时。向溶液中加入5N氢氧化钾溶液250ml，室温搅拌24小时。用盐酸将pH调节到3.0，用二氯甲烷分三次抽提，每次360ml。合并抽提液，用硫酸钠干燥。过滤后，真空减压浓缩至干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-COOH。
C)mPEG20k-O-(CH2)2-CO-NAC的合成将上步制备的mPEG20k-O-(CH2)2-COOH溶解到320ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出110ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol无水吡啶和3.0mmol亚硫酰氯，回流6小时后搅拌过夜。将反应液减压抽真空，浓缩后加入360ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入180ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.9(t，2H，-O-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例4、制备mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为氧原子；m为3；n为909)a)甲氧基聚乙二醇40000-甲磺酰酯(mPEG40K-O-SO2-CH3)的合成取40.0g的mPEG40k溶于500ml甲苯，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为350ml时停止加热，溶液冷却到室温。溶液中先后加入二氯甲烷40ml、无水三乙基氨1.5mmol和无水甲磺酰氯1.5mmol混合均匀，在氮气保护下，室温搅拌过夜，加入无水乙醇终止反应。混合溶液过滤，真空减压浓缩后加入600ml乙醚进行沉淀。产品过滤后真空浓缩至干，得到mPEG40K-O-SO2-CH3。
b)甲氧基聚乙二醇40000-丁酸叔丁酯(mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9)的合成取4-羟基丁酸叔丁酯1.86克溶解到80ml甲苯中，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为50ml时停止加热，溶液冷却到室温后倒入溶解0.25克氢化钠的20ml甲苯溶液中，混合均匀。溶液放置37℃水浴中搅拌5小时后，过滤，并冷却到室温。
将溶液与溶解有mPEG40K-O-SO2-CH3的200ml无水甲苯溶液进行混合，125℃下，搅拌反应25小时。反应液真空浓缩后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀过滤，得到mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9，真空保存。
c)甲氧基聚乙二醇40000-丁酸(mPEG40K-O-(CH2)3-COOH)的合成将上步所得到的mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9倒入320ml稀盐酸中搅拌过夜，溶液反应后用氢氧化钠调节pH值到3左右。用二氯甲烷进行抽提，每次300ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，过滤后减压浓缩至干，得到mPEG40K-O-(CH2)3-COOH。
d)mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC的合成将上步所制备得到的mPEG40K-O-(CH2)3-COOH解到700ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出250ml甲苯。向回流液中加入6.5mmol无水吡啶和6.5mmol亚硫酰氯，回流10小时后搅拌过夜。反应液真空浓缩后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀过滤后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入350ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ1.9(m，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.57(t，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例5、制备mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为氧原子；m为5；n为113)a)甲氧基聚乙二醇5000-甲磺酰酯(mPEG5K-O-SO2-CH3)的合成取5.0g的mPEG5k溶于80ml甲苯，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为50ml时停止加热，溶液冷却到室温。溶液中先后加入二氯甲烷20ml、无水三乙氨1.5mmol和无水甲磺酰氯1.5mmol混合均匀，在氮气保护下，室温搅拌过夜，加入无水乙醇终止反应。混合溶液过滤，真空减压浓缩后加入90ml冷乙醚进行沉淀。产品过滤后真空浓缩至干，得到mPEG5K-O-SO2-CH3。
b)甲氧基聚乙二醇5000-己酸叔丁酯(mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C4H9)的合成取6-羟基己酸叔丁酯2.1克溶解到80ml甲苯中，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为50ml时停止加热，溶液冷却到室温后倒入溶解0.25克氢化钠的20ml甲苯溶液中，混合均匀。溶液放置37℃水浴中搅拌5小时后，过滤，并冷却到室温。
将溶液与溶解上步所制备的化合物mPEG5K-O-SO2-CH3的80ml无水甲苯溶液进行混合，125度下，搅拌反应25小时。将反应液减压抽真空，浓缩后加入100ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C4H9。
c)甲氧基聚乙二醇5000-己酸(mPEG5K-O-(CH2)5-COOH)的合成将上步制备得到的mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C2H5倒入100ml稀盐酸中搅拌过夜，溶液反应后用氢氧化钠调节pH值到3左右。用二氯甲烷进行抽提，每次100ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，过滤后减压浓缩至干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-COOH。
d)甲氧基聚乙二醇5000-己酸-NAC(mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC)的合成将上步制备的mPEG5K-O-(CH2)5-COOH溶解到150ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出70ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空浓缩后加入120ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入50ml二氯甲烷溶解，先后加入0.33克NAC和0.3ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入45ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.24(m，5H，-OCH3，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ1.58(m，6H，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例6、制备mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为硫原子；m为2；n为227)a)甲氧基聚乙二醇10000-甲磺酰酯(mPEG10K-O-SO2-OCH3)的合成取10.0g的mPEG10k溶于150ml甲苯，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为90ml时停止加热，溶液冷却到室温。溶液中先后加入二氯甲烷25ml、无水三乙氨1.5mmol和无水甲磺酰氯1.5mmol混合均匀，在氮气保护下，室温搅拌过夜，加入无水乙醇终止反应。混合溶液过滤，真空减压浓缩后加入250ml冷乙醚进行沉淀。产品过滤后真空干燥保存，得到mPEG10K-O-SO2-OCH3。
b)甲氧基聚乙二醇10000-S-丙酸(mPEG10K-S-(CH2)2-COOH)的合成将上步制备的mPEG10K-O-SO2-OCH3溶解到40ml甲苯和60ml无水乙醇混合液中。将氢氧化钠0.13克溶于10ml无水乙醇中，随后加入到PEG溶液中。3-巯基丙酸乙酯3.0mmol加入到反应液中，氮气保护，60℃加热4小时，反应后冷却到室温。过滤除不溶性盐，减压浓缩后加入180ml冷乙醚沉淀。沉淀过滤后溶解到100ml去离子水中，用氢氧化钠调节pH至12，室温搅拌1小时，加入1N盐酸调节pH至3，溶液用二氯甲烷抽提3次，每次100ml。抽提液用硫酸钠/硫酸镁干燥，过滤。减压浓缩后，加入400ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥保存，得到mPEG10K-S-(CH2)2-COOH。
c)甲氧基聚乙二醇10000-S-丙酸-NAC(mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC)的合成将上步制备的mPEG10K-S-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出120ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空，浓缩至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入90ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG10K-S-(CH2)2-COOH。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例7、制备mPEG20K-NHCO-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-NHCO-；m为2；n为454)取20.0g的mPEG20k胺(SHEARWATER.CO)溶于180ml二氯甲烷中，加入丁二酰氯10.0mmol和1.4ml三乙胺，室温下搅拌2小时，反应液过滤，将滤液浓缩后用360ml乙酸乙酯沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入2.0克NAC和1.5ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干；随后，加150ml异丙醇，加热至溶液透明；最后，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到mPEG20K-NHCO-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.53(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CO-)，δ2.77(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例8、制备CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-NHCO2-；m为4；n为909)a)CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH的制备取40.0g的mPEG40k胺溶于350ml二氯甲烷中，加入2.58克三光气和1.41ml三乙胺，搅拌反应过夜。将反应液抽真空，浓缩后加入600ml冷乙醚沉淀。将所得沉淀溶解到80ml甲苯和120ml二氯甲烷的混合液中，加入5-羟基戊酸2.1克，滴加三乙胺1.45ml，室温搅拌过夜。反应液过滤，将滤液浓缩后溶解到150ml稀盐酸中，用NaOH调节pH至3.0，随后用二氯甲烷分三次抽提，每次150ml，合并抽提液，减压浓缩至干，得到CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH。
b)CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC的制备将上步制备的CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH溶解到650ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出200ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol无水吡啶和6.0mmol亚硫酰氯，回流10小时后搅拌过夜。反应液真空浓缩后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀过滤后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入360ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ3.98(t，2H，-NHCO2-CH2)，δ1.64(m，4H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例9、制备CH3O-PEG5K-OCO-(CH2)3-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-OCO-；m为3；n为113)取5.0g的mPEG5k溶于50ml二氯甲烷中，加入戊二酰氯2.0g，无水三乙氨1.62ml搅拌反应过夜。反应液减压浓缩后倒入100ml冷乙醚中沉淀。收集沉淀，溶解到50ml二氯甲烷中，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至于；随后，加50ml异丙醇，加热至溶液透明；最后，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH3O-PEG5K-OCO-(CH2)3-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-OCO-)，δ2.32(t，2H，-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.62(t，2H，-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.02(m，5H，-NHCOCH3；-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)。证明所得化合物正确。
实施例10、制备CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-CONH-；m为2；n为227)a)CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH的制备依据实施例3的方法，制备mPEG10K-丙酸，即CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH。
b)CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH的制备将上步制备的CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出120ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空，浓缩至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入3.0mmol 3-氨基丙酸和0.6mmol三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤，将滤液浓缩后倒入250ml乙酸乙酯中沉淀，收集沉淀，真空干燥保存，得到CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH。
C)CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC的制备将上步制备的CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出130ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空，浓缩至干后加入250ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入110ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室温搅拌过夜。加入90ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.49(t，2H，-CONH-CH2-CH2-CO-)，δ2.86(t，2H，-CONH-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例11、制备CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-COO-；m为5；n为454)a)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COOH的制备依据实施例3，制备mPEG20K-丙酸，即CH3O-PEG20K-(CH2)5-COOH。
b)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH的制备将上步制备的CH3O-PEG20K-(CH2)5-COOH溶解到360ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出140ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol无水吡啶和1.5mmol亚硫酰氯，回流4小时后搅拌过夜。将反应液抽真空浓缩至干，加入110ml二氯甲烷溶解，先后加入3.0mmol 6-羟基己酸和0.43ml三乙胺，室温搅拌2小时。反应液过滤，将滤液浓缩后倒入冷乙醚中。收集沉淀，晾干，得到CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH。
c)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC的制备将上步制备的CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH溶解到380ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出160ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol无水吡啶和3.0mmol亚硫酰氯，回流6小时后搅拌过夜。将反应液减压抽真空，浓缩后加入380ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入190ml二氯甲烷溶解，先后加入1.15克NAC和0.82ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入160ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.57(t，2H，-O-CH2-CH2-COO-)，δ3.98(t，2H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ1.58(m，6H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例12、制备CH3O-PEG40K-(CH2)2-O2CNH-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为甲基；R1、R2为氢原子；Y为-O2CNH-；m为2；n为909)取40.0g的mPEG40k溶于230ml二氯甲烷和110ml甲苯的混合液中，加入三光气2.65g，混合均匀，加入无水三乙氨1.35ml，搅拌反应过夜。将反应液减压抽真空，浓缩至干。将所得残渣溶解到200ml甲苯和160ml 1，4-二氧六环的混合液中，加入β-氨基丙酸5.0mmol，滴加三乙胺0.7ml，室温搅拌2小时。反应液过滤，将滤液浓缩后用600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干。
将沉淀溶解到600ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出190ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol无水吡啶和6.0mmol亚硫酰氯，回流10小时后搅拌过夜。反应液真空浓缩后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀过滤后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液减压浓缩后加350ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-O2CNH-)，δ2.86(t，2H，-O2CNH-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例13、制备HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为H；R1、R2为氢原子；Y为-S-；m为2；n为113)a)C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备参照实施例6制备mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的方法，以5克C6H5-CH2-O-PEG5K-OH和3.0mmol 3-巯基丙酸叔丁酯为主要原料制备C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC。
b)HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备将上步制备的C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解50ml二氧杂环乙烷中，加入2克10％的钯碳化物，通入氢气震荡过夜。溶液过滤，减压浓缩后加50ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例14、制备CH2＝CH-CO-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为CH2＝CH-CO；R1、R2为氢原子；Y为-S-；m为2；n为227)a)C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备参照实施例6制备mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的方法，以10克C6H5-CH2-O-PEG10K-OH为原料制备C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
b)HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备将上步制备的样品C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解50ml二氧杂环乙烷中，加入2克10％的钯碳化物，通入氢气震荡过夜。溶液过滤，减压浓缩后用200ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
c)CH2＝CH-CO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备将上步制备的样品HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解到45ml二氯甲烷中，先后加入三乙胺1.5mmol，丙烯酰氯1.5mmol，氮气保护下反应过夜。溶液过滤，减压浓缩后加95ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH2＝CH-CO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ5.81-6.45(m，3H，CH2＝CH-CO-)，δ4.21(s，2H，CH2＝CH-COO-CH2-CH2-O-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例15、制备CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为CH2＝CH-CH2；R1、R2为氢原子；Y为-S-；m为2；n为454)a)C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制备参照实施例6制备mPEG10K-S-(CH2)2-COOH的方法，以20克C6H5-CH2-O-PEG20K-OH为原料制备C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
b)HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制备将上步制备的样品C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解95ml二氧杂环乙烷中，加入2.5克10％的钯碳化物，通入氢气震荡过夜。溶液过滤，减压浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
c)CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制备将上步制备的样品HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到350ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出110ml甲苯。溶液中加入含有2.1mmol乙醇钠的乙醇溶液3ml，反应加热回流至蒸馏出约6ml溶液。反应液冷却到室温，加入烯丙基氯2.0mmol，氮气保护下反应过夜。溶液用稀酸调节pH至中性，溶液过滤，减压浓缩后溶解到100ml稀盐酸中，搅拌2小时。随后用二氯甲烷抽提三次，每次100ml。合并抽提液，用硫酸钠干燥。溶液过滤后，真空减压浓缩至干，得到CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
d)CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC的制备将上步制备的CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到360ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出120ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol无水吡啶和3.0mmol亚硫酰氯，回流6小时后搅拌过夜。将反应液减压抽真空，浓缩后加入360ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入165ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ5.13(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-O-)，δ5.24(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-CO-)，δ5.24(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-CO-)，δ3.95(dd，2H，CHaHb＝CHc-CH2-O-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例16、制备HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC(式II中R为H；R1、R2为氢原子；Y为-NHCO-；m为4；n为227)a)C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3的合成取10g的C6H5-CH2-O-PEG10K-OH溶于350ml氯仿中，氮气保护下，加热共沸蒸馏至剩余体积约为200ml时停止加热，溶液冷却到室温。溶液中先后加入无水三乙基氨1.5mmol和无水甲磺酰氯1.5mmol混合均匀，在氮气保护下，室温搅拌过夜，加入无水乙醇终止反应。混合溶液过滤，真空减压浓缩后加入300ml乙醚进行沉淀。沉淀过滤后，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3，真空干燥保存。
b)C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2的合成将上步制备的C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3用60ml蒸馏水溶解，随后倒入含有20克氯化铵的200ml浓氨水中，室温搅拌过夜。溶液用二氯甲烷提取三次，每次220ml。合并提取液用硫酸钠干燥，过滤。溶液减压浓缩后加入300ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2，真空干燥保存。
c)C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC的合成将上步制备的C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2溶于90ml二氯甲烷中，加入己二酰氯10.0mmol和1.4ml三乙胺，室温下搅拌2小时，反应液过滤，真空浓缩后用300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入2.0克NAC和1.5ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤、浓缩后用300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC，真空干燥保存。
d)HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC的合成将上步制备的样品C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC溶解110ml二氧杂环乙烷中，加入3.5克10％的钯碳化物，通入氢气震荡过夜。溶液过滤，减压浓缩后加150ml异丙醇，加热至溶液透明，溶液倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC。
产物1H MR(DMSO-d6)δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.19(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ1.78(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例17、制备(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R为(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2；R1、R2为氢原子；Y为-S-；m为2；n为454)a)C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制备参照实施例6制备mPEG10K-S-(CH2)2-COOH的方法，以20克C6H5-CH2-O-PEG20K-OH为原料制备C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
b)HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3的制备将上步制备的样品C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解100ml二氧杂环乙烷中，加入2.5克10％的钯碳化物，通入氢气震荡过夜。溶液过滤，减压浓缩后用冷乙醚沉淀，沉淀过滤后溶解到200ml的甲醇溶液中，滴加1ml浓硫酸后搅拌反应1.5小时。溶液用1N氢氧化钠调节pH到7左右，溶液过滤，减压浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3，真空干燥保存。
c)NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制备将上步制备的样品HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3溶解到150ml氯仿中，先后加入无水三乙基氨1.5mmol和无水甲磺酰氯1.5mmol混合均匀，在氮气保护下，室温搅拌过夜，加入无水乙醇终止反应。溶液过滤，真空减压浓缩后加入300ml乙醚进行沉淀。沉淀过滤后用150ml蒸馏水溶解，随后倒入含有25克氯化铵的250ml浓氨水中，室温搅拌过夜。溶液用二氯甲烷提取三次，每次200ml。合并提取液用硫酸钠干燥。溶液过滤，减压浓缩后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH，真空干燥保存。
d)(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH将上步制备的样品NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到100ml二氯甲烷中，先后加入无水三乙氨3.0mmol和碳酸二叔丁酯1.2mmol混合均匀，氮气保护下，室温反应过夜。溶液减压浓缩后溶解到200ml蒸馏水中，用盐酸调节pH至3左右。溶液用二氯甲烷抽提三次，每次200ml。合并提取液用硫酸钠干燥。溶液过滤，减压浓缩后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH，真空干燥保存。
e)(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC将上步制备的样品(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到400ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出160ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol无水吡啶和3.0mmol亚硫酰氯，回流6小时后搅拌过夜。将反应液减压抽真空，浓缩后加入400ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入200ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干，得到(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC。
产物1H NMR(DMSO-d6)δ1.36(s，9H，(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-)，δ3.5(brm，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。证明所得化合物正确。
实施例18、制备式III中(n1为113、n2为454，m1为0、m2为5)的化合物，即 取20.0克按照实施例5方法合成的mPEG20k-(CH2)5-CO-NAC溶解到含有10mmol赖氨酸的80ml水溶液中，向内加入0.25mol pH11.6的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液20ml，室温反应1小时。溶液用1N盐酸调节pH到3.0，随后用二氯甲烷抽提三次，每次100ml。合并提取液，先后用30ml 1N盐酸、30ml蒸馏水反抽提，溶液用硫酸钠干燥。溶液过滤、减压浓缩后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀、真空干燥保存。
将沉淀溶于180ml二氯甲烷中，先后加入6克按照实施例1合成的mPEG5k-CO-NAC，0.25ml三乙胺混合均匀，室温反应过夜。溶液中加入过量乙胺终止反应，减压浓缩后用少量蒸馏水溶解。产物用Sephadex-200分子筛层析(φ2.6cm×100cm)，缓冲液为20mmol/L pH7.0磷酸钠(含有200mmol/L NaCl)，收集双链PEG水溶液30ml。
用盐酸调节双链PEG水溶液pH至3.0，溶液用二氯甲烷提取三次，每次100ml。合并提取液用硫酸钠干燥。溶液过滤，减压浓缩后加入300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀溶解到400ml甲苯中，氮气保护下，蒸馏出100ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol无水吡啶和6.0mmol亚硫酰氯，回流10小时后搅拌过夜。反应液真空浓缩后加入500ml冷乙醚沉淀，沉淀过滤后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室温搅拌过夜。反应液过滤后，将滤液浓缩至干。加入290ml异丙醇，加热至溶液透明，倒入烧杯中搅拌冷却析晶。滤出晶体，用异丙醇洗涤两遍，凉干。产物用水溶解后，经高效液项色谱-质谱(液质联机)分析，分子量25kD占95％以上。
实施例19、mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC修饰干扰素α-2a。
取3ml(1.2mg)干扰素加入6.0mg实施例3所制备得到的mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC混匀，加入0.75ml硼酸钠(pH9.2)启动反应，4℃反应2小时。加入2M甘氨酸0.1ml，室温作用10分钟后加入0.5ml 1M乙酸钠(pH5.0)。反应后样品进行透析，透析液为20mM pH5.0乙酸钠。透析后样品直接上Sepharose-CM，流速为1.5ml/min。淋洗后分别用100mM NaCl、200mM NaCl、400mM NaCl的20mM乙酸钠pH4.5溶液洗脱。
收集修饰、纯化后的样品用SDS-PAGE进行分析，结果如图1所示，图1中道M为蛋白质标准品，道1为修饰后样品，道2为离子交换后淋洗液，道3、4为100mM洗脱样品，道5为200mM洗脱样品，道6、7为400mM洗脱样品。其中单PEG干扰素表观分子量约为60kd，而干扰素分子量为15kd。结果表明，PEG-NAC可以在比较温和的条件下进行干扰素的修饰，而且产物稳定，易于分离纯化。
实施例20、mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC修饰牛血红蛋白。
按照实施例3的过程制备mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC。
取3ml(60mg)血红蛋白加入70mg mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC混匀，加入0.75ml硼酸钠(pH9.0)启动反应，10℃反应2小时。加入1M甘氨酸0.2ml，室温作用10分钟终止反应。反应后样品用5kD膜进行超滤，收集超滤后的样品进行SDS-PAGE电泳，电泳图如图2所示，图中道1为血红蛋白，道2为修饰后血红蛋白，道3为蛋白质标准品。其中，血红蛋白亚基的分子量约15kD，PEG单修饰血红蛋白亚基表观分子量约为26kD。结果表明，PEG-NAC可以在比较温和的条件下进行血红蛋白的修饰。
权利要求
1.具有式I结构的N-乙酰基半胱氨酸衍生物， (式I)其中，POLY为分子量范围在1000Da～500,000Da之间的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述N-乙酰基半胱氨酸衍生物结构式为式II， (式II)其中，n为25-4000之间的正整数；R为氢、碳原子数为1-10的烷基、苄基、CH2＝CH2-CH2-、CH2＝CH-CO-、或(CH3)3-O-CONH-CH2-CH2-；Y为-O-、-S-、-NHCO-、-CONH-、-COO-、-OCO-、-NHCO2-、或-O2CNH-；R1为H或甲基；R2为H或甲基；m为0-5之间的正整数。
3.根据权利要求2所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述n为113-1500之间的正整数。
4.根据权利要求3所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述R1为H；R2为H。
5.根据权利要求4所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述R为甲基。
6.根据权利要求5所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述Y为-O-。
7.根据权利要求2-6任一所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述m为1-5之间的正整数。
8.根据权利要求7所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述m为2。
9.根据权利要求1所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述N-乙酰基半胱氨酸衍生物结构式为式III， (式III)其中，n1、n2分别为25-4000之间的正整数，优选为113-1500的正整数；m1、m2分别为0-5的正整数，优选为1-5之间的正整数，更优选为2。
10.权利要求1-9任一所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物在修饰蛋白质和多肽上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种N－乙酰基半胱氨酸衍生物与应用。本发明所提供的N－乙酰基半胱氨酸衍生物，具有式I结构，其中，POLY为分子量范围在1000Da～500,000Da之间的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。本发明化合物主要修饰蛋白质或多肽中的氨基，具有较高的选择性、专一性和修饰反应活性，反应后生成的N－乙酰基半胱氨酸没有毒副作用，修饰过程操作简便，修饰后产物稳定，可以广泛用于蛋白质、多肽类等药物的修饰。
文档编号C08G65/00GK1837191SQ20051005645
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月23日 优先权日2005年3月23日
发明者于勇海 申请人:于勇海