专利名称：用于转染目的的线性聚乙烯亚胺(pei)的制造方法和用此方法得到的线性pei的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于转染用途的线性聚乙烯亚胺(PEI)的制造和质量控制。
本发明还涉及由此制造方法得到的产品，更具体地说，用于活体应用，其包括但不限于基于核酸的治疗。
该申请是涉及并要求较早的美国临时申请US 60/952993的优先权的非临时申请。
背景技术：
聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有高阳离子电荷密度潜能的有机大分子。PEI的每隔三个原子为可质子化的氨基氮。PEI能够诱捕DNA，并且，由于许多连接体氨基的接近的位置，PEI在几乎任何pH值下保留了大的缓冲能力。
单独的PEI是体外和体内输送DNA质粒的高效载体。
PEI把DNA紧压成能够与阴离子蛋白多糖在细胞表面相互作用的带正电的颗粒，并促进该颗粒通过内吞作用的进入。带正电的颗粒在细胞表面上粘附在阴离子细胞表面的蛋白多糖上，之后被自发吞噬(Boussif等人，1995)。一旦进入细胞，PEI还具有充当“质子海绵”的独特性能，这缓冲了内体的pH值并防止DNA降解。质子持续涌入还导致内体渗透肿胀和破裂，它为DNA颗粒到细胞质提供了逃逸机制(Boussif等人，1995；Behr，1997)。
总之，PEI基输送系统模仿病毒的一些关键特性，如DNA的凝聚/保护和内体逃逸。
存在几种制造PEI的方法。
这实际上是因为这样的聚合物多年来已被用于多种工业领域的事实。
但是，当用作转染目的时，这样的PEI的效率往往不好，即小于10％的生产的产品成功地转移进细胞。
特别是高分子量的PEI(即＞10,000Da)的效率低。
此外，一旦此类产品将应用于医疗领域，更特别是具有诸如GMP标准的高制造标准的基因疗法，则需要出色的效率和质量。
发明内容
本发明旨在解决这个问题，并得到在大分子量和低多分散性情况下的出色的效率(≥55％)。
为此目的，本发明的一个目标是提供合成和制备线性聚乙烯亚胺(PEI)的改进方法，其使得可以得到比已知的更好的转染效率和可靠性，同时具有更高的质量。
在一个优选的实施方案中，质量是GMP(Good Manufacturing Product)的标准之一。
更确切地说，本发明提出一种合成和制备用作转染载体的线性聚乙烯亚胺(PEI)的方法，其包含以下步骤由确定量的纯度高于99％的2-乙基-2-噁唑啉单体开始，彻底干燥所述量的单体，并使所述量的单体聚合以获得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)，其通过以下步骤进行 -彻底干燥预定量的乙腈以后，将所述的乙腈用作所述量的干燥单体的溶剂，同时添加预定量的彻底干燥的聚合反应引发剂，并将它们混合在一起， -通过蒸发去除所述溶剂来纯化所述的得到的PEOX，同时用甲醇和二乙醚来进行至少三次相继的洗涤/沉淀步骤以及相应的过滤，安排所述的干燥、聚合和纯化操作以获得(i)通过进行1HNMR测试，正确识别所述的PEOX聚合物，在＜1.0％的水平上确认没有单体且在＜5.0％的水平上确认没有溶剂，以及(ii)通过进行凝胶渗透色谱，分子量(Mw)的平均值＞23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)＜1.5， -用盐酸水解所述PEOX以充分有效地得到所述的PEI，通过进行1HNMR测试，该PEI具有＜5％的剩余侧链或丙酸的量，并确认PEI为单峰。
对于彻底干燥特定量的单体、乙腈或引发剂，人们应该理解为，在使用前，湿度降低到低于10ppm的水，这可以通过用氢化钙干燥48小时以上，然后通过在129℃以上的温度蒸馏并收集单体而得到。
本发明还提出有利的实施方案，其包括但不限于一个和/或多个下列特征 -PEOX的分子量(Mw)的平均值为40,000Da＜Mw＜54,000Da； -单体/引发剂之比为大约500。“大约”应理解为±5％； -单体/引发剂之比为480； -单体纯度高于99.95％； -引发剂在加入单体之前与乙腈混合； -聚合在高于85℃的温度下进行20小时以上； -聚合温度高于或等于105℃； -第一次过滤之后，残余物用溶剂如MeOH大量地洗涤，加入二乙醚之后，聚(2-乙基-2-噁唑啉)自然地以油状从溶液中分离，倒出全部溶剂，将所述的洗涤和分离重复至少四次，然后在真空中干燥； -水解步骤包括从反应混合物中通过共沸蒸馏去除得到的释放的丙酸，这定期地进行并持续至少一天，同时用1HNMR谱监测反应过程； -将在反应过程结束时得到的残余物在水中稀释并蒸发至少三次来去除痕量丙酸，然后，将该残余物再次溶解在水中并过滤，然后冷冻干燥； -过滤是通过网孔尺寸介于0.20微米和0.25微米之间的无菌膜，特别是无菌醋酸纤维素膜进行的。
然而，这样的过滤不是无菌的，因此不涉及额外费用，而这与本领域技术人员的普遍看法相反，在他们看来，过滤的无菌性将是必要的。
无菌过滤应该理解为去除所有的活性细菌和活性元素，至少低于根据现行USP确定的值。
本发明还提出了用上面描述的方法得到的线性PEI。
有利地，本发明提出了特征在于中间体PEOX具有40,000＜Mw＜54,000Da的分子量Mw的线性PEI。
在另一有利的实施方案中，PEOX的分子量Mw为25,000Da左右。“左右”应理解为±1800Da。
通过阅读下面的以非限制性实例的方式给出且参照附图的对具体实施方案的说明，本发明将得到更好的理解，其中 图1显示了根据本发明的第一个实施方案(GMP)的制造线性PEI的方法的示意图。
图2显示了根据本发明的第二个实施方案的方法的步骤图。
图3至10显示了根据本发明的实施方案的方法获得的结果的不同曲线。
具体实施例方式 在根据本发明的方法的第一个实施方案(具有GMP质量)中，在由作为强亲电试剂的对甲苯磺酸甲酯引发聚合后，由2-乙基-2-噁唑啉(单体)的阳离子开环聚合得到聚(2-乙基-2-噁唑啉)。
噁唑啉环形成(见此后的开环聚合的增长步骤)，然后被下一个单体攻击。
这样得到了活性聚合物，并且该聚合通过加入水和碳酸钠而终止。
噁唑啉环 活性的聚合物 聚合度受单体/引发剂之比和合成的产率控制。
从单体/引发剂之比，可以计算出理论数均分子量(Mn)。高度控制的聚合提供了具有接近理论Mn的确定的Mn并具有低的多分散指数的聚合物。
当期望PEOX的分子量从1,000到10,000Da时，经典的聚合产率在55至95％的范围内(Hoogenboom等人，2003)。产率向着更高的分子量下降。对于Mn＜10,000Da的低分子量的确定，可以通过使用1H-NMR谱或MALDI-TOF质谱来实现。
对于PEOX的＞10,000Da的更高分子量，目前使用凝胶渗透色谱(GPC)并且是唯一有效的方法。
本发明的流程涉及用高度受控聚合来生产高分子量(10,000Da以上)的线性聚乙烯亚胺的过程的描述。以大约500的单体/引发剂之比开始聚合，获得高于90％的产率，使得能够制造高分子量线性PEI，其具有如GPC测定和低的确定的多分散性指数所示的窄分子量分布。
当起始原料(单体、引发剂)和溶剂(乙腈)的质量被极好地界定和控制时，完全获得高度受控的聚合。
试剂来自美国公司Aldrich，并按以下规格获得 -2-乙基-2-噁唑啉，索引13，745-6，纯度规格＞99％，由气相色谱分析确定的纯度99.5-99.7％，没有关于含水量的规格； -对甲苯磺酸甲酯，索引158992，纯度规格＞98％，由气相色谱分析确定的纯度99.9％。
乙腈来自意大利公司Carlo Erba，索引0063716，HPLC级，纯度规格99.9％且含水量＜0.03％。
发现影响聚合产率的最关键的参数之一是在引发和增长步骤期间的水的存在。
为此，将使用的容器仔细地干燥并且在开始合成前储存在氩气中。
也比较了两个起始单体和乙腈的蒸馏要求，因为我们怀疑痕量水的存在能够降低聚合产率(见表1)。
单体和乙腈在使用之前用氢化钙干燥再在氩气中蒸馏提纯。
乙腈在使用之前蒸馏提纯。
结果清楚地表明，为获得PEOX＞90％的产率，2-乙基-2-噁唑啉和乙腈的蒸馏都是需要的。
此外，显示出了高程度的重复性。在这些条件下并且使用500的单体对引发剂之比，PEOX聚合物具有同一范围内的分子，51.862+/-1.644，且平均Mw/Mn为1.15+/-0.03。
未蒸馏的试剂或溶剂的使用产生不一致的分子量。
表12-乙基-2-噁唑啉的聚合(单体/引发剂之比为500) Mw和Mw/Mn(多分散性指数)通过凝胶渗透色谱法得到。
线性PEI(GMP)的分析的凭证在此后的表2中举例给出。
产品线性聚乙烯亚胺 分子式(纯的)(C2H5N)nx(HCl)m 表2
cfu菌落形成单位；RLU相对光单位；EU内毒素单位；NMT不超过 转染测定 转染前一天，在1毫升完全MEM培养基(具有Earle盐的Eagle MEM培养基，补充有10％胎牛血清、碳酸氢钠、2mM glutamaxTM、200单位/毫升青霉素和200毫克/毫升链霉素)中的24孔组织培养板的每孔中加入5×104HeLa细胞(ATCC CCL-2)。转染当天，制备体内线性PEI pCMV-Luc配合物。对于一个孔，将1微克的DNA(pCMVLuc质粒，1毫克/毫升，编码荧光素酶基因)加入微量管(1.5毫升)中的50微升的150mM NaCl中，再用Vortex混合。将体内线性PEI样本或阳性对照添加到50微升的150mMNaCl中(条件见表)，再将该溶液用Vortex混合。将体内线性PEI样本(用水预稀释为7.5mM)或线性PEI阳性对照(7.5mM)或50微升的150mM NaCl溶液(条件只有DNA)一起添加到DNA溶液中，再用Vortex混合10秒。将该溶液(100微升)在添加到孔中之前在室温下培养30分钟。经过轻轻地旋动均化之后，将培养板在37℃下在包含5％CO2的加湿的空气气氛中培养24小时。
转染一天后，进行荧光素酶测定。去除细胞培养物并且每个孔用1毫升的PBS清洗。去除PBS以后，添加100微升的溶胞缓冲液(荧光素酶细胞培养物溶胞缓冲液(5X)，Promega)，并且将该培养板在室温下培养30分钟。将该溶解产物收集在1.5毫升的微型管中，并以14000转/分离心5分钟。向用于光度计(LB 960 CENTRO，Berthold Technologies)的96孔培养板的每个孔添加2微升的上层清液并且测量自动添加50微升的荧光素底物(Promega)之后1秒钟内积分的发光(RLU，相对光单位)。结果表示为RLU/孔。然后计算RLU/孔的平均值(n＝6)±SD。
现在结合图1更具体地描述该方法。
从原料1(单体和其他溶剂和试剂)开始，在2中适当处理，提供聚合步骤3以获得中间体产物PEOX 4，它在5中被适当识别，并在步骤6中确定其量。
然后，提供酸性水解7以获得线性PEI 8，其在9中适当识别并测试用于转染的样本(转染测定10)。
在进行最后的冷冻干燥步骤18之前和/或同时，提供下面有关外观11、引燃残留物12、重金属的存在13、残余有机化合物的存在14、杂质概况15、内毒素测定16以及最后的微生物量(bioburden)(用于确定微生物限量的测定＝以cfu/g为单位的微生物量)17的测试。
因此在最后的填充步骤20之前，得到冷冻干燥形式的最终产物19。
简言之，最后的填充步骤通过体内线性PEI本体溶液的制备开始。将本体粉末称重并溶解于水以获得150mM氮的最终浓度。该溶液用磁力搅拌器以200转/分的混合速度混合大约1小时，然后在2-8℃下放置24小时。该溶液在A级条件的房间中过滤。为进行过滤，使用一次性的无菌硅管和内联入无菌专用玻璃容器中的2x Sartobran P过滤器(0.45微米/0.22微米)。测试了第一过滤器的完整性之后，PEI溶液通过该过滤器慢慢地过滤到无菌玻璃容器中。在这一步，取样本做微生物量测试。过滤后，在层流空气流中填入DIN 2R瓶并且插入橡胶瓶塞。再在瓶上盖上13毫米铝密封。封盖过程完成之后，将瓶储存在-20℃下。取样本并检查重大缺陷。
取其他(随机的)样本进行内毒素和无菌测定。这些瓶在零下20℃储存直至装运。
在第二个实施方案中，体内线性PEI的制造和控制分四个主要步骤进行(见图2) 1)噁唑啉聚合成聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)； 2)PEOX的提纯； 3)将PEOX转化为聚乙烯亚胺(线性PEI)； 4)和线性PEI的提纯。
更确切地说，制造和控制步骤在此后参照图2说明。
从非常纯的单体开始。
步骤1该方法从21开始。首先提供聚合步骤1(22)
2-乙基-2-噁唑啉 聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX) 步骤2涉及聚(2-乙基-2-噁唑啉)在乙腈中的提纯(23)。
在所述的提纯期间，进行以下步骤 -用乙醚使聚合物材料沉淀(24)以去除单体； -用甲醇和乙醚进行三轮洗涤(25)； -蒸发(26)以去除溶剂； -通过过程(In-Process)质量控制来进行控制(27)即，用1H-NMR来识别聚合物，用1H-NMR来确认缺少单体，用1H-NMR来确认没有溶剂＜1.0％。
然后得到提纯的聚(噁唑啉)(PEOX)沉淀。
步骤3-4将PEOX转化(28)为线性PEI和聚合物的提纯(29)。
为了更确切地得到提纯的聚(噁唑啉)(PEOX)沉淀，提供了以下步骤。
-在30中，加入37％的HCl和水； -在31中，CH3-CH2-COOH与水共沸蒸馏； -在32中，加入盐酸以得到CH3-CH2-COOH。
在这个阶段，在33中得到具有HCl的纯化线性聚乙烯亚胺的水溶液中。
然后提供下面的步骤。
-在34中，蒸发水以去除过多的HCl，这能够得到溶解于无菌水中的线性PEI，HCl(35)，然后 -在36中，冷冻干燥以提供线性PEI，HCl粉末。
然后，在38中过滤之前，在37中使PEI再潮湿以获得含水的体内线性PEI(150mM氮)。
然后进行最终本体的体内线性PEI质量测试(39和40)，即，在输送PEI以用于转染之前 -1H-NMR识别和体内线性PEI的纯度； -1H-NMR残余侧链或丙酸； -体内线性PEI的凝胶渗透多分散性； -HeLa细胞的转染-生物活性； -内毒素水平。
现在进一步详细说明上面描述的体内线性PEI的制造。
在第一步22中，从乙腈中的两种起始原料2-乙基-2-噁唑啉和对甲苯磺酸甲酯开始，通过阳离子聚合得到聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)。
第二步23从在甲醇等效物(就其洗涤聚合物的能力而言)(即在该例中为氯仿和乙醚)中多次洗涤25开始，使聚合物PEOX沉淀，并去除单体、溶剂和未反应试剂。
对这一中间体化合物完成过程质量测试27。
这些测试(过程测试，见表3)为用核磁共振(NMR)来识别PEOX聚合物，用NMR来确认没有单体，以及用NMR来确认溶剂水平＜1.0％(流程CQ-1001)。
凝胶渗透测定(CQ-1002)确保PEOX的多分散性并确定平均分子量。
第三步28是用37％的盐酸在水中进行酸性水解30使丙酸酯侧链裂解，从而将PEOX转化成线性PEI。
线性PEI的提纯是通过在水中共沸蒸馏31去除丙酸而实现的。在水和过量的盐酸蒸发34之后，将线性PEI再悬浮在150mM胺的无菌水(步骤37)中，在38中通过0.22微米纤维素膜过滤到本体容器中。
体内线性PEI的识别和纯度通过测试39、40，主要是NMR测试(见表3的CQ-1003)确定的。
这些测试也确保侧链的完全去除并检测任何残留丙酸。
然后，用转染测定(CQ-1004)测量体内线性PEI的生物活性。
最后，用内毒素测定(CQ-1005)测量内毒素水平。
根据本发明的实施方案在此更详细地进行了描述，在整个体内线性PEI的生产过程中遵循批量生产流程。
连同操作人员姓名和日期记录了仪器、组成、条件和流程等，而过程中和最终本体产品测试是由合格的技术人员按照书面流程执行的(在此仍见表3)。所有的测试都有记录结果的规范。
表3.过程中和最后的本体化验
**RLU＝相对光单位 然后为每批产品准备带有规范和测试结果的分析证书，如之前在本发明的第一个实施方案中指出的，记住在每批体内线性PEI委托装运给客户之前，质量保证人对审查和批准批量生产记录和分析证书负责。
反应方案
在提供的不同的例子中，使用下列初始原料和试剂来进行这样的操作。
2-乙基-2-噁唑啉，≥99％ 单体应该非常纯，即具有纯度≥99％。这里它也可以从美国公司Aldrich获得，例如通过蒸馏改善到99.98％的纯度(见图3和4)。
对甲苯磺酸甲酯具有高纯度，即98％。
引发剂，例如优选地为对甲苯磺酸甲酯，这里也具有高纯度，即≥95％，例如98％。
酸有利地是盐酸，例如，这里也可以是从意大利公司Fluka购买的酸度为37％的酸。
其他 乙腈为HPLC级，溶剂甲醇和乙醚为Ph.Eur.级。加工助剂氢化钙和碳酸钠从Fluka购买。
更确切地说，在当前的实施例中，合成聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)的第一步为如下 反应
合成 聚(2-乙基-2-噁唑啉)是用对甲苯磺酸甲酯作为聚合引发剂从2-乙基-2-噁唑啉开始合成的。反应在氩气下在火焰干燥的反应烧瓶中进行。将乙腈用作溶剂，反应温度为85℃。
在85℃经过24小时之后，将反应混合物冷却到室温并用水骤冷并添加碳酸钠。由此产生的悬浮液在85℃再加热24小时，冷却到室温后过滤(Duran D2烧结玻璃)以去除固体，用甲醇洗涤滤饼并蒸发溶剂。
将残余物溶解于甲醇并再次过滤(玻璃纤维，Whatman B)。将溶剂用油泵蒸发。再次将残余物溶解于甲醇，然后通过加入二乙醚来沉淀。随后去除溶剂(油泵真空)。进行第二次沉淀，然后将PEOX干燥至恒重。
1H-NMR谱必须显示少于5％的溶剂和少于1％的噁唑啉单体。
现在将描述PEOX和PEI的实施例，一个(批次N°1和3)不包含本发明的所有步骤(即，不包含乙腈蒸馏)，其具有不令人满意的结果，一个(批次2和4)包含本发明的所有步骤，其具有令人满意的结果。
实施的PEOX制备的概述(表4) 成果和分析结果 批次N°1 遵循上述程序的合成和后处理。
产率40.95克(81.9％)(即，太低) 1H-NMR谱检测到已知杂质(质子化形式，1.78ppm)以及二乙醚的信号。除了这些信号，还检测到具有3.72ppm处的信号的少量未知杂质(图5)。
GPC(表5) 由500个单体组成的体内线性PEI的期望摩尔质量为49,581克/摩尔。平均Mw是用下列设备通过凝胶渗透色谱确定的泵Shimadzu LC-10AD(0.5毫升/分)、自动注射器WISP(Waters)、1个保护柱(Shodex OH-pak K3-G，6.0×50毫米)，随后是3个柱Shodex OH-pak，8.0×300毫米(1个柱803HQ，1个柱804HQ，1个柱806HQ)，串连，折射率检测器，差分检测器Waters R410，以及多角度光散射检测器DAWN F，Wyatt Techn。用于走样本的溶剂为具有0.1M的NaNO3和NaN3的双蒸馏水。将干燥的PEOX以4-6克/升溶解在GPC溶剂中，并在室温下搅拌4小时。注射之前，样本经过0.22微米Dynagard过滤器的过滤。将100微升4-6克/升的PEOX自动注入保护柱，以0.5毫升/分的流速进行GPC。GPC的监测是由通过90°光散射信号和RI信号(dn/dc)执行的。通过结合散射信号和RI数据，聚合物的绝对摩尔质量通过软件(使用软件ASTRA)计算。
批次N°2 遵循上述程序进行合成和后处理。
产率43.71克(87.2％)(即，好) 1H-NMR谱除了PEOX，这个谱显示了溶剂二乙醚和乙腈。另外发现了未知杂质(3.72ppm)(图6)。
GPC(表6) 由500个单体组成的体内线性PEI的期望摩尔质量是49,581克/摩尔。
第二步骤包括进行聚乙烯亚胺的合成(体内线性PEI) 反应
合成 对于体内线性PEI的合成，以上PEOX中间体的侧链通过酰胺键在水中用盐酸的水解去除。将混合物在120℃搅拌。
一天后，反应完成。反应的进展用1H-NMR谱监测。
必须有不超过5％的侧链未被裂解。
盐酸通过蒸发去除。将残余物溶解于水/盐酸并蒸发两次以去除痕量的丙酸。
然后，将残余物溶于水，并通过玻璃纤维过滤器(Whatman B)和0.22微米无菌醋酸纤维素膜过滤。将该无色溶液冻干。
NMR分析必须显示出聚合物、少量的剩余侧链和小于5％的残余丙酸的识别。
实施的体内线性PEI制备的概述 表7 批次N°3是批次N°1水解后得到的。
批次N°4是批次N°2水解后得到的。
成果和分析结果 批次N°3 遵循上述程序的合成和后处理。
产率27.61克(87.7％) 1H-NMR谱该谱图显示出体内线性PEI的单峰(图9)。
批次N°4 遵循上述程序的合成和后处理。
产率29.43克(87.4％) 1H-NMR谱该谱图显示出体内线性PEI的单峰(图10)。
结论 合成了两批线性PEI。第二批次的1H-NMR谱纯度以及产品产率是可重复的和令人满意的，相比之下，第一批次因未使用本发明的某些步骤而不令人满意。
PEOX的平均摩尔质量通过GPC确定。该规范已经证明是非常敏感的。批次N°1中链长度未达到预期值(表5，图7)。
根据表8至14及相应的图3至10，现提供下面的结果。
1.)购买的单体2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC(见表8和图3)。
2.)蒸馏的单体2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC(见表9和图4)。
3.)批次N°1的1H-NMR谱(见图5)。
4.)批次N°2的1H-NMR谱(见图6)。
5.)批次N°1的GPC(见图7和表11)。
6.)批次N°2的GPC(见图8和表12)。
7.)批次N°3的1H-NMR谱(见图9)。
8.)批次N°4的1H-NMR谱(见图10)。
1.)购买的单体2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC 表8 更确切地说，图3清楚地显示，高度(PA)在Oy方向而时间(分钟)在Ox方向，在40℃的温度下，GC气相色谱观察到的不同的峰，即提纯之前第二个实施方案中描述的本发明方法所用的单体的峰1(41)、峰2(42)、2-乙基-2-噁唑啉的峰43、峰3(44)和峰4(45)。
2.)蒸馏的单体2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC。
图4和表9显示了蒸馏的单体的GC(正好在步骤22之前)。蒸馏这一具体步骤显示，与市售的原料纯度相比，单体的纯度增加了(表8和图3)。
只剩三个峰，即峰1(46)、峰2(47)和2-乙基-2-噁唑啉的峰(48)。
表9 3，4.)批次1和2的1H-NMR谱 回顾表10(表5和6的组合)
图5和6分别显示了批次N°1的PEOX的1H-NMR谱和N°2的PEOX的1H-NMR谱。
更具体地说，得到的峰50至53和峰55至58意味着确认PEOX[1.0-1.3ppm(3H，CH2-CH3)，2.0-2.5ppm(2H，CH2-CH3)，3.4-3.5ppm(4H，CH2-CH2-N)]。峰49和54代表溶剂(CDCl3)。
5.)批次N°1的GPC(凝胶渗透色谱) 表11和图7 光散射仪miniDAWN 单元型号(cell type)K5 激光波长690.0纳米 校准常数5.8800e-6l/(Vcm) RI仪Optilab DSP 紫外线仪n/a 溶剂水 折射率1.330 流速0.500毫升/分钟 质量结果拟合无(拟合程度n/a) 半径结果拟合无(拟合程度n/a) 峰1 峰的界限(mL)21.513.13.180 dn/de(mL/g) 0.162 A2(mol mL/g2) 0.000 UV ext.(mL/g cm)0.000 模型21mm 拟合程度1 注入质量(g) 4.6732e-4 计算质量(g) 4.3112e-4 峰1 多分散性 Mw/Mn1.260(16％) Mz/Mn2.270(56％) 摩尔质量矩(moment)(克/摩尔) Mn2.641e+4(16％) Mp3.516e+4(0.9％) Mw3.580e+4(9％) 曲线60(来自多角度光散射检测器MALS的原始数据)和61(来自折射率检测器RI的原始数据)明显地不同，显示出不令人满意的较大的多分散性结果(该曲线的单位，Ox方向为体积(毫升)而OY方向为信号强度的相对大小)。
6.)批次N°2的GPC 表12和图8。
光散射仪miniDAWN 单元型号K5 激光波长690.0纳米 校准常数5.8800e-6l/(Vcm) RI仪Optilab DSP 紫外线仪n/a 溶剂水 折射率1.390 流速0.900毫升/分钟 质量结果拟合无(拟合程度n/a) 半径结果拟合无(拟合程度n/a)峰1 峰的界限(mL) 21.891.28.904 dn/de(mL/g) 0.162 A2(mol mL/g2)0.000 UV ext.(mL/g cm) 0.000 模型 21mm 拟合程度 1 注入质量(g) 6.7440e-4 计算质量(g)6.1415e-4 峰1 多分散性 Mw/Mn 1.160(16％) Mz/Mn 1.331(22％) 摩尔质量矩(克/摩尔) Mn8.721e+4(16％) Mp4.621e+4(0.9％) Mw4.317e+4(9％) Mz4.951e+4(18％) 这里，曲线62(来自MALS检测器的原始数据)和63(来自RI检测器的原始数据)几乎相符，这对于本发明是可接受的。
7，8)最后，将分别由批次N°1和2的PEOX得到的批次N°3和N°4的PEI的1H-NMR谱复制在图9和图10上，它们分别显示了峰64(4.72ppm，D2O)和65(3.46ppm，CH2-CH2-NH，来自PEI)，和66(4.71ppm，D2O)，67(3.47ppm，CH2-CH2-NH，来自PEI)。
最后，下面提供表13 此表显示，PEOX的质量Mw取决于引发剂/单体的最初比例。
*注在这个实施例中，最终的PEI具有＞10,000Da的质量，并且更确切地说，在15,000Da左右(即，34,180/99×43＝14,846Da)。
PEOX生产的高性能(＞85％)使得能通过本发明方法生产具有接近理论值的质量的聚合物，并具有＜1.5的低的多分散性。
对于本领域的技术人员，其它优点和改进是显而易见的。因此，在更广泛的方面，本发明不仅限于在此显示和描述的具体细节、代表性的设备和列举的例子。
特别地，它涵盖了用上面描述的方法获得的线性PEI。
参考文献 -Behr，J.1997.The proton sponge.A trick to enter cells thevirus did not explain.CHIMIA 5134-36。
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-Nucleic acid containing composition，preparation and uses ofsame-US patent 6,013,240-J-P Behr et al. 现在描述以下的根据本发明的方法的第三个实施方案。
这种制造体内线性PEI的方式以两步合成进行。
从单体(2-乙基-2-噁唑啉)聚合为聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)的第一步，和从所述的PEOX获得线性PEI的第二步。
权利要求
1.一种合成和制备用作转染载体的线性聚乙烯亚胺(PEI)的方法，其包含以下步骤由确定量的纯度高于99％的2-乙基-2-噁唑啉单体开始，彻底干燥所述量的单体，并使所述量的单体聚合以获得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)，其通过以下步骤进行
-彻底干燥预定量的乙腈以后，将所述的乙腈用作所述量的干燥单体的溶剂，同时添加预定量的彻底干燥的聚合反应引发剂，并将它们混合在一起，
-通过蒸发去除所述溶剂来纯化所述的得到的PEOX，同时用甲醇和二乙醚来进行至少三次相继的洗涤/沉淀步骤以及相应的过滤，
安排所述的干燥、聚合和纯化操作以获得(i)通过进行1H-NMR测试，正确识别所述的PEOX聚合物，在＜1.0％的水平上确认没有单体且在＜5.0％的水平上确认没有溶剂，以及(ii)通过进行凝胶渗透色谱，分子量(Mw)的平均值＞23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)＜1.5，
-用盐酸水解所述PEOX以充分有效地得到所述的PEI，通过进行1H-NMR测试，该PEI具有＜5％的剩余侧链或丙酸的量，并确认PEI为单峰。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，中间体PEOX的分子量(Mw)的平均值为40,000Da＜Mw＜54,000Da。
3.根据以上权利要求任意之一的方法，其特征在于，单体/引发剂之比为大约500。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，单体/引发剂之比为480。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，单体纯度高于99.95％。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，在加入到单体之前，将引发剂与乙腈混合。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，该聚合在高于85℃的温度下进行20小时以上。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，聚合温度高于105℃。
9.根据以上权利要求任意之一的方法，其特征在于，在第一次过滤之后，将残余物用MeOH大量地清洗，在加入二乙醚后，聚(2-乙基-2-噁唑啉)自然地以油状从溶液中分离，倒出全部溶剂，将所述洗涤和分离重复至少四次，然后在真空中干燥。
10.根据以上权利要求任意之一的方法，其特征在于，水解步骤包括从反应混合物中通过共沸蒸馏去除得到的释放的丙酸，这定期地进行并持续至少一天，同时用1H-NMR谱监测反应过程。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，将在反应过程结束时得到的残余物在水中稀释并蒸发至少三次来去除痕量丙酸，然后，将该残余物再次溶解在水中并过滤，然后冷冻干燥。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，过滤是通过网孔尺寸介于0.20微米和0.25微米之间的无菌醋酸纤维素膜进行的。
13.根据以上权利要求1至12任意之一的方法得到的线性PEI，其通过纯化中间体产物(PEOX)，该中间体产物具有少于1.0％的单体，少于5.0％的溶剂，分子量Mw＞23,000Da，多分散性Mw/Mn小于1.5。
14.根据权利要求13的线性PEI，其特征在于，中间体产物PEOX具有40,000＜Mw＜53,000Da的PEOX分子量Mw。
15.根据权利要求13的线性PEI，其特征在于，中间体产物PEOX具有25,000Da左右的分子量Mw。
全文摘要
本发明涉及一种合成和制备用作转染载体的线性聚乙烯亚胺(PEI)的方法，以及用这种方法得到的产品。它包含干燥单体2-乙基-2-噁唑啉和聚合所述单体以获得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)，通过将乙腈用作溶剂，添加干燥的聚合反应引发剂，并将它们混合在一起；通过蒸发纯化所述的得到的PEOX，同时用甲醇和二乙醚来进行至少三次相继的洗涤/沉淀步骤以及相应的过滤，以获得(i)通过进行1H-NMR测试，正确识别所述的PEOX聚合物，在＜1.0％的水平上确认没有单体且在＜5.0％的水平上确认没有溶剂，以及(ii)通过进行凝胶渗透色谱，分子量(Mw)的平均值＞23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)＜1.5；水解所述PEOX。
文档编号C08G73/00GK101821317SQ200880104653
公开日2010年9月1日 申请日期2008年7月31日 优先权日2007年7月31日
发明者A·阿迪布, F·斯多克, P·埃尔巴彻 申请人:聚加转染公司