专利名称：结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法及结核杆菌诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的制备方法 及结核杆菌诊断试剂。
背景技术：
LAM抗原结核杆菌通过独特的细胞壁结构在属主体内生存、繁殖。其结核杆 菌细胞壁含有多种成分(图1)，如孔蛋白(Porin)，多糖，脂类(Lipids)，霉菌酸(mycolic acid),磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannosides. PIM),脂甘露聚糖 (lipomannans, LM)，脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)。其中，LAM是分枝杆菌 细胞壁的主要成分，达15毫克/g细菌总重量。LAM广泛影响受感染的宿主的免疫系统。据 报道，从结核分枝杆菌和麻风杆菌分离出的LAM能引起T细胞增殖抑制，干扰与干扰素介导 的巨噬细胞激活，清除有毒的游离氧自由基，抑制蛋白激酶活性及基因编码介素(IL)-2和 IL - 5和粒细胞合成/巨噬细胞集落刺激人类T细胞因子，诱导巨噬细胞即刻早期基因表 达，促进单核细胞肿瘤坏死因子的生成增强及补体活化。研究结果表明，作为属特异性抗原 LAM，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，参与了结核杆菌感染的许多过程，有助于对结 核病发病(肺结核)以及其他分枝杆菌感染。菌体内存在从PI — PIMs — LM — AraLAM的合 成过程。图2为脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)结构。LAM抗原的获得LAM抗原一般从大量培养的菌体中提取获得，通常先将细胞壁 破碎，首先经有机溶剂(50-70%乙醇、苯酚等)提取，再通过疏水层析结合离子交换层析与凝 胶过滤，要获得纯抗原，制备过程非常复杂。即便如此，由于脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)与脂 甘露聚糖(LM)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)结构等非常相近，由于要将LM、PIM、多糖等近似 成分从LAM抗原溶液中去除需要多步过程。导致批量制备十分困难，往往使用混合性抗原。LAM抗原用于循环结核杆菌抗体检测 由于脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)可刺激机 体产生相应的抗体，血清LAM抗体检测可作为结核病一项有效的辅助诊断方法。结核杆菌抗体诊断试剂中脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的纯度直接决定了血清LAM抗 体检测产品质量的优劣(灵敏度和特异度)。一些非属特异性抗原如脂甘露聚糖(LM)，磷脂 酰肌醇甘露糖苷(PIM)等会严重干扰检测结果，降低试剂的特异性。因此，高纯度LAM抗原对于结核杆菌的抗体诊断的产品质量至关重要。LAM抗原用于结核杆菌抗原检测抗原检测不但可以用于传染病病原体的发现 和诊断，还能对治疗中的病人进行实时评估，是传染病诊断较推崇的方法。当人体、动物体 内感染了结核杆菌或结核菌在体内繁殖，尿液中可发现脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，由于该检 测不受感染病灶位置(肺、胃、肾、骨、脊髓、脑、膀胱等)的限制。因此，检测尿液中阿拉伯甘 露聚糖(LAM)可能成为结核病诊断的突破性手段。但结核病人尿液中脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)浓度较低(0. 01-lng/mL)，只有较高 灵敏度的免疫学方法或经过其它浓缩、富集方法处理后才能测定，而提高免疫学方法灵敏 度的前提是高纯度、高亲和力抗体，这种抗体的制备需要高纯度脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种简便的获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖 (LAM)的方法，另一目的是提供一种以得到的高纯度LAM抗原为基础制备的结核杆菌抗体 检测试剂和LAM抗原检测试剂。本发明是利用LAM抗原含有3个甘露糖其它杂质(LM、PIM等)只含有一个1个甘 露糖的结构上的差异(图1、图2)，又利用凝集素(如扁小扁豆凝集素)对3个甘露糖分支结 构的亲和力远高于2个甘露糖和1个甘露糖的亲和力特性，使用凝集素进行LAM抗原纯化， 得到纯度达到90 %以上的LAM抗原，更优的可得到纯度达到95 %以上的LAM抗原。上述 纯化得到的高纯度抗原可组成试剂用于LAM抗体检测；另外上述纯化得到的高纯度抗原还 可组成试剂用于尿液LAM抗原的富集、LAM抗体纯化及尿液LAM抗原检测。1、本发明提供的获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的方法，是采用现 有的亲和纯化的方法，其基本步骤包括装柱、上样、洗涤、解离、电泳分离及分析。其中，采 用凝集素(如扁小扁豆凝集素)作为亲和纯化试剂。本发明方法中，所指凝集素包括刀豆凝集素或刀豆素A (Concanavalin ensifomis agglutinin，C0A)；扁豆 疑集素(Lens cuinaris agglutinin, LCA) ；SlliiiM (Pisum satiwum agglutinin)；双花扁豆凝集素(Dolichos bifows agglutinin, DBA)；槐 Μ (Sophora japonica agglutinin, SjA) ； ε Μ (Peanut agglutinin ；PNA) ；^ 胚素(Wheat germ agglutinin, WGA);大豆凝集素(Soybean agglutinin, SBA)等。本发明方法中，所指凝集素尤其是指能与甘露糖、葡萄糖特异结合的凝集素，包 括刀豆凝集素或刀豆素A (Concanavalin ensifomis agglutinin, C0A);扁小扁豆凝集素 (Lens cuinaris agglutinin, LCA)；豌豆凝集素(Pisum satiwum agglutinin, PSA)等。本发明方法中，所指凝集素优选扁小扁豆凝集素(Lens cuinaris agglutinin, LCA )。本发明中，所述LAM抗原的纯化、尿液LAM抗原富集是指通过一般常规方法如亲和 层析或其它固相(磁珠等)方法进行；
本发明中，所述LAM抗体检测是指利用凝集素亲和纯化的高纯度LAM抗原进行血清中 抗体测定；能提高检测试剂的特异性。本发明中，所述LAM抗原检测是指将凝集素亲和纯化的高纯度LAM抗原交联到层 析柱料上，通过大规模纯化获得高纯度抗体，进而建立高灵敏度免疫学方法用于尿液中脂 阿拉伯甘露聚糖抗原检测。本发明中，所述LAM抗原检测还可以是利用凝集素代替抗体并与抗体结合起来进 行检测，可选择使用酶、金溶胶、化学发光、荧光、时间分辨荧光等放大系统进行检测。2、本发明还提供以上述方法得到的高纯度LAM抗原为基础制备的结核杆菌抗体 检测试剂。该结核杆菌抗体检测试剂的基本组成封闭液、洗涤液、金溶胶标记物(羊抗人 IgG金溶胶标记物)、渗滤反应板(含NC膜、吸水纸、LAM抗原、人IgG)。该试剂的主要特征在于渗滤反应板中使用95%以上纯度的LAM抗原包被，LAM抗原 用量根据金溶胶标记物浓度可调整，以0.01-2mg/mL浓度包被为宜，最好佳在0. 05_1 mg/mLo封闭液、洗涤液中含磷酸或TRIS缓冲液，其PH值范围以6. 5-8. 5为宜，最好 7. 0-8. 0之间，最佳7. 2。封闭液、洗涤液中含有适量的表面活性剂吐温-20达到封闭目的，吐温-20的含量 按重量计为封闭液或洗涤液的0. 01-0. 1%，最佳0. 05%。封闭液、洗涤液中还含有适量的聚乙二醇(PEG)增加膜的通透性，提高抗原抗体反 应速度，PEG分子量在2000-40000之间，最好10000-20000，PEG用量按重量计为封闭液或 洗涤液的0. 1_2%，最佳1%。3、本发明还提供以上述方法得到的高纯度LAM抗原为基础制备的LAM抗原检测试 剂。该试剂的基本组成LCA富集柱或LCA富集管及夹心法免疫检测试剂盒。LCA富集柱(LCA -Sepharose 4B)或LCA富集管(LCA包被的免疫磁颗粒)用于样 本的前处理，对尿液中含有的LAM进行富集或浓缩，达到提高检测的灵敏度。LCA -Sepharose 4B 中 S印harose 4B 上交联的 LCA 量不低于 lmg/mL，最好 2 mg/ mL以上；使用免疫磁颗粒含LCA量不低于0. 01mg/mg，最好在0. 03 mg/mg以上。夹心法免疫检测试剂盒由酶标记抗体、反应底物、洗涤液及微量测定反应板组成。夹心法免疫检测试剂盒使用的抗体(酶标记抗体、微量测定反应板包被的抗体)必 须通过亲和层析纯化获得，即利用亲和层析纯化抗体，经过亲和层析获得的抗体对LAM抗 原具有较高的特异性和亲和力，能达到LAM夹心法免疫试剂检测的灵敏度。LAM偶联到固相载体获得亲和层析柱，即亲和层析制备的主要特征在于将实施例 1获得的高纯度LAM偶联到固相载体获得亲和层析柱(LAM-beads)，交联可选择使用溴化氰 活化、过碘酸钠氧化、碳二亚胺偶联等方法连接，最佳采用低浓度过碘酸钠氧化方法。所述低浓度过碘酸钠氧化法指所用过碘酸钠浓度低于常规用量，氧化LAM抗原得 过碘酸钠浓度以ImM-IOmM为宜，最好5mM。
结核杆菌LAM抗原检测试剂制备过程如图6所示。
图1为结核杆菌细胞壁结构。图2为脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)结构。图3为刀豆凝集素-(COA-S^harose 4B, 2-5)与扁小扁豆凝集素(LCA -Sepharose 4B，7_10)用于脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)纯化，纯化后12%SDS_PAGE经银染显色 后的电泳图。1 =Crude为上样液，结核菌细胞壁参考文献方法提取纯化后产物。其中 2，7 =Filtration为过柱液，即上样流出液，
3,4,8,9 =Elute 为洗涤液， 5，10 =Wash为解离液
6 :M分子量标记，从上往下依次为97，66，43，31，20, 14. 4KD 结果显示化学方法纯化的LAM (上样液)中含有大量杂质(包括LM，PIM等)，经过LCA -Sepharose 4B处理，泳道10几乎完全是LAM (仅含有极少量的LM);C0A_S印harose 4B也
5能吸附LAM，但效果不如LCA，尤其是PIM。图4为扁小扁豆凝集素夹心法检测LAM抗原。图5为LAM抗体检测结果。图6为结核杆菌LAM抗原检测试剂制备流程。
具体实施例方式1.获得高纯度结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的方法
技术领域：
本发明发现了一类植物凝集素对结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)具有非常高的亲和 性，藉此建立了结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原凝集素亲和层析的纯化方法，使用该 方法可方便地大量获得纯度达95%以上的LAM抗原。实施例1.
实验材料刀豆凝集素_葡聚糖凝胶4B (COA-Sepharose 4B),扁小扁豆凝集素-葡聚 糖凝胶4B (LCA -Sepharose 4B)购自GE公司(原Pharmacia)，甲基葡萄糖苷购自Sigma公 司，其它试剂购自国药股份(上海)有限公司。脂阿拉伯甘露聚糖(LAM Crude)从结核菌细胞壁参考文献方法提取与纯化，脂 阿拉伯甘露聚糖(LAM Crude)以 20mM Tris-HCl, pH7. 6, 0. 15M NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2平衡，总糖含量(lmg/ml)。亲和纯化过程
1.装柱分别取COA-S印harose 4B及LCA -Sepharose 4B各ImL装入离心柱，以20mM Tris-HCl, pH7. 6, 0. 15M NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2 平衡。2.上样将样品各0.5ml加入，5min后离心，离心出来的液体为过柱液 (Filtration)。3.洗涤以 20mM Tris-HCl, ρΗ7· 6，0. 15Μ NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2 洗涤， 离心2次，分别依次获得Elute 1，Elute 2。4.解离加入 20mM Tris-HCl, ρΗ7· 6，0. 15Μ NaCl, 0· 5Μ 甲基葡萄糖苷，ImM MgCl2, ImM MnCl2 5min后离心，离心出来的液体为解离液(WASH)。5.电泳分离及分析将亲和纯化过程中不同的部分使用12%SDS_PAGE，经银染后 碱显色。泳道说明
1 为上样液为脂阿拉伯甘露聚糖(LAM Crude)/PBS，总糖含量(lmg/ml) 2，7 =Filtration为过柱液，即上样流出液， 3,4,8,9 =Elute 为洗涤液， 5，10 =Wash为洗脱液
6 :M分子量标记，从上往下依次为97，66，43，31，20, 14. 4KD 图3实验结果显示化学方法纯化的LAM(上样液)中含有大量杂质(包括LM，PIM等)，经 过LCA -Sepharose 4B处理，泳道10几乎完全是LAM(仅含有极少量的LM);C0A_S印harose 4B也能吸附LAM，但效果不如LCA，尤其是PIM。一般方法获得的粗提脂阿拉伯甘露聚糖LAM(LAM Crude)(图3 .泳道1，Crude)， 纯化后的LAM抗原(图3 .泳道10 WASH)。经扫描灰度计算纯度，粗提脂阿拉伯甘露聚糖LAM纯度仅占总糖量的30%，经该方法纯化后LAM抗原纯度能达到95%以上。实施例2.
实验材料扁小扁豆凝集素(LCA)从扁小扁豆自制纯化，其它试剂购自国药股份(上 海)有限公司。脂阿拉伯甘露聚糖(LAMCrude)以 20mM Tris-HCl, pH7. 6, 0. 15M NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2平衡液平衡；
扁小扁豆凝集素(LCA)金溶胶标记常规柠檬酸三纳方法制备胶体金，并选择最佳标 记物浓度，进行扁小扁豆凝集素标记，获得扁小扁豆凝集素(LCA)金溶胶标记物(不含蔗 糖)；
扁小扁豆凝集素(LCA)固定将扁小扁豆凝集素(LCA) lmg/mL点在0. 6um孔径的硝 酸纤维素膜(NC)条上(5mmX3mm)，干燥后，以 20mM Tris-HCl, pH7. 6，0. 15M NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2 3%BSA, 0. 05%TWEEN-20 封闭； 夹心法检测
在96孔微孔板上，将20ul扁小扁豆凝集素(LCA)金溶胶标记物分别与20ul平衡液、 20ul脂阿拉伯甘露聚糖(LAM Crude)总糖含量0. lmg/ml、20ul脂阿拉伯甘露聚糖(LAM Crude) lmg/ml混合，将三根硝酸纤维素膜(NC)条(5mmX 3mm)分别插入孔中，利用层析法显色。图4实验结果显示脂阿拉伯甘露聚糖0. Ulmg/ml均显示斑点，结果说明，由于 LAM抗原中存在3个甘露糖分支结构有两个，能结合2个扁小扁豆凝集素，形成三明治结构。 由于尽管以上LCA检测存在非特异结合(许多菌细胞壁的脂多糖中含有甘露糖)，
实验结果提示但使用单一的扁小扁豆凝集素夹心法可以用于LAM抗原的检测。2.以高纯度LAM抗原为基础制备的结核杆菌抗体检测试剂
检测试剂组成封闭液、洗涤液、金溶胶标记物(羊抗人IgG金溶胶标记物)、渗滤反应 板(含NC膜、吸水纸、LAM抗原、人I gG )。试剂的主要特征在于渗滤反应板中使用95%以上纯度的LAM抗原包被，LAM抗原用 量根据金溶胶标记物浓度调整，以0. 01-2mg/mL浓度包被为宜，最好佳在0. 05-1 mg/mL。封闭液、洗涤液中含磷酸或TRIS缓冲液，其PH值范围以6. 5-8. 5为宜，最好 7. 0-8. 0之间，最佳7. 2。封闭液、洗涤液中含有适量的表面活性剂吐温-20达到封闭目的，用量在 0. 01-0. 1% 之间，最佳 0. 05%。封闭液、洗涤液中还含有适量的聚乙二醇(PEG)增加膜的通透性，提高抗原抗体反 应速度，PEG分子量在2000-40000之间，最好10000-20000，PEG用量在0. 1-2%之间，最佳1%。金溶胶标记物可按一般制备方法配制。试剂的使用方法是，在渗滤反应板中加封闭液4滴，加血清50uL，加洗涤液4滴，加 金溶胶3滴，加洗涤液4滴，观测结果。由于一般方法纯化的LAM抗原仅有50%纯度，含杂大量(近30-50%)脂甘露聚糖 (LM)，磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)，LM、PIM作为非属特异性抗原会干扰反应，因此，使用粗 提LAM抗原检测会使LAM抗体检测的特异性降低。试剂使用了本利用实例1获得的95%以上纯度LAM抗原作为检测抗体的抗原使检测的特异性提高。实施例3.
实验材料血清184份，其中，确认结核病的血清78份，非结核病人血清106份。羊抗人IgG购自Sigma公司，柠檬酸三钠、氯金酸、碳酸钾、氯化钠、牛血清白蛋白 (BSA)、吐温-20、聚乙二醇等试剂购自国药上海化学试剂有限公司，0. 65um硝酸仟维素膜 NC购自AMERSHAM公司。金溶胶、羊抗人IgG金溶胶标记物渗滤反应盒由厦门波生生物技 术有限公司提供，实验过程是
1.封闭液配制0.1%BSA/ 0. 05%吐温-20/1%聚乙二醇PH7. 2磷酸缓冲液(PBS)，
2.洗涤液配制0.05%吐温-20/1%聚乙二醇PH7. 2磷酸缓冲液(PBS)，
3.金溶胶制备、羊抗人IgG金溶胶标记物配制方法将0.01%氯金酸IOOmL煮沸，加入 1%柠檬酸三钠lmL，冷却。按常规方法碳酸钾调节pH，加入10%NaCl判断并选择抗体最佳 标记浓度，确定10ug/mL为宜，在IOOmL金溶胶中加入碳酸钾后，加入Img羊抗人IgG，混合 后力口入 10mg/mL BSA 5mL。4.将0. 65um硝酸仟维素膜裁成1. 5 X 1. 5cm正方形，按常规生产方法装入含吸水 纸的渗滤反应盒中，在渗滤反应盒硝酸仟维素膜中间点上混合或纯化LAM抗原及阳性对照 点(纯化人IgG)。5.检测过程加封闭液4滴，加血清50uL，加洗涤液4滴，加金溶胶3滴，加洗涤 液4滴，观测结果。6.检测结果对确认结核病的血清78份，非结核病人血清106份的检测如表1 : 表1确认结核病的血清78份，非结核病人血清106份的检测结果
权利要求
一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)纯化方法，是采用现有的亲和纯化的方法，其基本步骤包括装柱、上样、洗涤、解离、电泳分离及分析；其特征在于采用凝集素作为亲和纯化试剂。
2.根据权利要求1所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法，其特征在于所述凝集 素为刀豆凝集素或刀豆素A、扁豆凝集素、豌豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、花生凝 集素、麦胚素或大豆凝集素。
3.根据权利要求1所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法，其特征在于所述凝集 素是指能与甘露糖、葡萄糖特异结合的凝集素，包括刀豆凝集素或刀豆素A、扁小扁豆凝 集素或豌豆凝集素。
4.一种由权利要求1、2或3所述方法纯化得到的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原，其 浓度为90 %以上。
5.一种如权利要求4所述LAM抗原在制备LAM抗体检测用试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述试剂的基本组成包括封闭液、洗涤 液、金溶胶标记物、渗滤反应板；其中渗滤反应板中使用90%以上纯度的LAM抗原包被，LAM抗原用量根据金溶胶标记物浓 度调整，浓度包被为0. 01-2mg/mL ；封闭液、洗涤液中含磷酸或TRIS缓冲液，其PH值范围为6. 5-8. 5 ；封闭液、洗涤液中含有适量的表面活性剂吐温-20，吐温-20重量含量为0. 01-0. 1% ；封闭液、洗涤液中还含有聚乙二醇，聚乙二醇分子量在2000-40000之间，聚乙二醇用 量按重量计为0. 1-2%。
7.一种如权利要求4所述LAM抗原在制备尿液LAM抗原富集、LAM抗体纯化及尿液LAM 抗原检测用试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述试剂的基本组成包括LCA富集柱或 LCA富集管，及夹心法免疫检测试剂盒，这里，LCA为扁豆凝集素；其中LCA富集柱或LCA富集管用于样本的前处理，对尿液中含有的LAM进行富集或浓缩；LCA富集柱中S印harose 4B上交联的LCA量不低于lmg/mL ；LCA富集管中使用的免疫 磁颗粒含LCA量不低于0. 01mg/mg ；夹心法免疫检测试剂盒由酶标记抗体、反应底物、洗涤液及微量测定反应板组成；夹心法免疫检测试剂盒使用的抗体包括酶标记抗体、微量测定反应板包被的抗体，通 过亲和层析纯化获得，即利用亲和层析纯化抗体，经过亲和层析获得的抗体对LAM抗原具 有较高的特异性和亲和力，能达到LAM夹心法免疫试剂检测的灵敏度；其中，亲和层析纯化 用的亲和层析柱由权利要求4所述的高纯度LAM偶联到固相载体获得。
全文摘要
本发明属于医疗技术领域，具体为一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的纯化方法及结核杆菌诊断试剂。本发明利用LAM抗原含有3个甘露糖其它杂质(LM、PIM等)只含有一个1个甘露糖的结构上的差异，又利用凝集素(如扁小扁豆凝集素)对3个甘露糖分支结构的亲和力远高于2个甘露糖和1个甘露糖的亲和力特性，使用凝集素进行LAM抗原纯化，得到纯度达95%以上的LAM抗原。上述纯化得到的高纯度抗原可组成试剂用于LAM抗体检测；上述纯化得到的高纯度抗原还可组成试剂用于尿液LAM抗原的富集、LAM抗体纯化及尿液LAM抗原检测。
文档编号C08B37/00GK101974099SQ20101054368
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者丁元生, 崔振玲, 王洁, 胡忠义, 金瑞良, 陆俊梅, 黄晓辰 申请人:上海市肺科医院;上海积彩医疗器械有限公司