专利名称：一种用于骨组织再生的生物支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种外科手术用医用材料，特别涉及一种医学外科手术中骨组织再生的生物支架。
背景技术：
骨缺损、骨不连是骨科治疗的一个难题，传统的骨缺损修复方法是自体骨植，虽然可以取得满意的疗效，但必须牺牲自体健康组织，且来源有限。目前流行的同种异体骨植入术同样也存在来源困难、价格高昂、传播疾病及多次手术、免疫排斥等弊端，而不能作为解决问题的最佳方法。支架材料作为人工细胞外基质承载种子细胞是组织工程研究的重要内容之一。骨组织工程用支架材料一般需要满足以下几个要求生物相容性好；易成型，可以根据需要加工成各种形状和大小；良好的降解性，降解产物对人体无害；具有骨传导性；适合的孔径大小，保证新生骨组织的长入和营养物质的运输供应以及一定的机械强度，对抗周围组织对缺损部位的压迫以及防止纤维组织的长入。对于骨组织修复具有潜在应用价值的生物材料包括陶瓷制品(羟磷灰石和磷酸三钙)和聚合物(a_羟基酸，乳酸聚合物，甘油酸聚合物等)。但是这些陶瓷制品作为支架材料易碎并且其降解产物降低局部的PH值，进而加速聚合物降解速度导致炎症发生。近年来，以壳聚糖为支架的材料在骨组织工程中的应用正受到越来越多的关注。壳聚糖是一种理想的高分子生物材料，它具有机体反应小、良好的生物降解性、无毒、来源广泛、价格便宜、天然抗菌性以及具有可任意塑性如多孔结构的特点， 使其能够适合细胞的内在生长以及骨的传导，在组织工程中显示出巨大的应用价值。因此。 以壳聚糖为支架的材料在骨组织工程中的应用正受到越来越多的关注。但是，目前现有的壳聚糖多只能作为支架材料，而不能作为携载活性生长因子的载体，并且多种细胞在其表面及内部不能很好的生长，从而不能很好的促进骨再生。
发明内容
本发明的目的在于克服现有材料支架的缺陷，研制一种可携载骨生长诱导因子和活性细胞、在物理学和生物化学特性上都适合骨修复的壳聚糖复合物的生物支架。一种用于骨组织再生的生物支架，其特征在于所述生物支架由壳聚糖聚合物管和充填在管内的壳聚糖聚合物构成，所述壳聚糖聚合物由天然壳聚糖粉、明胶粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二钠粉剂；所述制备方法具体包括合成前原材料的准备阶段和合成阶段；在合成前原材料的准备阶段，需要利用醋酸溶液将天然壳聚糖粉溶解成质量浓度为 (1-2)%的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为(1. 5-2)%的明胶溶液，利用医用酒精将京尼平溶液稀释成质量浓度为(0. 3-0. 7)%京尼平-酒精溶液，用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为(0. 5-0. 9) g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段中使天然壳聚糖分别与京尼平和甘油-2-磷酸二钠实现化学交链和离子交联，从而获得凝胶状的壳聚糖聚合物。
所述合成前原材料的准备阶段具体为
(1)利用质量浓度为0. 4%的醋酸溶液，将天然壳聚糖粉溶解成质量浓度为1. 85%的壳聚糖溶液，然后加热至35° C，搅拌2-3天后，过滤溶液并在110° C下高温消毒待用；(2) 然后，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1.8%的溶液，并在110° C下高温消毒待用；(3) 之后，利用体积浓度为75%的医用酒精将京尼平溶液稀释成质量浓度为0. 5%的京尼平-酒精溶液；(4)最后，用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0. 8g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液，并加热到50° C待用。所述壳聚糖聚合物的合成步骤包括
步骤一、将配制好的壳聚糖溶液、明胶溶液与纯水混合形成混合液，上述三者是按照一定体积比进行混合的，所述体积比一般为(3-6) (1-5);步骤二、在搅拌器上搅拌上述混合液20-30分钟，以使天然壳聚糖与明胶混勻，然后加热至35° C ；步骤三、然后将稀释好的京尼平_酒精溶液加入步骤二所形成混合液中，所述京尼平_酒精溶液与步骤二所形成混合液之间的体积比为1 (20-50)，之后搅拌30-60分钟使混勻，以实现化学交联过程；步骤四完成步骤三之后，再将配制好的甘油-2-磷酸二钠溶液加入，所述甘油-2-磷酸二钠溶液与步骤三所形成液体的之间的体积比为1:20-200，搅拌5分钟使混合均勻，实现离子交联过程；步骤五将完全交联后形成的壳聚糖聚合物放入37° C温箱待用。在壳聚糖聚合物的合成阶段中，步骤一中的体积比为3:1:2 ；步骤三中的体积比为1:35，步骤四中的体积比为1:120。本发明的生物支架制造作过程简单，所用材料天然无毒，来源方便，可用于饮食、 医疗和医学生物工程，并且利用本发明的方法所生产的壳聚糖聚合物稳定性好、无毒副作用，可作为医学生物工程支架及携载活性生长因子的载体，为一些神经外科、骨科等难治性疾病提供了条件。
图1为本发明壳聚糖聚合物的流变学实验曲线； 图2为本发明壳聚糖聚合物的药理学释放特性实验曲线； 图3为对本发明壳聚糖聚合物样品进行扫描观测的电镜扫描图片； 图4为人骨髓基质细胞在DMEM壳聚糖聚合物培养基中生长的倒置像差显微镜下观察的2D结构；
图5为人骨髓基质细胞在DMEM壳聚糖聚合物培养基中生长的共聚焦激光扫描显微镜观察的3D结构；
图6为动物体内实验的对照实验实验照片。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明做进一步的描述。本发明中用于骨组织再生的生物支架，该生物支架由壳聚糖聚合物管和充填在管内壳聚糖聚合物构成，所述壳聚糖聚合物由天然壳聚糖粉、明胶粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二钠粉剂制备而成。在制备壳聚糖聚合物过程中具体包括合成前原材料的准备阶段和壳聚糖聚合物的合成阶段。
在合成前原材料的准备阶段，(1)首先利用质量浓度为0. 4%的醋酸溶液，将天然壳聚糖粉溶解成质量浓度为(1_2)%的壳聚糖溶液，然后加热至35° C，搅拌2-3天后，过滤溶液并在110° C下高温消毒待用；(2)然后，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为(1. 5-2)% 的溶液，并在110° C下高温消毒待用；(3)利用体积浓度为75%的医用酒精将京尼平溶液稀释成质量浓度为(0. 3-0. 7) %的京尼平-酒精溶液；(4)再用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为(0.5-0. 9) g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液，并加热到50° C待用。所述壳聚糖聚合物的合成阶段包括如下步骤
步骤一、将壳聚糖溶液、明胶溶液与纯水混合形成混合液，上述三者是按照一定体积比进行混合的，所述体积比一般为(3-6) :1: (1-5)；
步骤二、在搅拌器上搅拌上述混合液20-30分钟，以使天然壳聚糖与明胶混勻，然后加热至35° C;
步骤三、然后将稀释好的京尼平-酒精溶液加入步骤二所形成混合液中，所述京尼平_酒精溶液与步骤二所形成混合液之间的体积比为1 : (20-50)，之后搅拌30-60分钟使混勻，以实现化学交联过程；
步骤四完成步骤三之后，再将配制好的甘油-2-磷酸二钠溶液加入，所述甘油-2-磷酸二钠溶液与步骤三所形成液体的之间的体积比为1:20-200，搅拌5分钟使混合均勻，实现离子交联过程；
步骤五将完全交联后形成的壳聚糖聚合物放入37° C温箱待用。本发明的优选实施例中，在原材料的准备阶段中，壳聚糖粉被溶解成质量浓度为 1. 85%的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1. 8%的溶液，将京尼平溶液稀释成质量浓度为0. 5%的京尼平-酒精溶液；用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0. 8g/ml 的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段，各步骤中的体积比分别按照一定优选比例进行混配。步骤一中的体积比优选为3:1:2 ；步骤三中的体积比优选为1:35，步骤四中的体积比优选为1:120。在本发明的一个实施例中，在原材料的准备阶段中，壳聚糖粉被溶解成质量浓度为1%的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1. 5%的溶液，将京尼平溶液稀释成质量浓度为0. 5%的京尼平-酒精溶液；用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0. 8g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段，各步骤中的体积比分别按照一定优选比例进行混配。步骤一中的体积比优选为4:1:3 ；步骤三中的体积比优选为1:20，步骤四中的体积比优选为1:20。在本发明的第二实施例中，在原材料的准备阶段中，壳聚糖粉被溶解成质量浓度为1%的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1. 5%的溶液，将京尼平溶液稀释成质量浓度为0. 6%的京尼平-酒精溶液；用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0. 9g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段，各步骤中的体积比分别按照一定优选比例进行混配。步骤一中的体积比优选为3:1:2 ；步骤三中的体积比优选为1:40，步骤四中的体积比优选为1:100。在本发明的第三实施例中，在原材料的准备阶段中，壳聚糖粉被溶解成质量浓度为1. 85%的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1. 8%的溶液，将京尼平溶液稀释成质量浓度为0. 5%的京尼平-酒精溶液；用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0. Sg/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段，各步骤中的体积比分别按照一定优选比例进行混配。步骤一中的体积比优选为3:1:2 ；步骤三中的体积比优选为1:35，步骤四中的体积比优选为1:120。
按照本发明的方法壳聚糖聚合物为凝胶状的胶体，因此又称壳聚糖聚合物水凝胶，其在许多领域都具有重要的应用，尤其是在医学领域常常用于骨组织的再生。在制备好壳聚糖聚合物之后，按照常规的方法将壳聚糖聚合物制成所需形状的管，并将壳聚糖聚合物充填在管内，从而形成本发明的生物支架。充填在管内的壳聚糖聚合物可作为骨组织再生的载体。为了验证按照本发明的方法制成的壳聚糖聚合物(水凝胶)作为生物支架的物理学特点、作为生物活性物质载体的生化学特点和能促进细胞分化增值的生物学特点，本发明设计了多组实验，实验中采用的壳聚糖聚合物是按照本发明优选实施方式的配比来制备的。(1)物理特性检测
胶体的流变力学特点决定了胶体的强度和交联时间、药物和活性因子的植入时间、以及缓释速率及胶体自体溶解吸收时间，为了验证本发明的壳聚糖聚合物的物理特性，在体外进行了流变学检测、载体特性检测和电子显微镜表层扫描三项实验。a.流变学检测
图1为流变学实验(rheology )曲线，图中G’和G”分别为刚性模量和粘弹性模量， 横轴为交联时间。根据流变学试验数据显示，利用本发明方法所制备的壳聚糖聚合物为凝胶状，其交联时间和成胶强度可以控制，交联成功后胶体强度稳定。本发明方法在成胶时的交联时间在3800秒左右，利于控制载体药物植入、胶体强度在IOOOPa左右，有利于细胞生长，稳定性最佳，因此完全符合载体设计要求。b.载体特性(vector)检测
本实验采用ELISA检测方法，图2示出了药理学释放特性(Elisa test)实验曲线，从图2中可以看出，含不同浓度rhBMP-2 (0. 5ug/ml、lug/ml、5ug/ml)的壳聚糖聚合物(水凝胶)，作为释放载体的三条不同浓度的释放曲线，X轴线是时间，Y轴线是实时药物释放量。 例如，体积浓度为5ug/ml的rhBMP-2 (人骨形成蛋白2)在水凝胶内的体外药物释放中，体外浸泡5d时，含rhBMP-2的水凝胶在0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS)中的rhBMP-2释放量为 3. 64% 士 0. 49%，表现为爆发性释放，随后呈持续缓慢稳定释放，28天时达6. 40% 士 0. 55%， 同时随着载体药物浓度的增加，释放浓度与载体内原始药物浓度呈正相关，单位时间内的释放量增加，不需要增加任何缓释剂，缓释时间达到30天或更长。其它浓度的rhBMP-2(人骨形成蛋白2)也呈现出大体相同的趋势，这说明本发明的壳聚糖聚合物载体特性良好，符合要求。c.电子显微镜扫描(SEM)
利用电子显微镜对本发明的壳聚糖聚合物样品进行扫描观测，以便观测胶体表层形态特点。图3为电镜扫描图片，从电镜照片可以看出，本发明的壳聚糖聚合物表面具有多孔结构，没有呈现出固定的网孔形态，表面并不光滑，呈现块状结构，这是由于壳聚糖聚合物中在酸性溶液中交联，容易形成氢键，呈现出网状，这一结构有利于对细胞的吸附、增值和药物释放。同时含有大量水分子，利于液体交换，便于载体中活性物质的释放和细胞生长需要的营养、代谢物质的供给与交换，同时为细胞生长提供支架。从图4中还可以看出，本发明的壳聚糖聚合物样品网状结构更清晰、均勻一致，平均孔径约为500um士80um，结构点的破损点少，表面更加光滑，利于细胞粘附、生长和增值。(2)体外生物学特性检测
为了解多种细胞在DMEM壳聚糖聚合物(水凝胶)培养基中的生长特点，验证被载的活性物质在本发明的壳聚糖聚合物中能够分化、增值，本发明将8种不同种类的细胞系细胞(人神经细胞、人骨髓基质细胞、人牙髓细胞、人成纤维细胞、人脂肪细胞、鼠神经细胞)置于由本发明的壳聚糖聚合物制成的DMEM培养基中，使这些细胞在培养基中进行分化和增值， 在不同时间段对其型态、数量、增值速率等方面进行观察，以期得知其与普通培养基之间的差异。图4和图5示出的是其中一种细胞(人骨髓基质细胞)的观察图片。图4为倒置像差显微镜下观察生长细胞的2D结构，图5为共聚焦激光扫描显微镜观察生长细胞的3D 结构。从图4和图5可以看出，细胞生长形态正常，分化活跃，增值速率明显快于普通培养基，胞核形态、染色正常，细胞蛋白骨架结构无缺陷，证明此种培养基能加速细胞分化、增值，而不会产生变异。(3)动物体内实验
为了验证本发明的生物支架在在促进骨组织愈合和再生方面的有效性，在新西兰大白兔体内做了实验，其中将大白兔桡骨中断1. 5cm，并在此基础上将模型分组要求分别植入挠骨中断缺损区，三个月后观察成骨情况。动物模型分组情况
a)空白组一般壳聚糖支架
b)对照组本发明的壳聚糖聚合物生物支架
c)实验组本发明的壳聚糖聚合物生物支架+Bmp-2+骨髓基质细胞
说明，骨形态发生蛋白(BMP)是具有骨诱导活性的骨形成促进因子，是骨组织工程中最常用的生长因子，其作用的靶细胞是未分化的间充质细胞，包括肌肉中、血管周围的间充质细胞。BMP具有两种成骨功能增加类成骨细胞的成骨特性及通过骨原细胞如骨髓干细胞和间充质细胞诱导成骨细胞的表型表达。临床实验证明重组人BMP-2(rhBMP-2)在一定程度上能促进骨愈合。但BMP在骨内的含量极微，而外源性BMP来源有限、成本较高，且在体内迅速降解或随体液扩散，不能均勻、持久地分布在骨缺损部位，难以发挥骨诱导作用。因此，实验中加入的充填在管内的壳聚糖聚合物中加入Bmp-2+和骨髓基质细胞，另一方面也是为了验证本发明壳聚糖聚合物作为载体的作用。从图6可以看出，在不利用本发明的壳聚糖聚合物生物支架的a组，缺损区的骨组织基本没有再生，在利用了本发明壳聚糖聚合物生物支架的b组和c组，缺损区明显变小， 说明骨组织能够再生，尤其是c组，骨组织的生长最为明显，在三个月后缺损区基本愈合， 这也证明了本发明中壳聚糖聚合物能够作为骨组织细胞再生的载体，具有很好的生物活性，能为多种细胞提供满意的生长环境。从以上实验可以看出，本发明的壳聚糖聚合物符合生物支架的物理学特点和生物活性物质载体的生化学特点，细胞在本发明的壳聚糖聚合物培养基中分裂、增值速度明显强于普通培养基，并且本发明的生物支架能够促进骨组织的再生和骨折的愈合。
本专利申请是通过几个具体实施例进行说明的，在不脱离本专利申请范围的情况下，还可以对本专利申请进行各种变换及等同替代。因此，本专利申请不局限于所公开的具体实施例，而应当包括落入本专利申请权利要求范围内的全部实施方式。
权利要求
1.一种用于骨组织再生的生物支架，其特征在于所述生物支架由壳聚糖聚合物管和充填在管内的壳聚糖聚合物构成，所述壳聚糖聚合物由天然壳聚糖粉、明胶粉、京尼平溶液 、甘油-2-磷酸二钠粉剂；所述制备方法具体包括合成前原材料的准备阶段和合成阶段；在合成前原材料的准备阶段，需要利用醋酸溶液将天然壳聚糖粉溶解成质量浓度为(1_2)% 的壳聚糖溶液，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为(1. 5-2)%的明胶溶液，利用医用酒精将京尼平溶液稀释成质量浓度为(0. 3-0. 7) %京尼平-酒精溶液，用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为(0. 5-0. 9)g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液；在壳聚糖聚合物的合成阶段中使天然壳聚糖分别与京尼平和甘油-2-磷酸二钠实现化学交链和离子交联，从而获得凝胶状的壳聚糖聚合物。
2.根据权利要求1所述的用于骨组织再生的生物支架，其特征在于，所述合成前原材料的准备阶段具体为(1)利用质量浓度为0.4%的醋酸溶液，将天然壳聚糖粉溶解成质量浓度为1. 85%的壳聚糖溶液，然后加热至35° C，搅拌2-3天后，过滤溶液并在110° C下高温消毒待用；(2)然后，用纯水将明胶粉溶解成质量浓度为1.8%的溶液，并在110°C下高温消毒待用；(3)之后，利用体积浓度为75%的医用酒精将京尼平溶液稀释成质量浓度为0.5%的京尼平_酒精溶液；(4)最后，用纯水将甘油-2-磷酸二钠配成浓度为0.8g/ml的甘油-2-磷酸二钠溶液， 并加热到50° C待用。
3.根据权利要求1或2所述的用于骨组织再生的生物支架，其特征在于，所述壳聚糖聚合物的合成步骤包括步骤一、将配制好的壳聚糖溶液、明胶溶液与纯水混合形成混合液，上述三者是按照一定体积比进行混合的，所述体积比为(3-6) :1: (1-5)；步骤二、在搅拌器上搅拌上述混合液20-30分钟，以使天然壳聚糖与明胶混勻，然后加热至35° C;步骤三、然后将稀释好的京尼平-酒精溶液加入步骤二所形成混合液中，所述京尼平-酒精溶液与步骤二所形成混合液之间的体积比为1 (20-50)，之后搅拌30-60分钟使混勻，以实现化学交联过程；步骤四完成步骤三之后，再将配制好的甘油-2-磷酸二钠溶液加入，所述甘油-2-磷酸二钠溶液与步骤三所形成液体的之间的体积比为1:20-200，搅拌5分钟使混合均勻，实现离子交联过程；步骤五将完全交联后形成的壳聚糖聚合物放入37° C温箱待用。
4.根据权利要求3所述的用于骨组织再生的生物支架，其特征在于，在壳聚糖聚合物的合成阶段，步骤一中的体积比为3:1:2;步骤三中的体积比为1:35，步骤四中的体积比为 1:120。
全文摘要
本发明涉及一种外科手术用医用材料，特别涉及一种医学外科手术中骨组织再生的生物支架。所述生物支架由壳聚糖聚合物管和充填在管内的壳聚糖聚合物构成，所述壳聚糖聚合物由天然壳聚糖粉、明胶粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二钠粉剂；壳聚糖聚合物的制备方法具体包括合成前原材料的准备阶段和合成阶段；在壳聚糖聚合物的合成阶段中使天然壳聚糖分别与京尼平和甘油-2-磷酸二钠实现化学交链和离子交联，从而获得凝胶状的壳聚糖聚合物。本发明的生物支架制造过程简单，所用材料天然无毒，来源方便，并且利用本发明的方法所生产的壳聚糖聚合物稳定性好，可作为医学生物工程支架及携载活性生长因子的载体。
文档编号C08J3/24GK102327643SQ20111024250
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者赵文 申请人:赵文