专利名称：一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及分子印迹技术领域，更具体涉及一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方
法。适合于所有水溶性生物大分子的分子印迹。利用该方法制备的分子印迹膜对目标蛋白 具有一定的特异识别功能，可发展成替代抗体的检测蛋白质的分析产品。
背景技术：
分子印迹技术是一种合成人工抗体的技术，其主要原理是首先选择能与模板分 子形成共价键或者非共价键的功能单体，与模板分子形成复合物，然后与交联剂共聚形成 交联聚合物。将模板分子洗脱后，在聚合物中留下与模板分子的形状、大小和表面功能基团 相匹配的孔穴，这些空穴能选择性识别模板分子。采用分子印迹技术，制备对目标蛋白质分 子具有优异识别能力的分子印迹膜，制成可替代抗体的分子识别元件，是近年来生物芯片 和生物传感器领域的一个新的研究方向。 目前，常采用的蛋白质分子印迹膜的制备方法有以下几种一、直接在传感器表面 (电极、QCM基片和SPR基片)上进行本体聚合形成蛋白质印迹膜。如湖南大学姚守拙等 Biosens. Bioelectron. 2006,21 :1244-1251通过溶胶_凝胶和化学沉积的方法，在压电石 英晶体-金电极表面制备的可识别人血清白蛋白的分子印迹膜。其传感器的信号可随着被 测蛋白浓度的增加而增加，不足之处是传感器的选择性不够理想。二、采用与蛋白质抗原决 定族组成相同的短肽，作为模板分子，在平面上合成可识别蛋白质的分子印迹膜。如Tai等 采用多肽印迹法制备了检测登革热病毒的人工抗体膜Anal.Chem. ，2005,77 :5140-5143。 但在Tai的工作中测量重现性较差(CV在10% -32% )，原因是采用的模板分子是只有几 个氨基酸的短肽，不具备三维结构特征，而多肽的三维结构是抗原-抗体识别的主要依据， 所以该方法制备的印迹膜对蛋白质分子的识别效率难以把握。三、压印法，将蛋白质模板 固定在某一基片上形成"蛋白质印章"，与聚合物单体层紧密接触，使聚合反应在很薄的液 层中进行。该方法可以制得超薄分子印迹膜。如Chou等[10-12]将蛋白质模板吸附在一 块玻璃片上，与另一块涂布了功能单体和交联单体的玻璃片紧密接触，通过紫外光引发，使 聚合反应在两块玻璃片的夹层中进行，制得蛋白分子印迹膜Biosens.Bioelectron. ，2006， 22 :355-363， Biosens. Bioelectron. ，2006,22 :534-543。 Shi等将蛋白质吸附于亲水的、 原子级平坦的云母表面，然后将一个二糖分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上，通过大量的氢 键与蛋白质络合，再将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而 沉积，得到具有与蛋白质形状匹配的纳米空穴的分子印迹膜Nature, 1999， 398 :593-597。 然而，Shi和Chou等以物理吸附的方法在固体表面上直接固定蛋白质分子，不仅会引起蛋 白质聚集，而且容易引起其构型上的变化，造成蛋白质变性，这样印迹出来的孔穴对自然 结构分子的识别能力会差，也造成了分子印迹膜的不均匀性。四、自组装法，Britt等将蛋 白质模板分子与三种磷脂共同自组装到固体表面上。磷脂分子在固体表面上形成的单分 子层，避免了蛋白质在固体表面的直接吸附，其中带有正电荷的磷脂通过静电作用将带负 电的蛋白质分子吸附在磷脂层上，而连有PEG链的磷脂分子阻止了蛋白质分子间的聚集
4Biotechnol. Prog. 2006,22 :150-155。上述方法虽然有利于单分子印迹孔穴的形成，也在一 定程度上避免了模板分子的变形。但是由于没有采用交联单体，对印迹孔穴的稳定性有一 定影响。 综上，前人在蛋白质分子印迹膜的制备方面虽然积累了不少宝贵的经验，然而，蛋 白质体积大，结构复杂(其表面形状不规则，功能基团多)，容易变形变性，在有机溶剂中不 稳定，给蛋白质印迹工作带来了很大困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，该方法简便、经济， 该方法采用蛋白质电泳常用的制胶原料丙烯酰胺作为功能单体，采用"三明治"法即将模板 蛋白、功能单体、交联单体和引发剂的混合溶液滴加在两块玻璃片之间，使聚合反应在两块 玻璃片之间进行，形成蛋白质分子印迹膜。丙烯酰胺是水溶性功能单体，与蛋白质具有很好 的相容性，聚合过程中不易造成蛋白质变性，此外，丙烯酰胺的交联聚合条件温和，也适合 生物大分子的分子印迹。 本发明是通过以下技术方案实现的 —种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其步骤是 (1)、制备蛋白质分子印迹膜的载体玻璃片的预处理 将盖玻片放入烧杯，加入一定量1 5克的清洗剂(各种品牌的洗衣粉和可用于 玻璃器皿洗涤的洗洁剂)于300 500mL去离子水中，超声5 20min ;将盖玻片取出放入 另一烧杯，经去离子水3 5次冲洗后，在lmol/L氢氧化钠溶液中浸泡并超声5 20min ; 取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在盖玻片上的氢氧化钠溶液，经3 5次冲洗后， 加入去离子水超声5 20min ;将离子水倒出，加入lmol/L HC1溶液浸泡，超声5 20min ; 取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在玻片上的HC1溶液，经3 5次冲洗后，加入去 离子水超声5 20min ;将上述盖玻片取出，晾干，备用。
(2)、模板蛋白、功能单体和交联单体溶液的配制 用磷酸盐缓冲液配制一定浓度10—6 10—8M的牛血红蛋白溶液，称取一定量(要 求与模板蛋白的摩尔数比达到400 : 1以上)水溶性功能单体如丙烯酰胺、甲基丙烯酰 胺、丙烯酸、甲基丙烯酸等加到lmL蛋白溶液中，混匀，于冰箱中4t:放置过夜，再加入N， N' _亚甲基双丙烯酰胺，超声脱气5 10min，通氮气5 10min后，依次加入引发剂5 10yL，(使其与功能单体的摩尔比在500 1000之间)和催化剂(四甲基二乙胺)1PL， 混匀； (3)、在两块玻璃片间进行聚合反应 按步骤(2)将蛋白质模板分子、功能单体、交联单体和引发剂混匀后，用移液器吸 取30 50mL它们的混和液，缓缓滴加在载玻片上，盖上盖玻片，使液滴全被盖住，尽量保证 无气泡，聚合2-3小时，成膜后轻轻揭开盖玻片，得到与盖玻片面积一样的丙烯酰胺聚合物膜。 (4)、洗脱模板蛋白分子 将分子印迹膜(MIPM)放入小烧杯中，每次吸取2mL洗脱液加入其中，摇动3_4小 时后测其紫外_可见吸光值，直到检测不到吸收峰为止，最后用去离子水冲洗掉残留在膜上的洗脱剂。通过测洗脱液中蛋白的含量，来判断洗脱液的洗脱效率。 (5)、按(1)_(4)步骤制备非印迹膜(NIPM)，即在制备聚合物膜的过程中不加入模 板蛋白分子。
(6)、分子印迹膜对目标蛋白的吸附量的计算方法 将经过洗脱过程的MIPM和NIPM分别放入加有重结合模板蛋白溶液的6孔板中， 每隔一定时间(15 60min)利用紫外/可见分光光度计测量6孔板中重结合模板蛋白溶 液的吸光度值，根据吸附量公式计算分子印迹膜(MIPM)和非分子印迹膜(NIPM)对蛋白的 吸附量。吸附量9吸=(CO-C余)XV/S，其中Q吸为MIPM和NIPM吸附模板蛋白的吸附量；C。 为重结合模板蛋白溶液的浓度；C余为结合2小时或更长时间后6孔板中重结合模板蛋白 溶液的浓度；V为重结合模板蛋白溶液的体积；S为膜面积。
(7)、分子印迹膜的选择性吸附评价方法 将MIPM和NIPM分别放入分别盛有不同种类蛋白溶液鸡蛋清溶菌酶，牛血清 蛋白，肌红蛋白，牛血红蛋白的6孔板中，静置放置4小时后，利用紫外/可见分光光度计 测量6孔板中不同种类重结合蛋白溶液的浓度，计算吸附量，通过印迹因子(imprinting factor) a的值来评价印迹膜对模板蛋白的识别性能。a值(imprinting factor) = QMIPM
吸AWpm吸，式中qhpm吸为印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附容量；qnm吸为非印迹膜对某种蛋 白质溶液的吸附容量。 所述的印迹膜的载体可以是普通玻璃、石英玻璃或云母等耐受洗涤液，并不与聚 合溶液反应的材料。 所述的模板蛋白可以是水溶性并与功能单体、交联单体相容的所有蛋白，如牛血 红蛋白、肌红蛋白中的任意一种。 所述的所有功能单体和交联单体为水溶性的，且不会使模板蛋白发生变性。包括 水溶性功能单体丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或丙烯酸或甲基丙烯酸其中的一种或二到四种 和交联单体N， N' _亚甲基双丙烯酰胺。 所述的洗脱液为所有可以将模板蛋白从印迹膜上洗脱的缓冲溶液、盐溶液、碱溶 液和变性剂等。包括各种浓度的磷酸盐缓冲溶液或NaCl盐溶液或NaOH碱溶液或变性剂 十二烷基硫酸钠其中的一种或二到四种。 所述的引发剂是可引起聚合反应但不使模板蛋白发生变性的所有引发剂包括热 引发剂和光引发剂。包括过硫酸钾、过硫酸铵、二乙基二硫代氨基甲酸钠等其中的一种。
所述的催化剂为四甲基二乙胺。 采用本发明方法可以制备对目标蛋白具有选择性吸附的分子印迹膜。结果表明 丙烯酰胺是一种较好的制备蛋白质印迹膜的功能单体，在制膜过程中，模板蛋白没有发生 变性，因此，分子印迹膜上形成的空穴对目标蛋白具有识别能力。本发明方法较文献已报道 的方法简单，功能单体易得，反应条件温和，是一种简便、经济的制备生物大分子分子印迹 膜的方法，该方法制备的蛋白质分子印迹膜可开发成检测蛋白质的芯片。实验数据表明印 迹膜(MIPM)对牛血红蛋白的吸附量的吸附量为O. 21 0. 22nmol/cm2明显高于非印迹膜对 血红蛋白的吸附量0. 09 0. lnmol/cm2。印迹膜对相同浓度的BSA、鸡蛋清溶菌酶、肌红蛋 白和牛血红蛋白的吸附量依次为0. 08nmol/cm2、0. lnmol/cm2，0. 14nmol/cm2和0. 21nmo1/ cm、表明印迹膜对模板蛋白-牛血红蛋白的吸附量最高。
图1 一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法的印迹膜对模板蛋白的吸附量与吸附 时间关系示意图。
图2 —种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法的不同蛋白的吸附情况示意图。
具体实施方式
实施例1 : —种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其步骤是
—、载体_玻璃片基质的处理 实验采用"三明治"夹心法来制备分子印迹膜，采用二种大小不同的载玻片 (24 X 24mm和18 X 18mm)作为"载体"。载体玻片的预处理，具体步骤如下
(1)将盖玻片放入烧杯，加入1 5克的清洗剂(任何型号洗衣粉或液体洗洁剂) 和300 500mL去离子水，超声5 20min ; (2)将盖玻片取出放入另一烧杯，经去离子水3 5次冲洗后，在lmol/L氢氧化钠 溶液中浸泡并超声5 20min ; (3)取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在盖玻片上的氢氧化钠溶液，经3 5次冲洗后，加入去离子水超声5 20min。 (4)将离子水倒出，加入lmol/LHCl溶液浸泡，超声5 20min。 (5)取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在玻片上的HC1溶液，经3 5次冲
洗后，加入去离子水超声5 20min。 (6)将上述盖玻片取出，晾干，备用。 二、印迹膜的制备 用PBS(0.01mol/L p朋.4)配制0. 168 y mol/L的血红蛋白溶液，加入丙烯酰胺，使 其与血红蛋白的摩尔比大于400，摇匀，于冰箱中4t:放置过夜。再加入N，N'-亚甲基双 丙烯酰胺，使其与功能单体的摩尔比为1 : 40，超声脱气5min，再通氮气5min。往5mL血红 蛋白、丙烯酰胺和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的混合溶液中依次加入lOiiL 0. 1M的过硫酸 铵和1PL四甲基二乙胺，混匀后，用移液器吸取50ul，缓缓滴加在载玻片上，盖上盖玻片， 使液滴全被盖住，尽量保证无气泡，聚合2-3小时。成膜后轻轻揭开盖玻片，得到与盖玻片 面积一样的聚合物膜。非印迹膜的制备过程与印迹膜的基本相同，只是聚合过程中不加模 板分子牛血红蛋白。
三、模板分子的洗脱 将分子印迹膜(MIPM)放入小烧杯中，每次吸取2mL洗脱液加入其中，经摇床摇动 3-4小时后用紫外_可见分光光度仪测其紫外_可见吸光值，直到检测不到吸收峰为止， 最后用去离子水冲洗掉残留在膜上的洗脱液。所述的洗脱液包括1M NaCl，O. 1M PBS，1% SDS-10% HAc。实验结果表明用1% SDS-10% HAc溶液的洗脱量最大为2. 9nmol，洗脱效率 为47%，相比较其他洗脱液而言洗脱效果最好。0. lmol/LPBS溶液次之，洗脱量为1. 4nmo1， 洗脱效率为17% ;而0. 1M NaCl溶液对蛋白的洗脱量最小，洗脱量为为0. 9nmol，洗脱效率 为11%。对非印迹膜进行同样的洗脱过程。
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四、分子印迹膜对目标蛋白的吸附 将经过洗脱过程的MIPM和NIPM分别放入加有1. 125 y mol/L重结合模板蛋白溶 液的6孔板中，每隔30min利用紫外/可见分光光度计测量6孔板中重结合模板蛋白溶液 吸光度值，根据吸附量公式计算MIPM和NIPM对蛋白的吸附量。吸附量9吸=(C。-C余)XV/ S，其中Q吸为MIPM和NIPM吸附模板蛋白的吸附量；C。为重结合模板蛋白溶液的浓度；C《为
结合一段时间后6孔板中重结合模板蛋白溶液的浓度；V为重结合模板蛋白溶液的体积；S
为膜面积。图1显示在2. 5h内，印迹膜(MIPM)对牛血红蛋白的吸附量随着时间的增加而 明显增大，印迹膜达到静态吸附平衡时对模板蛋白的吸附量为0. 21 0. 22nmol/cm2。
非印迹膜(NIPM)对牛血红蛋白也有一定吸附量，随着时间的增加也有一定程 度的增加，但吸附量和增加幅度明显低于印迹膜，NIPM对牛血红蛋白的吸附量为0. 09 0. lnmol/cm2。
五、分子印迹膜的选择性吸附评价 将MIPM和NIPM放入分别盛有不同种类蛋白溶液鸡蛋清溶菌酶，牛血清蛋白，肌 红蛋白，牛血红蛋白的6孔板中，蛋白浓度均为1. 125ymol/L。静置放置4小时后，利用紫外 /可见分光光度计测量6孔板中不同种类重结合蛋白溶液的浓度，计算吸附量，通过印迹因 子(imprinting factor) a的值来评价印迹膜对模板蛋白的识别性能。a值(imprinting factor) = Qmm吸AWpm吸，式中QMM吸为印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附容量；Q虹PM吸为 非印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附容量。图2显示印迹膜对相同浓度的BSA、鸡蛋清溶菌 酶、肌红蛋白和牛血红蛋白的吸附量依次为0. 08nmol/cm2、0. lnmol/cm2，0. 14nmol/cm2和 0. 21nmol/cm2。印迹膜对模板蛋白_牛血红蛋白的吸附量最高，印迹膜对BSA、溶菌酶、肌 红蛋白和牛血红蛋白的a值分别为1. 2、1. 3、1. 7、2. 5，说明MIPM对牛血红蛋白具有一定 选择性。非印迹膜对BSA、溶菌酶、肌红蛋白和对模板蛋白BHB溶液的吸附量差别不大，在 0. 07-0. 08nmol/cm2之间，表明非印迹膜对蛋白没有选择性。结果表明印迹膜比非印迹膜具
有更有的选择识别性。
实施例2 : —种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其步骤是
—、载体_玻璃片基质的处理
载体-玻片基质的处理与实施例1相同。
二、印迹膜的制备 用PBS(O. 01mol/L p朋.4)配制0. 084y mol/L的血红蛋白溶液。加入功能单体丙 烯酰胺和丙烯酸(摩尔比l : 1)，使功能单体的总摩尔数与血红蛋白的摩尔数比大于400， 摇匀，于冰箱中4t:放置过夜。再加入N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，使其与功能单体的摩尔 比为1 : 40，超声脱气5min，再通氮气5min。加入10 y L0. 1M的过硫酸铵和1 y L四甲基二 乙胺，混匀后，用移液器吸取50 ii L，缓缓滴加在载玻片上，盖上盖玻片，使液滴全被盖住，保 证无气泡，聚合2-3小时。成膜后轻轻揭开盖玻片，得到与盖玻片面积一样的聚合物膜。非 印迹膜的制备过程与印迹膜的基本相同，只是聚合过程中不加模板分子牛血红蛋白。
三、模板分子的洗脱 模板分子的洗脱的步骤与实施例1相同。采用的洗脱液是1% SDS-10% HAc。
四、分子印迹膜对目标蛋白的吸附
分子印迹膜对目标蛋白的吸附步骤与实施例1相同，实验结果显示，分子印迹膜对血红蛋白的吸附量为0. 380nmol/ci^，高于非印迹膜对血红蛋白的吸附量。 实施例3 : —、载体_玻璃片基质的处理 载体-玻片基质的处理与实施例1相同。 二、印迹膜的制备 用PBS(0.01mol/L p朋.4)配制0. 042 ii mol/L的血红蛋白溶液，加入甲基丙烯酸
和丙烯酰胺(摩尔比i : 1)，使其与血红蛋白的摩尔比大于400，摇匀，于冰箱中4t:放置过
夜。再加入N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，N，N'-亚甲基双丙烯酰胺与功能单体的摩尔比为1 : 40。超声脱气5min，再通氮气5min。加入10 y L0. 1M过硫酸钠和四甲基二乙胺1 y L，混匀后，用移液器吸取50ul缓缓滴加在载玻片上，盖上盖玻片，使液滴全被盖住，尽量保证无气泡，聚合2-3小时。成膜后轻轻揭开盖玻片，得到与盖玻片面积一样的聚合物膜。非印迹膜的制备过程与印迹膜的基本相同，只是聚合过程中不加模板分子牛血红蛋白。
三、模板分子的洗脱
模板分子的洗脱步骤与实施例2相同。
四、分子印迹膜对目标蛋白的吸附 分子印迹膜对目标蛋白的吸附步骤与实施例1相同，实验结果显示，分子印迹膜对血红蛋白的吸附量为0. 130nmol/ci^，高于非印迹膜对血红蛋白的吸附量。
实施例4 : —、载体_玻璃片基质的处理 载体-玻片基质的处理与实施例1相同。 二、印迹膜的制备 印迹膜的制备方法步骤和其它材料同实施例1，不同的是采用0. 084 ii mol/L的肌
红蛋白作为模板分子。
三、模板分子的洗脱 模板分子的洗脱步骤与实施例2相同。 四、分子印迹膜对目标蛋白的吸附 分子印迹膜对目标蛋白的吸附步骤与实施例1相同，实验结果显示，分子印迹膜对肌红蛋白的吸附量高于非印迹膜对血红蛋白的吸附量。
权利要求
一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其步骤是(1)、制备蛋白质分子印迹膜的载体玻璃片的预处理将盖玻片放入烧杯，加入1～5克的清洗剂于300～500mL去离子水中，超声5～20min；将盖玻片取出放入另一烧杯，经去离子水3～5次冲洗后，在1mol/L氢氧化钠溶液中浸泡并超声5～20min；取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在玻片上的氢氧化钠溶液，经3～5次冲洗后，加入去离子水超声5～20min；将离子水倒出，加入1mol/L HCl溶液浸泡，超声5～20min；取出盖玻片，用去离子水冲洗以除去残留在盖玻片上的HCl溶液，经3～5次冲洗后，加入去离子水超声5～20min；最后将上述盖玻片取出，晾干，备用；(2)、模板蛋白、功能单体和交联单体溶液的配制用磷酸盐缓冲液配制浓度10-6～10-8M的牛血红蛋白溶液，称取与模板蛋白的摩尔数比达到400∶1水溶性功能单体如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸等加到1mL蛋白溶液中，混匀，于冰箱中4℃放置过夜，再加入N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，超声脱气5～10min，通氮气5～10min后，依次加入引发剂5～10μL，与功能单体的摩尔比在500～1000之间和催化剂1μL，混匀；(3)、在两块玻片间进行聚合反应将步骤(2)中的蛋白质模板分子、功能单体、交联单体和引发剂混匀后，用移液器吸取30～50μL缓缓滴加在载玻片上，盖上盖玻片，使液滴全被盖住，聚合2-3小时，成膜后揭开盖玻片，得到与盖玻片面积一样的聚合物膜；(4)、洗脱模板蛋白分子将分子印迹膜放入烧杯中，每次吸取2mL洗脱液加入其中，摇动3-4小时后测其紫外-可见吸光值，直到检测不到吸收峰为止，最后用去离子水冲洗掉残留在膜上的洗脱剂，通过测洗脱液中蛋白的含量，来判断洗脱液的洗脱效率；(5)、按(1)、(2)、(3)、(4)步骤制备非印迹膜，在制备聚合物膜的过程中不加入模板蛋白分子；(6)、分子印迹膜对目标蛋白的吸附量的计算方法将经过洗脱过程的MIPM和NIPM分别放入加有重结合模板蛋白溶液的6孔板中，每隔15～60min利用紫外/可见分光光度计测量6孔板中重结合模板蛋白溶液的吸光度值，根据吸附量公式计算分子印迹膜和非分子印迹膜对蛋白的吸附量，吸附量Q吸＝(CO-C余)×V/S，其中Q吸为MIPM和NIPM吸附模板蛋白的吸附量；CO为重结合模板蛋白溶液的浓度；C余为结合2小时后6孔板中重结合模板蛋白溶液的浓度；(7)、分子印迹膜的选择性吸附评价方法将MIPM和NIPM分别放入分别盛有不同种类蛋白溶液鸡蛋清溶菌酶，牛血清蛋白，肌红蛋白，牛血红蛋白的6孔板中，静置放置4小时后，利用紫外/可见分光光度计测量6孔板中不同种类重结合蛋白溶液的浓度，计算吸附量，通过印迹因子α的值来评价印迹膜对模板蛋白的识别性能，α值＝QMIPM吸/QNIPM吸，式中QMIPM吸为印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附容量；QNIPM吸为非印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附容量。
2. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的 印迹膜的载体是普通玻璃、石英玻璃或云母。
3. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的模板蛋白是水溶性并与功能单体、交联单体相容的蛋白，包括血红蛋白、肌红蛋白、牛血清 白蛋白中的任意一种。
4. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的 是水溶性功能单体和交联单体，不会使模板蛋白发生变性，包括水溶性功能单体丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或丙烯酸或甲基丙烯酸其中的一种或二到四种和交联单体N，N'-亚甲基 双丙烯酰胺。
5. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的 洗脱液将模板蛋白从印迹膜上洗脱的缓冲溶液、盐溶液、碱溶液和变性剂，包括各种浓度的 磷酸盐缓冲溶液或NaCl盐溶液或NaOH碱溶液或变性剂十二烷基硫酸钠其中的一种或二到 四种。
6. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的 引发剂包括热引发剂和光引发剂，包括过硫酸钾、过硫酸铵、二乙基二硫代氨基甲酸钠其中 的一种。
7. 根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于所述的 催化剂为四甲基二乙胺。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，步骤是1、制备蛋白质分子印迹膜的载体玻璃片的预处理将盖玻片放入烧杯，加入清洗剂和去离子水，超声；2、模板蛋白、功能单体和交联单体溶液的配制用磷酸盐缓冲液配制模板蛋白溶液，加入水溶性功能单体、交联单体和引发剂并混匀；3、在两块玻璃片间进行聚合反应，形成聚合物膜；4、模板蛋白分子的洗脱将分子印迹膜放入烧杯中，吸取洗脱液加入其中，去除模板蛋白分子，得到与模板蛋白分子相匹配的印迹孔穴。本发明印迹过程中蛋白质不容易变性；聚合条件简单、温和。制备的分子印迹膜可发展成检测蛋白质的显色芯片。
文档编号C08F220/56GK101775103SQ20091027343
公开日2010年7月14日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者丁安子, 方桂杰, 李永进, 王晖, 谢卫红 申请人:湖北工业大学