专利名称：一种细菌纤维素复合膜及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种创伤敷料的材料及制作方法和应用，特别涉及一种 细菌纤维素复合膜及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌纤维素是在'1886年由Brown发现的，木醋杆菌(Acetobacter xylinum)在静止培养时于培养基表面形成一层白色纤维状物质，经化学 与物理方法分析确定此类物质具有纤维素的结构与化学性质，因其属细 菌合成而命名为细菌纤维素(bacterial cellulose BC)。细菌纤维素直径仅为 人工合成纤维的1/10，为10nm 100nm，是一种新型的纳米级生物材料。 其有许多独特的性质，如高结晶度和高化学纯度，高抗张强度和弹性模 量，很强的水结合性，极佳的形状维持能力和抗撕力，较高的生物适应 性和良好的生物可降解性。所以这种新型生物纳米材料的研究开发日益 受到各国研究者的重'视。
皮肤是人体的天然屏障，对维持体内环境的稳定和阻止微生物入侵起 重要作用。在人体的各种损伤中，皮肤组织的烧、创伤发生率最高。若 皮肤受到大面积损伤，则会引起许多局部甚至全身性问题，如新陈代谢加 剧、水分和蛋白质过度散失、免疫系统失调等，严重的还会危及生命。重 建或恢复皮肤屏障功能是烧创伤治疗的最终目标,在达到这个目标前，一 个性能优良的创面敷料可以暂时起到皮肤的部分功能,提供一个有利于 创面愈合的环境，等待创面上皮化或过渡到重建永久性皮肤屏障。治疗皮 肤缺失的有效方法是皮肤移植，消灭创面。自体皮肤是最佳选择，但当损 伤面积过大及机体状态不佳时，自体皮肤移植不仅量不足且会增加新创
4伤,无疑是雪上添霜。同种异体皮从20世纪40年代开始被用于治疗烧 伤。低温冷冻(-8(TC以下)同种异体皮是目前临床广为应用的产品，但有 以下不足 一是贮存、运输需要液氮罐，费用昂贵不便应用，尤其在应急 情况下；二是不经最终灭菌处理，有传播疾病的危险;三是其为活性组织, 有极强的免疫原性，移植后溶解、排斥，在创面停留不超过2周。所以 研制一种能满足在各种情况下及时、大量供应皮肤创伤治疗所需的生物 敷料意义重大。
细菌纤维素为纳米级纤维材料，含水量高，在经过改性后含水量更 高且产量也提高，所'以将改性后的细菌纤维素复合膜应用到作为创伤敷 料使用，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高含水量、高产 量的细菌纤维素复合膜及其制作方法和作为创伤敷料的应用。 本发明的设计方案
在液体培养基包括种子培养基和发酵培养基中添加一定量的海藻酸 钠，然后进行灭菌，接种，常规方式培养，即可得到高表达量、高含水 量和高机械强度的细'菌纤维素复合膜。
本发明所述利用海藻酸钠制备
一种细菌纤维素复合膜的制备方法，包括如下制备步骤
(1) 菌株选择
选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ) CGMCC No. 1 1812 或木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum) CGMCC No. 1.2378;
(2) 种子培养及液体发酵培养的培养基制备
种子培养及液体发酵培养的培养基原料重量百分比组成为 葡萄糖或果糖或蔗糖2% 4%酵母粉:
0.5% 1%
胰蛋白胨:
0.50/0 10/0
Na2HPO,
0.5% 1%
柠檬酸:
0.2% 0.3%
碳酸牵丐:
2% 3%
海藻酸钠 0.2 0.8g/L 余量为水
将上述原料混合后，在12rC的温度下灭菌20 25min，自 然冷却至3(TC后即可获得种子培养及液体发酵培养的培养基。
(3) 种子细胞培养'
取50 100mL步骤(2)所配的种子培养的培养基，用拧檬酸 或醋酸调节pH到5 6，再取1 2环活化好的斜面种子(CGMCC No.1.1812、 CGMCC No.1.2378)接入其中。25° C 32。C振荡 培养24h 36h，摇床转速为140 180r/min，即得种子液。
(4) 静态液体发酵培养生产细菌纤维素复合膜；
将步骤(2)所配的液体发酵培养的培养基，用柠檬酸或醋酸 调节pH到5 6，以体积百分比为5% 10%的接种量将步骤(3) 所得的种子液'接种到其中，充分振荡使菌液均匀，28。C 32。C静 置培养6 10天，液面表面生成一层膜。
(5) 细菌纤维素复合膜纯化组成；
取步骤(4)生成的膜，用水冲洗6 10次，除去膜表面培养 基及杂质，再将膜浸泡于0.08 0.12M的Na2C03碱溶液中，80°C 100。C煮20min 30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳 白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0 7.2时，冲洗 停止，即得本发明的细菌纤维素复合膜。
6本发明的有益效果
本发明获得的细菌纤维素复合膜，制备工艺简单，成本低，明显提 高原料的转化率及细菌纤维素的产量和含水量，可以使细菌纤维素的干
重由传统的8 10g/L提高到14 16g/L，含水量由98%至99%。本发明 获得的细菌纤维素复合膜可用于做创伤性敷料。
具体实施方式
实施例l
(1) 菌株选择选择木醋杆菌(G7wco"aceto6acter ) CGMCC No丄1812。
(2) 种子及液体培养基制备在以重量百分比计，含2%的果糖， 0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白胨，0.5%Na2HPO4， 0.2%柠檬酸，2%碳 酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.05%的海藻酸钠，自然pH 值，在12rC的温度下灭菌20min，冷却至3(TC后即可获得种子培养 及液体发酵培养的培养基。
(3) 种子细胞培养取1 2环活化好的斜面种子(木醋杆菌 (G7wco"(3Cdo6acter CGMCC No丄1812)接入种子培养的
培养基中，30。C振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，得种子液；
(4) 静态液体发酵生产细菌纤维素以体积百分比为6%的接种 量将种子液接种到液体发酵培养的培养基中，充分振荡使菌液均匀， 30。C静置培养8天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5) 细菌纤维素膜纯化取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗8 10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.1M的Na2CO3溶 液中，100。C煮20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色 半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0 7.2时，冲洗停止，80°C
7干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量和含水量。
经测定纤维素的产量为15g纤维素/L培养基，含水量为98.5%， 而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为8.5 g纤维素 /L培养基，含水量为97.5%。 实施例2
(1) 菌株选择选择木醋杆菌(G/wcowaceto6ac^" ;^/z'"wm )CGMCC No丄2378。
(2) 种子培养及液体培养的培养基制备按重量百分比计算，取 2%的葡萄糖，0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白胨，0.5%Na2HPO4， 0.2% 柠檬酸，2%碳酸钙，0.05%海藻酸钠，用柠檬酸或醋酸调节pH至6.0， 121°C灭菌20min，冷却至3(TC后即可获得种子培养及液体发酵培养 的培养基。
(3) 种子细胞培养取一环活化好的斜面种子木醋杆菌 (G/Mco"ace/ok cferxy//m/w) CGMCC No丄2378，接入种子培养的
培养基中，30。C振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，作为种子 液。
(4) 静态液体发酵生产细菌纤维素以6%的接种量接种到液体 发酵培养的培养基中(500mL三角瓶盛有200mL液体培养基)，接 种时需充分振荡，以使菌液均匀，30°C恒温静置培养6天。恒温静 置培养6天后生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5) 细菌纤维素膜纯化膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面 培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1M的Na2C03溶液，100°C煮沸 20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸 馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2时，停止冲洗。 80。C干燥至恒重，进行称重。
8经测定纤维素的产量为14g纤维素/L培养基，含水量为99%。
相比较同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为7.5 g纤维
素/L培养基，含水量为98%。
实施例3
(1) 菌株选择选择木酉昔杆菌(67wcowaceto6flcter x少/z.wwm) CGMCC No丄1812;
(2) 种子培养及液体培养的培养基制备按重量百分比计算，
取2%的葡萄糖，0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白胨，0.5%Na2HPO4， 0.2% 柠檬酸，2%碳酸钙，0.04%海藻酸钠，用柠檬酸或醋酸调节pH至6.0。 121°C灭菌20min，冷却至3(TC后即可获得种子培养及液体发酵培养 的培养基。
(3) 种子细威培养取一环活化好的斜面种子木醋杆菌 (G7wc画cetotoer 一"謂)CGMCC No丄1812，接入种子培养的
培养基中，32。C振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，作为种子 液。
(4) 静态液体发酵生产细菌纤维素以7%的接种量将种子液 接种到液体发酵培养的培养基(分装到发酵浅盘中，发酵盘清洗干净 后，臭氧水消毒)中，接种时需充分振荡，以使菌液均匀，厚度为 10mm， 32。C恒温静置培养6天。恒温静置培养6天后生成的细菌纤 维素膜浮于液面，约'厚为8mm。
(5) 细菌纤维素膜纯化膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表 面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1M的Na2CO3溶液，100。C煮沸 20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用 蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，pH约7.2时80。C干 燥至恒重，进行称重。
9经测定纤维素的产量为16g纤维素/L培养基，含水量为99%。
相比较同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.5 g纤维
素/L培养基，含水量为98%。
实施例4
(1) 菌株选择选扭木酉昔杆菌(G7w函膨toZ)a"er 一w謂)CGMCC No.1.2378。
(2) 种子及液体培养基制备在以重量百分比计，含4%的蔗糖， 1%的酵母粉，1°/。胰蛋白胨，l%Na2HP04， 0.3°/。柠檬酸，3%碳 酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.08%的海藻酸钠，然后用拧 檬酸或醋酸调节培养基的pH值为5.3，在121°C的温度下灭菌20min， 冷却至3(TC后即可获得种子培养及液体发酵培养的培养基。
(3) 种子细胞培养取1 2环活化好的斜面种子(木醋杆菌 (G7wcowac"oZ)"cferxj^"mw) CGMCC No. 1.2378 )接入种子培养的
培养基中，32。C振荡培养24小时，摇床转速为180r/min，得种子液；
(4) 静态液体发酵生产细菌纤维素以体积百分比为8%的接种 量将种子液接种到液体发酵培养的培养基中，充分振荡使菌液均匀， 32。C静置培养7天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5) 细菌纤维素膜纯化取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗10次， 除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.12M的NaOH溶液中， 100。C煮30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明 后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0 7.1时，冲洗停止，80。C干 燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
经测定纤维素的产量为15.5g纤维素/L培养基，含水量为99%。 而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.0 g纤维素 /L培养基，含水量为98%。实施例5
(1 )菌株选择选择木醋杆菌(G/wco"acetoZ acfer "//"Mm ) CGMCC No丄1812。
(2) 种子培养及液体发酵的培养基制备在以重量百分比计，含 3%的葡萄糖，0.8%的酵母粉，0.7%胰蛋白胨，0.8%Na2HPO4， 0.25% 柠檬酸，2.5%碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.07%的海藻 酸钠，然后用柠檬酸或醋酸调节培养基的pH值为5.7，在12rC的温 度下灭菌20min，冷却至3(TC后即可获得种子培养及液体发酵培养 的培养基。
(3) 种子细胞培养取1 2环活化好的斜面种子木醋杆菌 (G/wco"flcetoZ a"er x_y//"ww) CGMCC No.1.1812接入种子培养的
培养基中，22。C振荡培养36小时，摇床转速为150r/min，得种子液；
(4) 静态液体发酵生产细菌纤维素以体积百分比为5%的接种 量将种子液接种到液体发酵培养的培养基中，充分振荡使菌液均匀， 28°C静置培养10天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5) 细菌纤维素膜纯化取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗10次， 除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.09M的NaOH溶液中， 80。C煮30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明 后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.1 7.2时，冲洗停止，70。C干 燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
经测定:纤维素的产量为15.8g纤维素/L培养基，含水量为99%。 而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.2 g纤维素 /L培养基，含水量为98%。
细菌纤维素复合膜的应用
将所得的细菌纤维素复合膜应用皮肤缺损的大鼠的治疗，并以油纱
ii布为对照，进行创面愈合情况观察和光镜组织学观察。细菌纤维素膜治 疗组与对照组比较，伤后4d伤口愈合率和组织学检査无区别；结果伤后
7d、 14d、 21d、 28d伤口创面愈合率较对照组显著提高，组织病理学检
查显示细菌纤维素膜治疗组创面局部炎症反应较轻，成纤维细胞和新生 毛细血管增殖较对照组明显提高，后期表皮细胞分化明显。说明细菌纤 维素膜可刺激成纤维细胞和毛细血管增殖，促进创伤皮肤的再生，对皮 肤创伤性损伤具有促进愈合和减轻炎症反应的作用。
权利要求
1、一种细菌纤维素复合膜的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤(1)菌株选择选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812或木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.2378；(2)种子培养及液体发酵培养的培养基制备种子培养及液体发酵培养的培养基原料重量百分比组成为葡萄糖或果糖或蔗糖2％～4％酵母粉0.5％～1％胰蛋白胨 0.5％～1％Na2HPO4 0.5％～1％柠檬酸0.2％～0.3％碳酸钙2％～3％海藻酸钠 0.2～0.8g/L余量为水将上述原料混合后，在121℃的温度下灭菌20～25min，自然冷却至30℃后即可获得种子培养及液体发酵培养基。(3)种子细胞培养取50～100mL步骤(2)所配的种子培养的培养基，用柠檬酸或醋酸调节pH到5～6，再取1～2环活化好的斜面种子CGMCCNo.1.1812、CGMCC No.1.2378接入其中，25℃～32℃振荡培养24h～36h，摇床转速为140～180r/min，即得种子液。(4)静态液体发酵培养生产细菌纤维素复合膜；将步骤(2)所配的液体发酵培养的培养基，用柠檬酸或醋酸调节pH到5～6，以体积百分比为5％～10％的接种量将步骤(3)所得的种子液接种到其中，充分振荡使菌液均匀，28℃～32℃静置培养6～10天，液面表面生成一层膜。(5)细菌纤维素复合膜纯化组成；取步骤(4)生成的膜，用水冲洗6～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.08～0.12M的Na2CO3碱溶液中，80℃～100℃煮20min～30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，即得本发明的细菌纤维素复合膜。
2、 如权利要求1所述的一种细菌纤维素复合膜的制备方法，其特征在于 获得的细菌纤维素复合膜为14 16g/L培养基，含水量由98%至99%。
3、 如权利要求1所述的一种细菌纤维素复合膜的制备方法，其特征在于 获得的细菌纤维素复合膜可用于创伤性敷料。
全文摘要
本发明涉及一种细菌纤维素复合膜及其制备方法和应用，其制备步骤包括菌株选择、种子及液体培养基制备、种子细胞培养、液体发酵生产细菌纤维素复合膜及分离纯化等，最终得本发明的细菌纤维素复合膜。本发明获得的细菌纤维素复合膜，制备工艺简单，成本低，明显提高原料的转化率及细菌纤维素的产量和含水量，可以使细菌纤维素的干重由传统的8～10g/L提高到14～16g/L，含水量由98％至99％。本发明获得的细菌纤维素复合膜可用于做创伤性敷料。
文档编号C08L5/00GK101509026SQ200910048400
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者华 张, 霞 马 申请人:上海应用技术学院;东华大学