专利名称：：葡聚糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属化合物合成，涉及葡聚糖脂肪酸嫁接物的合成方法，以及该葡聚糖脂肪酸嫁接物在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。
背景技术：
：药物主要通过口服、注射、粘膜三种途径，以合适的药物剂型给药，达到全身或局部的治疗效果。传统的(药物+辅料)制备普通制剂的给药方式，受到体内生物膜吸收与转运屏障，酶代谢，以及正常脏器分布的影响，形成因药物无法大量进入其分子耙标而疗效低、剂量大，以及药物分布的非选择性而导致严重的毒副作用。癌症是当今最为常见的影响人类健康并导致死亡的主要病因之一，全世界每年约有1000多万新增癌症病例，有700多万人因癌症而死亡。在我国，每年死于癌症的人数超过160万，已位居各类死亡病因的首位。肿瘤化疗仍然是当今最经典最常用的癌症治疗手段之一，传统的细胞毒类化疗药物分子，并不具备人体内药物分布的选择性，导致药物应有疗效的严重缺失、毒副作用巨大，以及因产生耐药性而放弃治疗等重大药物治疗问题。靶向制剂试图通过载体技术，改变以药物自身性质为主导的药物体内分布模式，其最终目标是要将外源性的药物输送到药物作用的分子靶标，以最大限度地提高药物作用的疗效，降低药物的毒副作用。因此，采用高效安全的药物靶向治疗，已成为国内外高度关注的热点问题。实现药物的耙向治疗目标，关键是药物载体的分子设计，需要在明确药物分子作用靶点的基础上，重点突破三大核心问题的挑战1)可包封足够的有效药物剂量；2)在血液或淋巴液中具有良好的生物稳定性，能够主动识别靶组织或靶细胞；3)可突破生物膜屏障高效进入药物作用的分子靶区。自药物靶向治疗的概念提出以来，包括材料科学家、生物学科学家和医药科学家在内的多学科研究者，进行了长期不懈的努力，部分
技术领域：
已经获得率先突破。大量的纳米材料被相继开发，并应用于肿瘤的靶向治疗，主要有树状高分子、脂质体、聚合物纳米粒、聚合物胶束、蛋白质纳米粒、无机材料纳米粒、病毒纳米粒、金属纳米粒和碳纳米管等。研究表明聚乙二醇(PEG)等亲水性的表面特性，可避免血清蛋白的吸附和内皮网状系统的清除效应，从而延长载体材料的体内循环时间，达到肿瘤组织蓄积的目的。尽管抗肿瘤纳米靶向给药系统已广为研究，到目前为止仅有少量的制剂被美国FDA认可并上市。脂质体技术是最早被应用于临床肿瘤耙向治疗的产品，目前已经上市的制剂主要包括阿霉素脂质体和PEG化阿霉素脂质体。脂质体技术主要利用其载体结构与生物膜的相似性，可通过血液或淋巴途径，富集于网状内皮系统比较丰富的肝、脾、肺等脏器，而发挥抗肿瘤药物的被动靶向治疗作用，但脂质体在体内转运过程中的药物渗漏问题，一直没有得到妥善解决，因而并未体现出显著的高效低毒治疗效果。最近被美国FDA认可上市的紫杉醇白蛋白纳米粒有望实现肿瘤的靶向治疗。聚合物胶束是近几年发展起来的一类新型纳米药物载体，由两亲性聚合物在水性介质中通过自聚集形成。其疏水性内核可为难溶性药物提供储库；亲水性外壳可减少载体在体内被巨噬细胞吞噬，延长体内循环时间，并可通过近一步的配体或抗体修饰，实现肿瘤组织的主动靶向。然而聚合物胶束的亲水性表面特性，不利于载体材料的靶细胞摄取。聚合物胶束可通过胶团表面的配体修饰，经受体介导进入细胞；此外，选择胶团材料的阳离子构造或修饰，通过与细胞膜表面的离子相互作用，促进细胞摄取。细胞膜构造及吸收通道理论认为，以亲脂性材料化学组成为主的载体，有利于细胞(膜)摄取。目前，已经有包括脂质体[、固体脂质纳米粒等在内的药物载体微粒，应用于促进药物细胞摄取的研究。载体的细胞摄取，通常是一个细胞内吞的过程，载体的粒径是一个重要的限速因子，一般认为，粒径小于100nm的纳米载体，具有细胞膜摄取的比较优势。因此，以脂质构造为主体的纳米载体，是细胞高效摄取的基本要求。基于天然多聚糖具有较高稳定性、安全、低毒性、亲水性、易于化学修饰和可生物降解等特性，以及作为生物膜表面重要受体之一的多聚糖在膜转运过程中重要作用，因此，以多聚糖为主要材料的药物载体材料研究方兴未衰。葡聚糖(dextrans)为葡萄糖通过1，6-糖苷键形成的多聚糖，由于其在生物体内的惰性和非细胞毒性，已广泛应用于包括糖尿病制剂、抗生素、抗肿瘤药物、多肽与酶制剂的给药系统中。葡聚糖及其衍生物也已广泛应用于纳米粒等靶向给药系统。
发明内容为了提高药物活性组分在体内的靶向吸收，本发明的目的是提供一种葡聚糖脂肪酸嫁接物，具有以下式(I)所表示的结构单元:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)其中，葡聚糖链上的部分自由羟基被具有8~22个碳原子的脂肪酸取代，R是具有721个碳原子的垸基。在本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物中，葡聚糖的重均分子量(Mw)为10000Da-4000Da;脂肪酸的接枝率为1~10%，。葡聚糖脂肪酸嫁接物是指葡聚糖链上的部分自由羟基被脂肪酸取代的高聚物。上述脂肪酸可以是具有8~22个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸。另一方面，上述脂肪酸可以是具有8~22个碳原子的直链或支链脂肪酸。另外，脂肪酸优选具有12~20个碳原子，或具有12~18个碳原子，或具有1422个碳原子，或具有1622个碳原子，或具有1420个碳原子，或具有1618个碳原子。优选地，上述脂肪酸可以选自辛酸、月桂酸、豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山嵛酸或其任意混合物。本发明的另一个目的是提供葡聚糖脂肪酸嫁接物的制备方法，通过以下方案实现精密称取定量脂肪酸(脂肪酸分别按葡聚糖单体摩尔比的5-50%投料)，脂肪酸3倍摩尔量的N,N'-二环己基碳二亚胺(N，N'-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，DCCl/10摩尔量的4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine，DMAP)和500mg葡聚糖(重均分子量^0000-40000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水二甲基亚砜(DMSO)，加热超声使溶解，加入lg无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中60'C反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5KDa，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8|am水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的脂肪酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖脂肪酸嫁接物。本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性。例如，1.0mg/mL本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物可以在水中或pH值为1-14的溶液中形成胶团。通过微粒粒度仪测定，上述胶团的粒径在250~450nm的范围内。通过芘荧光法测定，本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物在水溶液中的临界胶团浓度为15250pg/ml的范围内。本发明的再一个目的是提供葡聚糖脂肪酸嫁接物在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。所述葡聚糖脂肪酸嫁接物作为载体与药物组合。所述药物可以是抗肿瘤药物，例如，阿霉素、紫杉醇等。本发明采用具有良好生物相容性的葡聚糖为亲水性材料，利用化学嫁接技术，可控合成两亲性的葡聚糖脂肪酸嫁接物，该嫁接物材料在水性介质中具有自聚集形成聚合物胶团，并具有较低的临界胶团浓度，可应用于制备抗肿瘤药物组合物。图1葡聚糖(A)、硬脂酸(B)和葡聚糖硬脂酸嫁接物(C)的氢谱核磁共振图谱。图2葡聚糖硬脂酸嫁接物载药胶团的体外释放。具体实施例方式以下通过实施例的方式对本发明进行详述，但本发明并不局限于这些实施例。一、葡聚糖脂肪酸嫁接物的合成实施例l精密称取175.5mg硬脂酸，381.8mgDCC，22.5mgDMAP和500mg葡聚糖(Mw^l0000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的硬脂酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖硬脂酸嫁接物实施例26精密称取87.8mg硬脂酸，191.5mgDCC，11.2mgDMAP和500mg葡聚糖(Mw-20000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的硬脂酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖硬脂酸嫁接物实施例3精密称取175.5mg硬脂酸，381.8mgDCC，22.5mgDMAP和500mg葡聚糖(Mw-20000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8|im水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的硬脂酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖硬脂酸嫁接物实施例4精密称取263.5mg硬脂酸，573.2mgDCC，33.8mgDMAP和500mg葡聚糖(M『20000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的硬脂酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖硬脂酸嫁接物实施例5精密称取175.5mg硬脂酸，381.8mgDCC，22.5mgDMAP和500mg葡聚糖(M^40000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的硬脂酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖硬脂酸嫁接物实施例6精密称取40mg辛酸，192mgDCC,11.2mgDMAP和500mg葡聚糖(Mw^OOOO)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中60。C反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的辛酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖辛酸嫁接物实施例7精密称取500mg山嵛酸，300mgDCC，40.2mgDMAP和500mg葡聚糖(Mw^l0000)置于250ml干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水DMSO，加热超声使溶解，加入少量无水硫酸钠。在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8h，并且用氮气保护。反应结束后，将反应产物用透析袋(MWCO3.5Kda，美国光谱实验室公司)透析48h，持续换水以除去DMSO和水溶性副产物。透析后反应产物用0.8pm水膜过滤以除去DCC等不溶性物质后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，以除去未反应的山嵛酸。最后，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖山嵛酸嫁接物二、葡聚糖脂肪酸嫁接物的特性实施例1所得葡聚糖硬脂酸嫁接物的氢谱核磁共振光谱见图1，由图可知，通过硬脂酸的羧基与葡聚糖的羟基的化学反应，实现了葡聚糖与硬脂酸的化学嫁接。分别称取上述实施例l-7得到的葡聚糖脂肪酸嫁接物10mg，加适量双蒸水水浴超声10min分散，并定容至100mL，得到相应的胶团溶液。使用Zetasizer3000HS分析仪，测定溶液中胶团的平均粒径(D)。通过公知的芘荧光法，分别测定葡聚糖脂肪酸嫁接物胶团在水中的临界胶团浓度(CMC)。通过公知氢谱核磁共振光谱，测定脂肪酸接枝率，实施例1-7的上述特性均列于下表1。表lD(nm)CMC(ng/mL)脂肪酸接枝率(％)实施例1258.0±2.472.781.45实施例2312.8±0.9190.661.93实施例3308.8±12.976.363.86实施例4260.8±6.118.46.60实施例5367.1±6.116.767.65实施例6447.9±8.9249.72.39实施例7251.6±2.315.0810.87可见，本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性。而且，本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度。本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物形成的胶团作为一种药物传输系统，具有许多优势通过调整材料的葡聚糖的分子量和脂肪酸的接枝率可以控制药物活性组分在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障、网状内皮组织系统，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；因此，本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物可以作为载体用于许多种药物组合物的制备。三、葡聚糖脂肪酸嫁接物胶团抗肿瘤药物组合物中的应用1.阿霉素分别精密秤取50mg实施例1、2、4、5中制备的葡聚糖硬脂酸嫁接物(置50mL烧杯中，分别加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水分别定容至50mL，得1mg/mL的胶团溶液。分别移取该葡聚糖硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入2mL浓度为lmg/mL的阿霉素二甲亚砜溶液，室温条件下搅拌3h后，置于分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析24h后，透析原液5000rpm离心5分钟，去除析出的阿霉素。上清液过0.22pm的微孔滤膜，即得负载阿霉素的葡聚糖硬脂酸嫁接物载药胶团。使用Zetasizer3000HS分析仪，测定载药胶团的粒径；高效液相色谱法测定阿霉素含量并计算药物包封率，其结果参见表2:表2:负载阿霉素的葡聚糖硬脂酸嫁接物理化性质9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>四种载药胶团的体外释放参见图2，由图可知，通过嫁接物中葡聚糖的分子量和硬脂酸接枝率的调控可有效实现对药物的控释。2.紫杉醇分别精密秤取50mg实施例1、2、4、5中制备的葡聚糖硬脂酸嫁接物(置50mL烧杯中，分别加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水分别定容至50mL,得1mg/mL的胶团溶液。分别移取该葡聚糖硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入2mL浓度为lmg/mL的紫杉醇甲醇溶液，室温条件下搅拌3h后，置于分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析24h后，透析原液5000rpm离心5分钟，去除析出的紫杉醇。上清液过0.45pm的微孔滤膜，即得负载紫杉醇的葡聚糖硬脂酸嫁接物载药胶团。使用Zetasizer3000HS分析仪，测定载药胶团的粒径；高效液相色谱法测定紫杉醇含量并计算药物包封率，其结果参见表3:表3:负载紫杉醇的葡聚糖硬脂酸嫁接物理化性质<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种葡聚糖脂肪酸嫁接物，具有下式所表示的结构单元其中，R是具有7～21个碳原子的烷基，葡聚糖链上的部分自由羟基被具有8～22个碳原子的脂肪酸取代，葡聚糖的重均分子量为10000Da-4000Da，脂肪酸的接枝率为1～10％，葡聚糖脂肪酸嫁接物在水溶液中的临界胶团浓度为15～250μg/ml。2.权利要求1所述的葡聚糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现称取脂肪酸，并按葡聚糖单体摩尔比的5-50%投料，将脂肪酸3倍摩尔量的N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺1/10摩尔量的4-二甲氨基吡啶和500mg葡聚糖置于干燥圆底烧瓶中，然后加入45ml脱水二甲基亚砜，加热超声使溶解，加入无水硫酸钠，在恒温加热磁力搅拌器中6(TC反应8小时，并且用氮气保护，反应结束后，将反应产物用透析袋透析48小时，持续换水以除去二甲基亚砜和水溶性副产物，透析后反应产物用水膜过滤后冻干，冻干产物用乙醇洗涤三次，将反应产物用去离子水溶解，冻干，即得葡聚糖脂肪酸嫁接物。3.根据权利要求2所述的葡聚糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征在于，葡聚糖的重均分子量为10000-40000。4.根据权利要求1所述的葡聚糖脂肪酸嫁接物在制备抗肿瘤药物组合物中的应用，所述葡聚糖脂肪酸嫁接物在组合物中作为载体与药物组合。全文摘要本发明提供一种葡聚糖脂肪酸嫁接物，葡聚糖的重均分子量为10000Da-4000Da，脂肪酸的接枝率为1～10％。本发明采用具有良好生物相容性的葡聚糖为亲水性材料，利用化学嫁接技术，可控合成两亲性的葡聚糖脂肪酸嫁接物，该嫁接物材料在水性介质中具有自聚集形成聚合物胶团，并具有较低的临界胶团浓度，该葡聚糖脂肪酸嫁接物可以作为药物载体，与抗肿瘤药物组合，应用于抗肿瘤药物组合物的制备，达到控制药物活性组分在生物体内的释放，实现药物的被动靶向，降低药物的毒副作用。本发明的葡聚糖脂肪酸嫁接物的结构式。文档编号C08B37/02GK101585888SQ20091010045公开日2009年11月25日申请日期2009年7月6日优先权日2009年7月6日发明者杜永忠,胡富强,弘袁申请人:浙江大学