专利名称：生物分子连接的仿生支架的制作方法
生物分子连接的仿生支架 相关申请的交叉引用本申请是美国专利申请号11/668， 448的部分继续申请， 并要求2007年6月5号提交的美国临时专利申请序列号
60/______(Attorney Docket No。061818-02-5053 PR01), 2006年
11月30日提交的美国临时专利申请No。 60/861， 780， 2006年6月9 日提交的No。 60/804， 350的优先权，其在此通过引用整体并入本文 用于所有目的。
对于政府资助的感谢本申请国家健康委员会的资助，政府资助项目拨款(合同) 号为HL078534。政府对于本发明有一定的权利。
背景技术：
本领域需要能够取代或改善受试者生物学功能的组合物。 本领域还需要可促进受试者新組织生长或取代损坏组织的组合物。本 文所描述的发明解决了这些及其他需要。
发明概述在第一方面，本发明提供了含有第一纤维性聚合物支架和 生物分子的组合物，其中所述生物分子直接或通过连接物非共价或共 价连接于所述第一纤维性聚合物支架。在示例性实施方案中，所述生 物分子是抗血小板剂。在一个示例性的实施方案中，所述第一纤维性 聚合物支架的一条或多条纤维是排列对齐的。在一个示例性的实施方 案中，其中第一纤维性聚合物支架具有选自如下范围的长度约 0. Olcm到约20cm,约0. 05cm到约5cm，约0. 5cra到约5cm，约lcm
6到约5cm,约2cm到约5cm，约lcm到约3cm，约2cm到约10cm和约 5cm到约15cm。在另 一个示例性的实施方案中，该组合物具有选自如 下形状的形状薄片，管，填充管和杆。在另一个示例性的实施方案 中，该组合物具有选自管，填充管和杆中的形状。在另一个示例性的 实施方案中，该组合物为杆状。在另一个示例性的实施方案中，所述 组合物具有管或填充管的形状。在另一个示例性的实施方案中，所述 第一纤维性聚合物支架基本上沿着选自纵向和圆周的方向排列。在另 一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架具有接缝。在另一 个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架是无缝的。在另一个 示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物是整体形成的。在另一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架的 纤维中的至少一种包括选自如下的聚合物或亚基脂肪族聚酯，聚环 氧烷烃，聚二甲基硅氧烷，聚己酸内酯，聚赖氨酸，胶原，层粘连蛋 白，纤连蛋白，弹性蛋白，藻酸盐，纤维蛋白，透明质酸，蛋白聚糖， 多肽及其组合。在另一个示例性的实施方案中，该脂肪族聚酯选自如 下乳酸(D-或L-),丙交酯，聚(乳酸)，聚(丙交酯)，羟基乙酸， 聚(羟基乙酸)，聚(乙交酯)，乙交酯，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)， 聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)及其組合。在另 一个示例性的实施方案中， 第一支架纤维性聚合物纤维的至少一种包括聚(丙交酯-共聚-乙交酯) (PLGA)。在一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成 员腺苷二磷酸(ADP)拮抗剂或P山2拮抗剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制 剂、腺苷再摄取抑制剂、维生素K拮抗剂、肝素、肝素类似物、直接 凝血酶抑制剂、糖蛋白1IB/III抑制剂、抗凝血酶、以及可药用盐、 异构体、对映体、包括无定形形式的多晶形、溶剂化物、水合物、共 结晶、络合物、活性代谢物、活性衍生物和修饰物、其前药等。在另 一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是直接凝血酶抑制剂。在另一 个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素、比 伐卢定、重组水蛭素、地西卢定、阿加曲班、达比加群、达比加群酯、
7美拉加群、希美加群、其前药及类似物。在另一个示例性的实施方案
中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素、比伐卢定、重组水蛭素、 地西卢定、其前药及类似物。在另一个示例性的实施方案中，抗血小 板剂包括凝血酶结合位点。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板 剂包括蛋白序列，其是选自如下的成员FPRP和LYEEPIEEFDGN。在另 一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架是选自如下的成员 杆、管和填充管。在另一个示例性的实施方案中，所述生物分子或抗血小板 剂没有通过连接物而共价结合到第一纤维性聚合物。在另一个示例性 的实施方案中，本发明提供了具有选自如下结构式成员的组合物
a-x——生物分子 (I) 或
a—x—抗血小板剂 (la) 其中A是第一纤维性聚合物支架，X是选自如下的成员共价键，0， S， C(O), C(O)O， C(O)S， C(O)NH， S (0) ， S(0)2， S(0)2NR*， C(0)NR*， NH或NR"其中11*是选自如下的成员取代的或未被取代的烷基， 取代的或未被取代的杂烷基，取代的或未被取代的环烷基，取代的或 未被取代的杂环烷基，取代的或未被取代的芳基，取代的或未被取代 的杂芳基。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的 成员肝素，水蛭素，比伐卢定，重組水蛭素，地西卢定，阿加曲班， 达比加群，达比加群酯，美拉加群，希美加群，其前药及类似物。在 另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素， 水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢定。在另一个示例性 的实施方案中，抗血小板剂包括凝血酶结合位点。在另一个示例性的 实施方案中，抗血小板剂包括蛋白序列，其是选自如下的成员FPRP 和LYEEPIEEFDGN。在另 一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物 支架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支 架是整体形成的。在另 一个示例性的实施方案中，所述組合物包括至少一个具有
8选自如下的结构的部分
<formula>formula see original document page 9</formula>
其中符号^/vw^表示显示的部分被连接到聚合物的剩余部分的点，A1
是第一纤维性聚合物支架的亚单位。在另一个示例性的实施方案中，
A1 是通过单体/系列单体的聚合形成的亚单位。在另一个示例性的实 施方案中，A1 是选自如下的成员 一个或多个此处所述的单体或亚 单位。在另一个示例性的实施方案中，A1是选自如下的成员脂族 聚酯，聚亚烷基氧化物，聚二甲基硅氧烷，聚乙烯醇，聚赖氨酸，胶 原蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白，藻酸盐，纤维蛋白，透 明质酸，蛋白聚糖，多肽及其组合。在另一个示例性的实施方案中， A1 是官能化的丙交酯部分。在另一个示例性的实施方案中，所述官 能化的丙交酯部分在侧链甲基被官能化。在另 一个示例性的实施方案 中，X衍生自第一纤维性支架上的互补反应性基团与抗血小板剂的反 应。在本文中提供了对于这些互补反应性基团的描述。在另一个示例 性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素，水蛭素类 似物，比伐卢定，重組水蛭素或地西卢定。在另一个示例性的实施方 案中，抗血小板剂包括凝血酶结合位点。在另一个示例性的实施方案 中，抗血小板剂包括蛋白序列，其是选自如下的成员FPRP和 LYEEPIEEFDGN。在另一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支 架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架 是整体形成的。在另一个示例性的实施方案中，所述组合物包括至少一个具有 结构选自如下结构式成员的部分HG-x- 生物分子 HC-X- 抗血小板刑
=0 =0
^ (If) 或^/wv^ (Ig)
其中符号^vw^表示显示的部分被连接到聚合物的剩余部分的点，X是
选自如下的成员:共价键，0， S， C(O)， C(O)O, C(0)S， C(O)NH, S (0)， S(0)" S(0)2NR*， C(0)NR*， NH或NR* ,其中R*是选自如下的成员 取代的或未被取代的烷基，取代的或未被取代的杂烷基，取代的或未 被取代的环烷基，取代的或未被取代的杂环烷基，取代的或未被取代 的芳基，取代的或未被取代的杂芳基。在另一个示例性的实施方案中， X是选自如下的成员C(O)NH和C(0)NR*。在另一个示例性的实施方 案中，抗血小板剂是选自如下的成员肝素，水蛭素，比伐卢定，重 组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达比加群，达比加群酯，美拉加群， 希美加群，其前药及类似物。在另一个示例性的实施方案中，抗血小 板剂是选自如下的成员水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水 蛭素或地西卢定。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂包括凝 血酶结合位点。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂包括蛋白 序列，其是选自如下的成员FPRP和LYEEPIEEFDGN。在另一个示例性 的实施方案中，X连接到水蛭素的C末端。在另一个示例性的实施方 案中，X连接到水蛭素的C末端的氨基酸。在另一个示例性的实施方 案中，X通过天冬氨酸或谷氨酸部分的侧链连接到水蛭素。在另一个 示例性的实施方案中，X通过天冬氨酸部分的侧链连接到水蛭素。在 另一个示例性的实施方案中，X连接到水蛭素的氨基酸部分，该部分 是选自如下的成员野生型肽序列的D5， E8， E17， D33， E35， E43， D53， D55， E57， E58， E61， E62和Q65。在另一个示例性的实施方案 中，第一纤维性聚合物支架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中， 第一纤维性聚合物支架是整体形成的。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了具有选自如下结构式成员的组合物
a——x——l——生物分子 (II)
a—x—l—抗血小板剂(I la) 其中A是第一纤维性聚合物支架，X是选自如下的成员共价键，0, S， C(O)， C(O)O， C(0)S， C(0)NH， S (0) ， S(0)2， S(0)2NR*， C(0)NR*， NH或肌*其中11*是选自如下的成员取代的或未被取代的烷基， 取代的或未被取代的杂烷基，取代的或未被取代的环烷基，取代的或 未被取代的杂环烷基，取代的或未被取代的芳基，取代的或未被取代 的杂芳基，L是连接物，抗血小板剂是选自如下的成员，包括但不限 于肝素，水蛭素，比伐卢定，重组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达 比加群，达比加群酯(口服制剂)，美拉加群，希美加群及其前药。 在另一个示例性的实施方案中，A是第一纤维性聚合物支架管或填充 的管，其中第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维是排列对齐的。 在另一个示例性的实施方案中，L包括选自如下的成员聚磷腈，聚 (乙烯醇)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，聚丙烯酰胺，聚亚烷基 二醇，聚亚烷基氧化物，聚对苯二曱酸亚烷基酯，聚乙烯醚，聚乙烯 酯，聚乙烯卣化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙醇酸交酯，聚硅氧烷，聚 氨酯，聚(曱基丙烯酸曱酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁 酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚曱基丙烯酸异 癸酯，聚甲基丙烯酸月桂酯，聚甲基丙烯酸苯酯，聚(丙烯酸曱酯)， 聚丙烯酸异丙酯，聚丙烯酸异丁酯，聚丙烯酸十八酯，聚乙烯，聚丙 烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(乙酸乙 烯酯)，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，普卢兰尼克，聚乙烯 苯酚，糖类(例如葡聚糖，直链淀粉，透明质酸，聚(唾液酸)，乙 酰肝素，肝素，等等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)； 核酸及其共聚物。在另一个示例性的实施方案中，L包括选自如下的 成员肽，糖类，聚(醚)，聚(胺)，聚(羧酸)，聚(亚烷基二醇)，诸 如聚(乙二醇)("PEG")，聚(丙二醇)("PPG")，乙二醇和丙二醇的共聚
ii物等等，聚(氧乙烯化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，
聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)，聚(a-羟酸)，聚(乙烯醇)，聚磷溱， 聚恶唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，聚唾液酸，聚谷氨酸盐，聚天冬氨 酸盐，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，生物可降解聚合物(例如聚交酯，聚甘 油酯及其共聚物)，聚丙烯酸。在另一个示例性的实施方案中，L是选 自如下的成员聚乙二醇和聚丙二醇。在另一个示例性的实施方案中， X是N，且L是选自如下的成员聚乙二醇和聚丙二醇。在另一个示 例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素，水蛭素 类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢定。在另一个示例性的实施 方案中，A是第一纤维性聚合物支架管或填充的管。第一纤维性聚合 物支架的一条或多条纤维是排列对齐的。在另一个示例性的实施方案 中，第一纤维性聚合物支架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中， 第一纤维性聚合物支架是整体形成的。在另一个示例性的实施方案中，所述生物分子或抗血小板 剂通过连接物共价结合到第一纤维性聚合物。在另一个示例性的实施 方案中，所述組合物包括至少一个具有如下结构式的部分
<formula>formula see original document page 12</formula>
抗血小板并J
(lib)或v/xa^ (lie) 其中A1是如本文定义的。在另一个示例性的实施方案中，所述至少 一个部分具有如下结构式<formula>formula see original document page 12</formula>(lid)
在另一个示例性的实施方案中，所述至少一个部分具有如下结构式:HC——U——水娃素
<formula>formula see original document page 13</formula>(lie)
在另一个示例性的实施方案中，水蛭素是选自如下的成员野生型水 蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢定。在另一个 示例性的实施方案中，抗血小板剂包括凝血酶结合位点。在另一个示 例性的实施方案中，抗血小板剂包括蛋白序列，其是选自如下的成员 FPRP和LYEEPIEEFDGN。在另 一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚 合物支架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合 物支架是整体形成的。在另一个示例性的实施方案中，所述至少一个部分具有如下结 构式<formula>formula see original document page 13</formula>
生物分子
<formula>formula see original document page 13</formula>-1——X2——抗血小板剂
其中Xi和X2独立地选自如下成员共价键，0， S， NH或冊*，其中 R*是选自如下的成员取代的或未被取代的烷基，取代的或未被取代 的杂烷基，取代的或未被取代的环烷基，取代的或未被取代的杂环烷 基，取代的或未被取代的芳基，取代的或未被取代的杂芳基，L1是选 自如下的成员水溶性和水不溶性聚合物。在另一个示例性的实施方
案中，i;包括选自如下的成员聚磷腈，聚(乙烯醇)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，聚丙烯酰胺，聚亚烷基二醇，聚亚烷基氧化物，聚 对苯二曱酸亚烷基酯，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯卣化物，聚乙烯 吡咯烷酮，聚乙醇酸交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，聚(甲基丙烯酸曱酯)， 聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(曱基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)， 聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂 酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚 (丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)， 聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(乙酸乙烯酯)，聚氯乙烯， 聚苯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，普卢兰尼克，聚乙烯苯酚，糖类(例如 葡聚糖，直链淀粉，透明质酸，聚(唾液酸)，乙酰肝素，肝素，等
等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸及其共聚 物。在另一个示例性的实施方案中，L'包括选自如下的成员肽，糖 类，聚醚，聚胺，聚羧酸，聚亚烷基二醇，诸如聚乙二醇("PEG"),聚 丙二醇("PPG"),乙二醇和丙二醇的共聚物等等，聚(氧乙烯化多元醇)， 聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)，聚 (a-羟酸)，聚(乙烯醇)，聚磷"秦，聚恶唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)， 聚唾液酸，聚谷氨酸盐，聚天冬氨酸盐，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，生 物可降解聚合物(例如聚交酯，聚甘油酯及其共聚物)，聚丙烯酸。在 另一个示例性的实施方案中，L1是选自如下的成员PEG， PPG及其共 聚物。在另一个示例性的实施方案中，L1是PEG,其中所述PEG包括 许多单体亚单位，其数目是从约1-约5000的整数。在另一个示例性 的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约10到约1000的整数。 在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约10 到约500的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单 位数目是从约20到约400的整数。在另一个示例性的实施方案中，所 述许多单体亚单位数目是从约20到约250的整数。在另一个示例性的 实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约50到约200的整数。在 另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约50到约 125的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数
14目是从约50到约100的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许 多单体亚单位数目是从约60到约90的整数。在另一个示例性的实施 方案中，所述许多单体亚单位数目是从约60到约90的整数。在另一 个示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架是无缝的。在另一个 示例性的实施方案中，第一纤维性聚合物支架是整体形成的。
在另一个示例性的实施方案中，所述至少一个部分具有如下结 构式
(IIh)
其中x1， i;和xz如本文所定义。在另一个示例性的实施方案中，X2连
接到水蛭素的C末端。在另一个示例性的实施方案中，X2连接到水蛭 素的C末端的氨基酸。在另一个示例性的实施方案中，X2通过天冬氨 酸或谷氨酸部分的侧链连接到水蛭素。在另 一个示例性的实施方案中， X2通过天冬氨酸或谷氨酸部分的侧链连接到水蛭素。在另一个示例性 的实施方案中，X2连接到水蛭素的氨基酸部分，其是选自如下的成员 D5， E8， E17, D33， E35， E43， D53， D55， E57， E58， E61， E62和 Q65。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂包括凝血酶结合位点。 在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂包括蛋白序列，其是选自 如下的成员FPRP和LYEEPIEEFDGN。在另 一个示例性的实施方案中， 第一纤维性聚合物支架是无缝的。在另一个示例性的实施方案中，笫 一纤维性聚合物支架是整体形成的。在另 一个示例性的实施方案中，所述至少一个部分具有如下结 构式
<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>其中X1， L/和X2如本文所定义。在另一个示例性的实施方案中，L1是 PEG。在另一个示例性的实施方案中，水蛭素通过其末端结构域连接。 在另一个示例性的实施方案中，X2连接到水蛭素的C末端的氨基酸。 在另一个示例性的实施方案中，X2通过天冬氨酸或谷氨酸部分的侧链 连接到水蛭素。在另一个示例性的实施方案中，X2通过天冬氨酸或谷 氨酸部分的侧链连接到水蛭素。在另一个示例性的实施方案中，X2连 接到水蛭素的氨基酸部分，所述部分是选自如下的成员D5， E8， E17， D33， E35， E43， D53， D55， E57， E58, E61， E62和Q65。在另一个示 例性的实施方案中，抗血小板剂包括凝血酶结合位点。在另一个示例 性的实施方案中，抗血小板剂包括蛋白序列，其是选自如下的成员 FPRP和LYEEPIEEFDGN。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了包含如下结构式 III的组合物
A——X1——L1——X2——L2——抗血小板剂 式III
其中A是第一纤维性聚合物支架，X1是任选选自如下的第一成员共 价键，0, S， NH或NR， L1是任选的第一连接物，X2是任选选自如下 的第二成员共价键，0， S, NH或NR, L2是任选的第二连接物，且 抗血小板剂是选自如下的成员，包括但不限于肝素，水蛭素，比伐 卢定，重组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达比加群，达比加群酯， 美拉加群，希美加群及其前药。在另一个示例性的实施方案中，A是第一纤维性聚合物支架管 或填充的管，其中第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维是排列对 齐的。在另一个示例性的实施方案中，L'和L2各自独立地是选自如 下的成员聚乙二醇和聚丙二醇。在另一个示例性的实施方案中，每
，一d—水蛭素
-——o——c
- H个X是N,且l/和L2各自是选自如下的成员聚乙二醇和聚丙二醇。 在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭 素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢定。
在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了包含如下式IV 的组合物
<formula>formula see original document page 17</formula>
式IV
其中A是第一纤维性聚合物支架，每个L独立地是第一连接物，其独 立地选自聚乙二醇和聚丙二醇，其中m是从约0到约100，从约l到 约50，从约1到约10的整数；且每个抗血小板剂是独立地选自肝素, 水蛭素，比伐卢定，重组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达比加群， 达比加群酯，美拉加群，希美加群及其前药，其中z是从O到1的整 数。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员 水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢定，其中z是 1。在另一个示例性的实施方案中，每个L是选自如下的成员聚乙二 醇和聚丙二醇。在另一个示例性的实施方案中，A是第一纤维性聚合
物支架管或填充的管，其中第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维 是排列对齐的。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如 下的成员水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西卢 定。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了包含下式V的组 合物(抗血小板剂)z I
(L)m
A——(X)n——(L)m—(抗血小板剂)z
(L)m I
(抗血小板刑)z
式v
其中A是笫一纤维性聚合物支架，每个X独立地是选自如下的第一成 员共价键，0， S， NH或NR，其中n是从约0到约100，从约1到 约50,从约1-10的整数；每个L独立地是第一连接物，其独立地选 自聚乙二醇和聚丙二醇，其中m是从约0到约100，从约1到约50， 从约1到约10的整数；和每个抗血小板剂独立地选自肝素，水蛭素， 比伐卢定，重组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达比加群，达比加群 酯，美拉加群，希美加群及其前药。在另一个示例性的实施方案中， 抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定， 重组水蛭素或地西卢定，其中z是从O到1的整数。在另一个示例性 的实施方案中，X是N且每个L是选自如下的成员聚乙二醇和聚丙 二醇。在另一个示例性的实施方案中，A是第一纤维性聚合物支架管 或填充的管，其中第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维是排列对 齐的。在另一个示例性的实施方案中，每个抗血小板剂是独立地选自 如下的成员水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地西 卢定。在另 一个示例性的实施方案中，本发明提供了包含下式VI的组 合物
〇
A——C-X-L-抗血小板剂
式VI
其中A是第一纤维性聚合物支架，X是选自如下的成员0， S， NH或 NR，和L是连接物。在另一个示例性的实施方案中，A是第一纤维性
18聚合物支架管或填充的管。第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维
是排列对齐的。在另一个示例性的实施方案中，L是选自如下的成员 聚乙二醇和聚丙二醇。在另一个示例性的实施方案中，X是N且L是 选自如下的成员聚乙二醇和聚丙二醇。在另一个示例性的实施方案 中，C-O部分是第一纤维性聚合物支架中的丙交酯部分。在另一个示 例性的实施方案中，C-O部分是第一纤维性聚合物支架中的乙交酯部 分。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员 水蛭素，比伐卢定，重组水蛭素，地西卢定，阿加曲班，达比加群， 达比加群酯，美拉加群，希美加群及其前药。在另一个示例性的实施 方案中，抗血小板剂是选自如下的成员水蛭素，水蛭素类似物，比 伐卢定，重组水蛭素或地西卢定。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了包含下式VII的 組合物
o
A——C-X-L——抗血小板剂
式VII
其中A是第一纤维性聚合物支架，X是选自NH的成员，L是聚乙二醇， 和抗血小板剂是水蛭素，水蛭素类似物，比伐卢定，重组水蛭素或地 西卢定。在另一个示例性的实施方案中，C-O部分是第一纤维性聚合 物支架中的丙交酯部分。在另一个示例性的实施方案中，C-O部分是 第一纤维性聚合物支架中的乙交酯部分。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述 的任一一种组合物都具有第一纤维性聚合物支架，其是无缝的。在另
一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述的任--种
组合物都具有第一纤维性聚合物支架，其是整体形成的。在另一个示 例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述的任——种组合物 都是纟皮设计用来放置成端-端吻合或端-侧吻合。为了端-端吻合，移植 物的每个侧面都被放置成使得天然动脉与移植物的直径相匹配。可使 用断续或连续的缝合线来将移植物和动脉的两端保持在一起。为了端_ 侧吻合，可以以一定角度切割移植物(通常为45°,但可以在0到90°
19间变化)，并将其放置在天然动脉的侧边。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述 的任一~"种组合物都包括第二聚合物，其包括选自如下的成员PTFE 和Dacron。在另 一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中 描述的任一一种组合物都进一步包括袖管，所迷袖管包绕第一纤维性 聚合物支架管或填充的管的外表面，但不位于第一纤维性聚合物支架 管或填充的管的腔中。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部
分和本文中描述的任--种组合物都包括袖管，所述袖管包括聚合物
或亚单位，其是选自如下的成员聚对苯二曱酸乙二醇酯和聚四氟乙 烯。在另一个示例性的实施方案中，对于在发明概述部分和本文中 描述的任一一种组合物，所述第一纤维性聚合物支架是无缝的、周缘 对齐的，且第一纤维性聚合物支架的至少之一的纤维包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA),所述水蛭素通过连接物共价连结到所述第一纤维 性聚合物支架，所述连接物是选自如下的成员二氨基聚(乙二醇) 和聚(乙二醇)。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述
的任--种组合物都具有约lmm至约50cm的长度。在另一个示例性
的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述的任^"-一种组合物都具 有约0. 5cm至约10cra的长度。在另 一个示例性的实施方案中，在发 明概述部分和本文中描述的任一一种组合物都具有约3 mm至约6 mm 的长度。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描
述的任--种组合物都具有约0. Olmm至6 mm的内径。在另一个示例
性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描述的任——种组合物都 具有约3 mm至约6 mm的长度。在另 一个示例性的实施方案中，在发 明概述部分和本文中描述的任——种組合物都具有约4 cm至约8 cm 的长度。在另一个示例性的实施方案中，在发明概述部分和本文中描 述的任——种組合物都用作A/V分流或血液透析通路移植物的部件。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者损伤的方法，所述方
20法包括(i)以在一定条件下足以治疗所述损伤的量应用发明概述部分 或本文所述的组合物到所述受试者的目标位点。在另一个示例性的实 施方案中，所迷目标位点是选自如下的成员冠状动脉，股动脉，胭 动脉，颈动脉，脑动脉，腹部，膝盖以上，膝盖以下和桡骨。在另一 个示例性的实施方案中，所述目标位点是选自如下的成员颈动脉和 膝盖以下的血管组织。在另一个示例性的实施方案中，损伤涉及切断 的血管，所述第一纤维性聚合物支架具有管或填充的管的形状，其包 括第一端和第二端，所述切断的血管包括第一血管残端和第二血管残 端，所述应用包括(ii)将所述组合物的第一端连接到所述第一血管 残端；和(iii)将所述组合物的第二端连接到所述第二血管残端。
在另一个方面，本发明提供了增强受试者的血管生长的方法， 所述方法包括(i)以在一定条件下足以增强血管生长的量应用发明 概述部分或本文所述的组合物到所述受试者的目标血管位点。
在另一个示例性的实施方案中，该聚环氧炕烃选自如下聚环 氧乙烷，聚环氧丙烷及其组合。在另一个示例性的实施方案中，本发 明进一步包括细胞。在另一个示例性的实施方案中，该细胞包埋在第 一纤维性聚合物支架内或在第一纤维性聚合物支架的表面上。在另一 个示例性的实施方案中，该细胞选自干细胞和祖细胞。在另一个示例 性的实施方案中，该细胞选自如下成年血管细胞，血管祖细胞，血 管干细胞，成年肌细胞，肌肉祖细胞，肌肉干细胞，成年神经细胞， 神经祖细胞，神经干细胞，施旺细胞，成纤维细胞，成年皮肤细胞， 皮肤祖细胞和皮肤干细胞。在另一个示例性的实施方案中，本发明进 一步包括直接或通过连接物共价连接到所述第一纤维性聚合物支架的 分子，并且所述分子能够共价或者非共价连接到选自下列的成员胞 外基质组分，生长因子，分化因子及其组合。在另一个示例性的实施 方案中，该分子通过连接物共价连接，该连接物选自如下二-氨基聚 (乙二醇)，聚(乙二醇)及其组合。在另一个示例性的实施方案中， 该分子选自如下肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及其 组合。在另一个示例性的实施方案中，该胞外基质组分选自如下层粘连蛋白，胶原，纤连蛋白，弹性蛋白，玻连蛋白，纤维蛋白原，聚
赖氨酸及其组合。在另一个示例性的实施方案中，生长因子选自如下 酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，神经生长因子， 脑衍生神经营养因子，胰岛素样生长因子，血小板衍生生长因子，转 化生长因子P，血管内皮细胞生长因子，表皮生长因子，角质形成细 胞生长因子及其组合。在另一示例性的实施方案中，分化因子选自如 下基质细胞衍生因子，Shh蛋白(sonic hedgehog),骨形态发生 蛋白，缺刻(notch)配体，Wnt及其组合。在另一示例性的实施方案 中，所述第一纤维性聚合物支架具有管状，填充管状或杆状，且其中 所述聚合物是无缝的。在另一个示例性的实施方案中，该組合物通过将包含聚合 物的聚合物溶液涂到旋转芯轴上制得。在另一个示例性的实施方案中， 所述聚合物支架具有薄片，管或填充管的形状且通过包含具有至少一 个不导电区的旋转芯轴的静电紡纱过程制得。在另一个示例性的实施 方案中，所述聚合物支架具有杆状且通过包含具有气隙的旋转芯轴的 静电紡纱工艺制得。在另一个示例性的实施方案中本发明提供了包含如下组分 的药物组合物(a)本文所述组合物；(b )药学上可接受的赋形剂。 在另一示例性实施方案中，该组合物为杆状或管状且其中至少一种第 一纤维性聚合物支架纤维包含聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)。 在另一个示例性实施方案中，该组合物具有约0. 5cm-50cm的长度。在 另一个示例性实施方案中，本发明进一步包含围绕第一纤维性聚合物 支架的套管。在另一个示例性实施方案中，该套管包含第二纤维性聚 合物支架，且所述第二纤维性聚合物是排列对齐的或具有随机取向。 在另一个示例性实施方案中，本发明进一步包含围绕第一纤维性聚合 物支架的第一端的第一套管和围绕第一纤维性聚合物支架的第二端的 第二套管。在另一个方面，本发明提供了治疗受试者损伤的方法，所 述方法包括(i )以足以治疗所述损伤的量和在足以治疗所述损伤的
22条件下将本文所述组合物施用至所述受试者的目标位点。在另 一个示
例性实施方案中，所述损伤选自如下断开的神经，受损伤的神经， 新开的肌肉，受损伤的肌肉，断开的血管，受损伤的血管，皮肤伤口 和挫伤的皮肤。在另一个示例性实施方案中，该损伤包括断开的神经， 所述第一纤维性聚合物支架为包含第一端和第二端的管状，填充管状 或杆状，且所述断开的神经包含第一神经残端和第二神经残端，所述 施用包括(ii)将所述组合物的第一端连接到所述第一神经残端并 (iii )将所述组合物的所述第二端连接到所述第二神经残端。在另一个示例性实施方案中，所述损伤涉及受损伤的神经， 且所述施用包括选自如下(ii)将本文所述组合物缠绕在所述受损 伤的神经周围，其中所述组合物具有薄片的形状。在另一个示例性实 施方案中，损伤包括受损伤的神经，且所述施用包括选自如下(ii) 将组合物插入所述受损伤的神经，其中所述第一纤维性聚合物支架为 杆状，管状或填充管状。在另一个示例性实施方案中，本发明提供增 强受试者神经生长的方法，所述方法包括(i)以足以增强神经生长 的量和在足以增强神经生长的条件下将本文所述组合物施用至所述受 试者的目标位点。在另一个示例性的实施方案中，该损伤涉及割伤的
皮肤或挫伤的皮肤，所述第一纤维性聚合物支架具有薄片的形状，且 所示施用包括(i)将所述组合物附着到所述割伤的皮肤上；从而治 疗所述损伤。在另一个方面，本发明提供了增强受试者皮肤生长的方 法，其中所述第一纤维性聚合物支架具有薄片的形状，所述方法包括 (i )以足以增强皮肤生长的量和在足以增强皮肤生长的条件下将本文 所述的组合物施用至所述受试者需要治疗的皮肤的位点上。在另一个示例性实施方案中，该损伤包括断开的血管， 所述第一纤维性聚合物支架为包含第一端和第二端的管状或填充管 状，且所述断开的血管包括第一血管残端和第二血管残端，所述施用 包含(ii )将所述组合物的所述第一端连接到所述第一血管残端； 且(iii )将所述组合物的所述第二端连接到所述第二血管残端。在另 一个方面，本发明提供增强受试者血管生长的方法，所述方法包括
23(i )以足以增强血管生长的量和在足以增强血管生长的条件下将本文 所述組合物施用至所述受试者需要治疗的血管部位。在另一个示例性实施方案中，该损伤包括斯开的肌肉，所 述第一纤维性聚合物支架为包含第一端和第二端的管状，填充管状或 杆状，且所述断开的肌肉包括第一肌肉残端和第二肌肉残端，所述施 用包括(ii)将所述组合物的所述第一端连接到所述第一肌肉残端； 且(iii )将所述组合物的所述第二端连接到所述第二肌肉残端。在另 一个示例性实施方案中，所述损伤涉及受损伤的肌肉，和所述施用包 含选自如下(ii )将本文所述组合物缠绕在所述受损伤的肌肉周围， 其中所述组合物具有薄片的形状。在另一个示例性实施方案中，该损 伤涉及受损伤的肌肉，且所述施用包含选自如下将组合物插入所述 受损伤的肌肉，其中所述第一纤维性聚合物支架具有杆、管或填充管 的形状。在另一个方面，本发明提供了增强受试者肌肉生长的方法，
所述方法包括(i )以足以增强肌肉生长的量和在足以增强肌肉生长 的条件下本文所述组合物施用至所述受试者需要治疗的肌肉位点。在
另一个方面本发明提供了制造本文所述组合物的方法。在另一个示例 性实施方案中，所述方法包括(i)对一条或多条纤维进行静电纺纱 过程，从而制造所述组合物。在另一个示例性实施方案中，其中所述 静电纺纱过程包含具有气隙或至少一个不导电区的旋转芯轴。在第二方面，本发明提供了用于静电纺纱设备的芯轴，包 含第一导电区；第二导电区；和在第一和第二导电区之间延伸的不 导电区，其中将不导电区调整尺寸和构型配置以接受用于形成第一纤 维性聚合物支架的纤维性聚合物。在另一个示例性实施方案中，所述 不导电区为置于该芯轴周围的套管。在另一个示例性实施方案中，所 述不导电区选自如下胶带，绝缘胶带，聚四氟乙烯，和塑料。在另 一示例性实施方案中，所述不导电区将两个导电芯轴区互相连接。在 另一示例性实施方案中，所述不导电区为在两个导电芯轴区之间延伸 的不连续部分。在另一个示例性实施方案中，所述不导电区选自聚四 氟乙烯和塑料。在另一个示例性实施方案中，所述不导电性具有选自
24大于和小于所述导电区的直径。在第三方面，本发明提供了用于静电纺纱设备的芯轴，包含:第一导电区和第二导电区，其中位于第 一和第二导电区之间的气隙形成了在第一和第二导电区之间的不导电区。在另一个示例性的实施方案中，本发明进一步包括位于第一导电部分的至少一部分上的第一不导电套管，和位于第二导电部分的至少一部分上的第二不导电套管。在另一个示例性实施方案中，具有不导电区的芯轴与静电纺纱体系结合。在另一个示例性实施方案中，具有气隙的芯轴与静电纺纱体系结合。
图1为具有芯轴56A的静电纺纱设备的示意图。
图2为具有芯轴56A的静电纺纱设备的透视图。
图2A为形成聚合物支架90的具有芯轴56A的静电纺纱设备的一部分。图2B为形成聚合物支架90的具有芯轴56A的静电纺纱设备的一部分。图3说明了用于制造纤维性聚合物支架的各种芯轴。(A)其中整个表面为导电芯轴56; (B)具有第一导电区57A，第二导电区57B，不导电区55，第一界面55A和第二界面55B的芯轴56A; (C)其中不导电区55将两个导电芯轴区互相连接的芯轴56A的横截面；(D)其中不导电区55A为覆盖导电部分57表面一部分的套管；(E )具有第一导电区57A，第二导电区57B,第一导电区面57C，第二导电区面57D的芯轴56B。该导电区,皮气隙58所分开。图4A为由纵向排列对齐的微米/纳米纤维组成的管状聚合物支架的示意图。图4B为由纵向排列对齐的微米/纳米纤维组成的杆状聚合物支架的示意图。注:纤维尺寸不是按比例画出。图5A为显示图4A中管横截面的示意图。图5B为显示图4B中杆横截面的示意图。
25
图6为具有芯轴56B的静电纺纱设备的示意图。
图7为具有芯轴56B的静电纺纱设备的透视图。
图7A为形成聚合物支架92的具有芯轴56B的静电纺纱设备的一部分。图8为纵向排列对齐的聚合物支架薄片96的示意图。
图9为显示使用由排列聚合物支架薄片生成具有接缝的纤
雄性聚合物管支架的轧压过程的工序图。此处纵向排列对齐的聚合物
支架薄片96在杆97周围轧压，然后缝合或粘合。图10包含排列对齐的薄片96和100的"十字交叉"薄片
102的示意图。图11为具有芯轴56B的多喷丝头静电纺纱设备的示意图。该聚合物溶液38， 38A和38B包含溶于溶剂的聚合物，并且分别包含在喷射组件36，36A和36B中。该喷射组件为喷射泵组件32的一部分，其中计算机34通过控制压力和流速控制了聚合物溶液离开喷射器的速度。任选地，可对所选喷丝头提供和控制不同的流速。流速会依赖于聚合物支架所需的物理特性，即，膜的厚度，纤维直径，孔径尺寸，膜的密度等，而改变。该喷射泵组件32将聚合物溶液进料到位于平台44的喷丝头42， 42A和42B。该喷丝头为尖形，其允许射流形成和通过而没有阻碍。利用高压电源48通过电线4U将范围为约10kV到约30kV的电压施加到该喷丝头上。芯轴56B (其在图3B中提及，包括57A, 57B和58)位于喷丝头42， 42A和42B的下面从而在带电喷丝头和芯轴56A之间形成电场。该电场使一束聚合物溶液从该喷丝头喷出并喷射到芯轴56B，形成微米或纳米直径的细丝或纤维46， 46A和46B。该钻夹头用接地线41B和41C接地。该芯轴56B连接到第一钻夹头54 (连接到不导电轴承60)和与电动机52相连的第二钻夹头54A (连接到不导电轴承60A)。该电动机52与控制电动机旋转芯轴56B速度的速度控制器50A连接。任选地，可提供不同旋转速率。旋转速度会依赖于聚合物支架所需的物理特性，即，膜的厚度，纤维直径，孔径尺寸，膜的密度等，而改变。图12为非排列对齐(A)和排列对齐的(B) DEPLLA纳米纤维的SEM图像。C)为显示了用肝素和bFGF和层粘连蛋白的共价结合对PLLA纳米的化学修饰的示例图。改进的ELISA技术用于显示bFGF连接在未经处理的二-NH2-PEG修饰的和肝素功能化的PLLA纳米纤维(D)和聚(丙烯酸)涂敷的聚苯乙烯表面(E)的相对水平。图13为从在非排列对齐纳米纤维上的DRG组织延伸的神经突。神经丝的免疫荧光染色用于将从体外培养6天后在未经处理的，LAM和LAM+bFGF非排列对齐纳米纤维上的DRG组织延伸的神经突显影。比例尺-200jam。图14为从非排列对齐纳米纤维上的DRG组织延伸的神经突。神经丝的免疫荧光染色用于将体外培养6天后在未经处理的，LAM和LAM+bFGF排列对齐的纳米纤维上的DRG组织延伸的神经突显影。纳米纤维以垂直方向排列。比例尺-200 pm。图15为在非排列对齐和排列对齐的LAM+bFGF PLLA纳米纤维上的神经突形态的高度放大共焦显微图像。纳米纤维以垂直方向排列对齐。图16将人类间充质干细胞在PLLA微米/納米纤维膜上培养为小球状1， 3，或6天。细胞在非排列对齐微米/納米纤维显示出随着时间逐渐迁移和随机排列。在排列对齐的微米/纳米纤维上的细胞在3和6天时展示出在纤维方向增强的迁移以及沿着纤维方向的整体排列。比例尺-200jum。图17为各种细胞类型在微米/纳米纤维支架上的伤口愈合模型。MSCs:两天后的间充质干细胞。FFs: 5天后包皮成纤维细胞。ECs:—天后的内皮细胞。在非排列对齐微米/纳米纤维支架上，伤口的覆盖范围从最小(MSC样品)到中等(EC样品)。当微米/纳米细胞与伤口长轴(A-Para)平行排列时，迁移到伤口内的细胞严重损伤。当微米/纳米纤维垂直于伤口长轴排列时，细胞迁移和伤口覆盖度最大。
图18为对肌动蛋白(鬼笔环肽)和核(碘化丙锭)的荧光染色证明了在A )天然体内通常颈动脉和B )用人平滑肌细胞接种的排刮纳米奸维性聚合物薄片之间的细胞骨骼结构相似。图19为纳米纤维性的包埋干细胞的血管移植物的构建。A)干细胞接种到可生物降解的纳米纤维的排列薄片上。B)管状结构通过在杆周围轧压薄片而生成。C)移走杆并使用缝合来维持移植物的形状。图20为血管移植物和大鼠动脉横截面的Verhoeff染色。胶原(红色)和弹性蛋白(黑色)纤维的生长在1到3周显著提高。到三周为止，操纵血管移植物的组织与天然大鼠动脉具有强的相似形。图21为植入三周后在血管移植物内CD31 (内皮细胞标记)横截面的免疫組织化学染色(褐色)。A)大鼠动脉。B)三周后的血管移植物。图22为在植入3周后在血管移植物内oc-肌动蛋白(平滑肌标记)横截面的免疫组织化学染色(褐色)。A)大鼠动脉。B)三周后的血管移植物。图23为当成肌细胞在非排列对齐和非图案化表面上生长时，肌管以随机方式形成，当成肌细胞在排列纳米纤维和微图案化表面上生长时，该肌管以排列对齐的方式形成。图24:在排列PLLA纳米纤维支架上成肌细胞的排列和肌管的集合。SEM图象显示了 (A)随即取向和(B)排列对齐的纳米纤维支架的结构，然后在分化培养液内3天后成肌细胞在(C)随机取向和(D)排列对齐的纳米纤维支架上纤维状肌动蛋白免疫荧光染色。进行骨骼MHC的免疫荧光染色以显示在随机(E, G)和排列(F， H)纳米纤维支架在3天(E, F)和7天(G， H)的肌管。在(I)随机取向和(J )排列基材上7天后骨骼MHC染色的低放大合并图像显示了肌管的总体排列和长度。箭头表示纳米纤维的方向。E和F的箭头表示核。比例尺分别为50jam ( A-H)和100jam ( I， J)。图25为在排列对齐纤维基材上肌管组织和形态的量化。(A)针对纳米纤维方向肌管的排列角度。(B) 7天后肌管的长度。
28。*显示了统计上显著的差异(P<0. 05)。图26为在排列对齐纤维基材上成肌细胞增殖和肌管条紋形成的量化。(A)细胞增殖的BrdU掺入(R, Ran; A， Align)。 (B)显示在排列纳米纤维支架上条紋状肌管的抗-MHC的免疫焚光染色(比例尺20jLim)。 (C) 7天后条紋状细胞百分比的量化。*显示了统计上显著的差异(P<0. 05)。图27为在微图案化PDMS基材上成肌细胞排列和肌管组织的量化。通过(A) SEM (侧视图)和(B)相差显微技术显示微图案化聚二甲基硅氧烷底物。纤维状肌动蛋白在分化培养液内2天后的分配显示在(C)非图案化和(D)微图案化基材上。进行骨骼MHC的荧光染色以显示在无图案(E， G)和微图案化(F， H)膜上在2天(E， F)和7天(G， H)的细胞融合。箭头表示细微紋沟的方向。比例尺分别为5pm(A)， 20lim(B)和50jum(C-H)。图28为在微图案化膜上成肌细胞组织和形态的量化。(A)在无图案(Con)和微图案化(Pat)膜上的针对细微紋沟方向肌管排列对齐的角度。(B) 7天后肌管的长度(C) 7天后肌管的宽度。*显示了统计上显著的差异(P<0. 05)。图29为在微图案化PDMS膜上成肌细胞增殖和条紋形成的量化。(A)在无图案(Con)和微图案化(Pat)膜上融合早期因细胞增殖的BrdU的掺入。(B) 7天后条紋状细胞百分比的量化。*显示了统计上显著的差异(P<0. 05)。图30在纳米纤维支架上肌管形成的扫描电镜图像。7天后在A)随机取向和(B)排列对齐的PLLA纳米纤维支架上分化培养液内的肌管的排列(比例尺条50jnm)。图31在微图案化可生物降解的PLGC底物上成肌细胞的排列。(A)在PLGC基材上图象式微图案化细微紋沟的扫描电镜图像。(B-C ) 5天后在无图案B )和微图案化(C ) PLGC底物上分化培养液内成肌细胞的纤维状肌动蛋白染色。注意在微图案化PLGC基材上排列和组织良好的肌动蛋白紧张纤维。比例尺分别为lOiam(A)和50
29p m ( B-C )。图32显示了用于生成三维立体肌纤维接种管状支架的工序图。在排列对齐的纳米纤维膜上成肌细胞分化成排列对齐的肌管。分化7天后，将薄片轧压成具有杆茎的管状支架并且缝合固定。图33描述三维管状納米纤维支架组织在低的(左)和高的(右)放大率下的苏木精和曙红(H & E)染色。图34为描述在截面(A)和长轴(B)方面三维管状纳米纤
维支架内的成肌细胞和肌管的细胞形态学的激光共焦显微图象。该样品对纤维状肌动蛋白(绿色)和核(红色)进行免疫荧光染色。图35为在排列或不排列对齐纤维上体外伤口愈合模型的图解。(A)用与伤口的长边缘边缘平行或者垂直的非排列对齐纤维或排列对齐纤维生成的微米/纳米纤维为网孔状。((B)平化18量规喷射器针头位于该纳米纤维网孔上以阻挡细胞粘着。(C)在纳米纤维网孔上对细胞进行接种。(D)在细胞粘附到该纳米奸维上之后，移走该4十以允许细胞迁移到伤口处。图36在排列对齐vs。对非排列对齐的纳米纤维上的具有NHDF的体外伤口愈合模型。48小时后，在非排列对齐微米/纳米纤维上的NHDF ( A)显示处中度的迁移和伤口覆盖度，以及随机的细胞排列。当纤维以与伤口 (B)的边缘垂直的方向排列时，迁移和伤口覆盖度大大提高，并且细胞与纤维排列成行。当纤维与伤口 (C)的边缘平行排列时，伤口覆盖度大大地减少。染色为整体肌动蛋白(绿色)和赫希斯特核染剂(蓝色)。白色点划线表示在0时的原始伤口边缘。比例尺为300juffl。图37为在有或者没有化学修饰的排列对齐的微米/纳米纤维上具有NHDF的体外伤口愈合模型。在所有组中，微米/納米纤维垂直于伤口的长边缘取向。A24小时后，在具有其他化学修饰的纤维上NHDF显示出提高的迁移和伤口覆盖度。在未经处理的纤维上，细胞不完全覆盖伤口面积。当将层粘连蛋白添加到该纤维上时，细胞迁移更快。以可溶形状或固定到微米/纳米纤维上的形式bFGF的添加更进一步增强迁移。染色为整体肌动蛋白(绿色)和核(蓝色)。白色点
划线表示在0时的原始伤口边缘。S比例尺为300|am。图38为多层微米/纳米纤維组织移植物的装配。各微米/纳米纤维薄片在彼此顶部层合以产生具有复杂结构的构造。本图描述
了具有十字交叉纤维结构移植物的装配。其他构造可依赖各个体薄片的纤维取向来生成。图39为微图案化聚合物膜的制造。(A)负性光致抗蚀剂在硅树脂晶片上旋转涂布并且通过光掩模暴露于紫外线。(B)无紫外线聚合的光致抗蚀剂发展开来，留下图案化表面。(C)该聚合物溶液浇铸到晶片上，旋转涂敷，并允许聚合。(D)然后将该薄膜从硅晶片上剥离。图40多细胞型移植物。(A)排列或随机取向的纳米纤维薄片。(B)在薄片不同区域上的接种多细胞类型。(C)在移植物的不同位置生成了具有多细胞类型的管状构造。图41说明了本发明具有转鼓集电极的静电纺纱设备。图42示出了血管移植物和大鼠动脉的横截面。植入的血管移植物包括PLLA，并且不包含共价连结的诸如水蛭素的生物分子。图42A示出了经受Verhoeff，s染色的血管移植物和大鼠动脉。图42B示出了用CD31 (内皮细胞标记物)通过免疫组织化学染色(棕色)的血管移植物和大鼠动脉。图42C示出了用a-肌动蛋白(平滑肌细胞标记物)进行免疫组织化学染色(棕色)的血管移植物和大鼠动脉。图42D示出了用CD68进行免疫组织化学染色的血管移植物和大鼠动脉。图43示出了血管移植物和大鼠动脉的横截面。植入的血管移植物包括共价连结的PLLA。图43A示出了经受Verhoeff，s染色的血管移植物和大鼠动脉。图43B示出了用CD31 (内皮细胞标记物)通过免疫组织化学染色(棕色)血管移植物和大鼠动脉。图43C示出了用a-肌动蛋白(平滑肌细胞标记物)进行免疫组织化学染色(棕色)的血管移植物和大鼠动脉。图43D示出了用CD68进行免疫组织化学染色的血管移植物和大鼠动脉。
31优选实施方案详述 定义和缩写本文所用缩写通常具有在化学和生物学领域内通常的含义。本文所用单数形式"一/该"包括复数指代，除非上下文另 有不同指明。本文所用，除非另有说明，组合物"基本不含" 一种组分 的意思为组合物含有小于约20wt%，例如小于约10wt%，小于约5wtl 或小于约3wt。/。该《且分。"肽"是指其中单体为氨基酸并且通过酰胺键结合在一起的 聚合物，或者被称为多肽。此外，也包括非天然氨基酸，例如，P-丙氨酸，苯基甘氨酸和高精氨酸。非基因编码的氨基酸也可用于本发 明。此外，已被修饰以包括反应性基团，糖基化位点，聚合物，治疗 部分，生物分子等的氨基酸也可用于本发明。本发明所用的所有氨基 酸是D-或L-异构体。此外，其他拟肽在本发明中也是有用的。本文 所用"肽"是指糖基化的和非糖基化的肽。还包括通过表达所迷肽的 系统不完全糖基化的肽。综述请参考，Spatola, A。 F. ， in Chemistry和Biochemistry of氨基酸,肽s和Proteins, B。 Weinstein， eds.，Marcel Dekker， New York, p。
267 (1983)。术语"氨基酸"是指天然存在和合成的氨基酸，以及与天
然存在的氨基酸以类似方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天 然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及之后修饰过那 些氨基酸，例如羟基脯氨酸，Y-羧基谷氨酸，和0-磷酸丝氨酸。氨 基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合 物，即，与氢，羧基，氨基，和R基结合的ot碳，例如高丝氨酸，正 亮氨酸，曱硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R 基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保持了与天然存在的氨基 酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸通常化学结构不同结构的化合物，但是与天然存在的氨基酸以类似的方式作用。本文所用"核酸"是指DNA， RNA，单链，双链，或更高聚 集的杂交基序，和其任何化学修饰。修饰包括，但不限于，提供引入 额外电荷，极化度，氢键合，静电相互作用，连接点和官能度到核酸 配体碱基或核酸配体整体的化学基团。这些修饰，包括，但不限于， 肽核酸(PNA)，磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯，膦酸甲酯)， 2 '-位糖修饰，5-位嗜咬修饰，8-位噪呤修改，环外胺的修饰，4-硫 脲苷的取代，5-溴或5-碘尿嘧啶的取代；主链修饰，曱基化作用，稀 有碱基配对结合例如异碱基，异胞啶和异鸟嘌呤等。核酸可还包括非 天然的碱基，例如，硝基巧l咮。修饰可还包括3'和5'修饰例如用焚 光基团(例如，量子点)或另一个部分加帽。本文所用"抗体"通常是指特异结合和识别抗原的包含来 自免疫球蛋白或其片段或免疫缀合物的框架区的多肽。公认的免疫球 蛋白包括k，入，oc, y, 5， e，和iu恒定区基因，以及无数免疫 球蛋白可变区基因。轻链分类为k或入。重链分类为Y， ji， a， 5,或s，其依次分别定义免疫球蛋白类型，IgG， IgM， IgA， IgD 和IgE。本文所用术语"共聚物"描述了含有不止一种类类型亚基 的聚合物。该术语包含包括2， 3， 4， 5,或6种类型亚基的聚合物。术语"分离的"是指材料基本上或本质上从用于制造该材 料的组分中游离。该组合物纯度范围的下限为约60%,约70°/。或约80% 和纯度范围的上限为约70%,约80%，约90%或大于约90%。"水凝胶"是指不溶于水的和水可溶胀的交联聚合物，该 聚合物能够吸收至少3倍，优选至少IO倍其自身重量的液体。"水凝 胶"和"感温聚合物"在本文可互换使用。本文所用术语"连接"包含包括，但不限于，共价键合， 离子鍵合，化学吸附，物理吸附及其组合的相互作用。术语"生物分子"或"生物有机分子"是指通常由活体生 物制造的有机分子。这包括，例如，包含核苷酸，氨基酸，糖，脂肪酸，甾体，核酸，多肽，肽，肽片段，碳水化合物，脂质，及其组合 的分子(例如，糖蛋白，核糖核蛋白，脂蛋白等)。本文所用"本发明组合物"是指本文所讨论的组合物，这些 组合物药学上可接受的盐和前药。在从左至右书写通过常规化学式指定取代基时，它们同样 包含化学上等同的取代基，其可由从右到左书写该结构而得到，例如， -CH20-也旨在表示为-OCH2。"有效"量的药物，制剂，或渗透剂是指活性剂的量足以 提供所需局部或全身的效果。"局部有效"，"美容上有效"，"药 学上有效"或"治疗有效"是引导起所需治疗结果所需的药物的量。术语"药学上可接受的盐"是指包括本发明化合物的盐，
来制备。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可通
比，
的所需碱接触获得。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐，钾盐， 钓盐，铵盐，有机胺，或镁盐，或类似的盐。当本发明的化合物舍有 相对碱性的官能团时，酸加成盐可通过在无溶剂或在适当的惰性溶剂 内使这些化合物的中性形式与足够量的所需酸接触获得。药学上可接 受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸的盐，例如盐酸盐，氢溴酸 盐，硝酸盐，碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，磷酸二氢盐， 石克酸盐，硫酸氢盐，氢碘酸盐，或亚磷酸盐等，以及衍生自相对无毒 的有机酸的盐，例如乙酸盐，丙酸盐，异丁酸盐，马来酸盐，丙二酸 盐，安息香酸盐，琥珀酸盐，栓酸盐，反丁烯二酸盐，乳酸盐，扁桃 酸盐，苯二甲酸盐，苯磺酸盐，对曱苯磺酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐， 甲磺酸盐等。还包括氨基酸的盐，例如精氨酸盐等，和有机酸盐，例 如，葡糖醛酸盐或半乳糖醛酸盐等(参见，例如Berge et al。" Pharmaceutical Salts "， Journal of Pharmaceutical Science 66 :
341-19 ( 1977 ))。本发明的某些特定化合物兼含碱性和酸性官能团从 而可使该化合物转化为碱或酸加成盐。
的方式与母体化合物分离来再生。该化合物的母体形式在某些物理性
质方面不同于各种盐的形式，例如在极性溶剂中的溶解度。除了盐的形式，本发明提供了前药形式的化合物，本文所 述的化合物或混合物的前药容易在生理条件下发生化学变化以提供本 发明的化合物。此外，前药可在离体环境通过化学或生物化学法转化 为本发明的化合物。本发明的化合物还在构成这些化合物的一个或多个原子 上包含以非天然比例的元素同位素，例如，该化合物可由放射性同位 素(例如氚(3H )，碘-1 2 5 (1251 )或碳-14 ( "C ))进行放射性标记。 所有本发明化合物的同位素变化，无论是放射性的或非放射性的，都
旨在包含在本发明的范围内。术语"药学上可接受的载体"或"药学上可接受的栽体" 是指提供本文所定义的有效量的活性剂适当递送的任何制剂或载体介
质，不千扰活性剂生物活性的有效性，和其对宿主或患者足够无毒。 代表性的载体包括水，油类(植物油和矿物油两者)，乳霜基质，洗 剂基质，软骨基质等。这些基质包括悬浮剂，增稠剂，渗透增强剂等。 这些制剂对化妆品和局部药物领域的专业人员是公知的。关于载体的 其他信息可在:i口下参考文献中找到Remington : Science和Practice of Pharmacy, 21st Ed.，Lippincott， lliams & Wilkins ( 2005 )，
其通过引用并入本文。"药学上可接受局部载体"和等价术语是指如上所述药学 上可接受的载体，其适于局部施用。能够悬浮或溶解活性剂，并且当 施用到皮肤，指甲，毛发，爪子或蹄时具有无毒和非炎性的性质的非 活性液体或骨状赋形剂为药学上可接受局部载体的例子。该术语特定
旨在包含批准用于局部化妆品的载体原料。术语"药学上可接受添加剂"是指药物制剂领域已知或使
35用的并且不过多干扰活性剂生物活性的有效性，且对宿主或患者足够 无毒的防腐剂，抗氧化剂，香料，乳化剂，染料和赋性剂。用于局部 制剂的添加剂在本领域是公知的，并且可加入到局部组合物中，只要 它们是药学上可接受的并且对上皮细胞或其功能无害。此外，它们应 该不会引起组合物稳定性的恶化。局部或经皮递送制剂的例如，惰性 填料，抗刺激剂，增粘剂，赋形剂，香料，遮光剂，抗氧化剂，胶凝 剂，稳定剂，表面活性剂，軟化剂，着色剂，防腐剂，緩冲剂，其他 的渗透增强剂，及其他常规组分是本领域公知的。本文所用"施用/给药"是指对受试者口服给药，以栓剂给 药，局部接触，静脉内，腹膜内，肌内，病损内，鼻内或皮下给药， 或緩释装置(例如，小渗透泵)植入。术语"赋性剂，，通常已知是指用于配制对所需用途有效的 药物组合物的栽体，稀释剂和/或媒介物。本文所用术语"自体细胞"是指受试者自身的细胞或其克隆。本文所用术语"同种异体细胞"是指不是第一个受试者自 身的细胞，或其克隆，而是来源自第二受试者的细胞或其克隆，并且 该第二受试者和第一受试者为相同的物种。本文所用术语"异源细胞"是指不是来自第一个受试者自 身细胞的细胞，或其克隆，而是来源自第二受试者的细胞或其克隆细 胞，并且该第二受试者和第一受试者不为相同的物种。本文所用术语"千细胞，，是指能够分化成其他细胞类型的 细胞，包括那些具有特定、特化功能的细胞(例如，终末分化细胞， 例如红细胞，巨噬细胞等)。干细胞可依照其来源定义(成年/体干细 胞，胚胎干细胞)，或依照其潜能定义(全能性干细胞，多能性 (pluripotent )干细胞，多能性(multipotent)干细胞和单能性千 细胞)。本文所用术语"单能性千细胞，，是指只能产生一种细胞类 型的细胞，但是具有与非干细胞相区别的自我更新的性质。
本文所用"多能性(multipotent )干细胞，，或"祖细胞，， 是指可产生几种不同终末分化细胞类型的任何一种的细胞。这些不同 类型细胞通常紧密相关(例如，血细胞，例如红细胞，白血球和血小 板)。例如，间充质干细胞(也称为骨髓基质细胞)是多能性细胞， 并能够形成成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，神经元细胞， 和P-胰岛细胞。另一个例子为骨骼成肌细胞，其优选通过涉及个体细 胞融合为多核肌管的分化过程产生骨骼肌细胞。本文所用术语"多能性(pluripotent)干细胞"是指产生 一些或许多(然而并非全部)有机体细胞类型的细胞。多能干细胞能 分化成成熟有机体身体内任何细胞类型，虽然不经重编程它们不能重 新分化成其衍生而来的细胞。正如所理解的，"多能性(multipotent) 干细胞"/祖细胞(例如，神经干细胞)具有比多能性(pluripotent) 干细胞更窄的分化潜力。比多能性(pluripotent )干细胞更原始的另 一类细胞(例如，不必定进行特定分化)是所谓的"全能性"干细胞。本文所用术语"全能性干细胞"是指受精卵母细胞，以及 由受精卵细胞的最初几次分裂产生的细胞(例如，处于发育的二和四 细胞期的胚胎)。全能性细胞具有能够分化成特定物种的任何类型的 细胞的能力。例如，单个全能性干细胞可产生整个动物体，以,及在特 定物种(例如，人)中可发现的无数细胞类型中的任何一种。在本说 明书中，多能性(pluripotent)和全能性细胞，以及具有分化成完全 器官或组织潜能的细胞，被称为"原始"干细胞。本文所用术语"去分化"是指细胞回复到较不特化的状态。 在去分化后，这个细胞将具有分化成比重编程之前可能的细胞类型更 多或不同的细胞类型的能力。反向分化的过程(即去分化)可能比分 化更复杂，并且需要"重编程"该细胞以变得更加原始。去分化的例 子为生肌祖细胞(例如早期初级成肌细胞)转化为肌肉干细胞或卫星 细胞。"正常"干细胞是指不展现异常表现型或具有异常基因型， 因此可产生来源于这些干细胞的整套细胞的干细胞(或其后代)。例
37如，若是正常的全能性干细胞，该细胞可产生，例如，完整，正常的 健康动物。相反，"异常的"干细胞是指例如由于一种或多种变异或 遗传修饰或病原体而失常的干细胞。因此，异常的干细胞不同于正常 的干细胞。"生长环境，，是干细胞体外增殖的环境。环境的特征包括 培养细胞的培养基，及如果存在，支持结构(例如在固体表面的基质)。"生长因子"是指对促进细胞生长有效的，除非加入到培 养基中作为补充，否则不是基本培养基组分的物质。另言之，生长因 子为不是被正在培养的细胞(包括任何伺养细胞，如果存在)分泌的 分子，或即便由培养基中由细胞分泌，也不是足够实现通过外源添加 生长因子而获得的结果的量。生长因子包括，但不限于，碱性成纤维 细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生 长因子(EGF)，胰岛素样生长因子-I (IGF-I)，胰岛素样生长因子 -II (IGF-II)，血小板衍生生长因子-AB (PDGF),血管内皮细胞生 长因子(VEGF)，苯丙酸诺龙-A，骨形态发生蛋白(BMPs),胰岛素， 细胞因子，趋化因子，成形素，中和抗体，其他蛋白质和小分子。本文所用术语"分化因子"是指诱导干细胞或祖细胞转化 为特定特化的细胞类型的分子。"胞外基质"或"基质"是指为支持细胞生长提供与饲养 细胞合成的胞外基质提供的条件基本相同的条件的一种或多种物质。 可在基材上提供该基质。或者，构成该基质的一种组分或多种组分可 以溶液形式提供。胞外基质的组分可包括层粘连蛋白，胶原和纤连蛋 白。本文所用术语"再生能力，，是指干细胞转化成分裂的祖细 胞和分化的组织特异性的细胞。本文所用术语"自我更新"是指无种系指定的增殖。
本文所用术语"排列对齐的(aligned)"是指在纤维性聚 合物支架内的纤维取向，其中至少50%的纤维取总方向，并且其取向 形成了一个排列均轴。任何给定纤维的取向可偏离排列均轴，且偏离可以用所述排列轴与纤维取向之间形成的角来表示。0°的偏角显示 精确排列对齐，90° (或-90° )显示该纤维与排列均轴垂直排列。在 一个示例性实施方案中，纤维与排列均轴的标准偏差可选自如下的角 度0° -1。 ， 0° -3° , 0。 -5。 ， 0° -10。 ， 0。 -15° , 0° -20。， 或0° -30° 。本文所用术语"杆"是指基本上为实心圓柱形状的纤维性 聚合物支架。空间和通道可存在于构成该杆的单个纤维之间。本文所用术语"管"是指基本上为圆柱状的物体。该管具 有内壁和外壁，内径，外径，和由管的内径以及其长度确定的内部空 间。空间和通道可存在于构成该管的单个纤维之间。本文所用术语"填充管，，是指该内部空间的一部分由填充 材料构成的管。该填充材料可为纤维性聚合物支架。空间和通道可存 在于构成该管的单个纤维之间。本文所用术语"接缝"或"缝合的"是指将两个部分通过 拟合，联结，或搭接连接在一起形成的接合点。这两个部分可由机械 方式，例如缝合，或由化学方法，例如退火或粘合剂保持在一起。例 如，接缝是通过将一个薄片区域与另一个区域结合形成。本文所用术语"无缝的"是指没有接缝。术语"细胞，，可指单个细胞或多个细胞的情况。本文所用术语"胞外基质组分"是指选自如下的组分层 粘连蛋白，胶原，纤连蛋白和弹性蛋白。本文所用术语"支撑架，，是由除其他物质外的金属和有机 聚合物制成的管。当该支撑架由有机聚合物组成时，该聚合物不是本 文所述的纳米纤维或微米纤维性聚合物支架。换句话说，如果所述支 撑架由纤维性聚合物支架组成，该纤维的平均直径将在IOO微米到约 50厘米之间。在一些情况下，整个支撑架能从第一直径膨胀到第二直 径，其中第二直径大于第一直径。本文所用的术语"水蛭素"是指65氨基酸野生型肽或其类 似物。65氨基酸野生型肽具有Folkers等在Biochemistry, 28 (6);
392601-2617 (1989)中描述的序列。水蛭素的类似物包括具有一种或多种 突变的肽、少数氨基酸，多种氨基酸，对一种或多种氨基酸残基的化 学修饰物及其组合。水蛭素的示例包括野生型水蛭素、比伐卢定、重 组水蛭素、地西路定、非硫化Tyr-63水蛭素、N-末端修饰的(即乙酰 化的)水蛭素、C-末端修饰的(即乙酰化的)水蛭素、N-末端结构域缺失 的水蛭素片段(约1-53残基)、C-末端结构域缺失的水蛭素片段(约 54-65个残基)、[Tyr(S03H)-63]-水蛭素片段54-65、 [Tyr (S 03H)-63]-水蛭素片段55-65、乙酰[Tyr(S 03H)-63]-水蛭素片段54-65、乙酰 [Tyr(S 03H)-63]-水蛭素片段55-65。用于本发明的水蛭素可以从多种 来源产生。在一些情况下，水蛭素是从水蛭病中分离的。在其他情况 中，水蛭素是从细菌、酵母或真菌中重组产生的。还有其他的情况， 水蛭素是化学合成的。重组和化学合成的水蛭素趋于产生均匀的产物。 而从水蛭病中分离的水蛭素可以包括一种以上的水蛭素类似物。水蛭 素可以从诸如Sigma-Aldrich(St. Louis， M0)—类的公司购买。符号^vxap,不论是用作键还是垂直于键的显示部分，都表
示所显示的部分连接于分子，例如聚合物的残余部分的点。 II.组合物这些组合物可包含聚合物支架。这些聚合物支架可为纤维 性聚合物支架，例如微纤维性聚合物支架或纳米纤维性聚合物支架。 这些聚合物支架还可以是微图案化聚合物支架。本发明的组合物和/ 或聚合物支架可任选地为非排列对齐或它们可为例如纵向或圆周排列 对齐的。本发明的组合物和/或聚合物支架可以任选地形成，例如，薄 片，十字交叉薄片，管，杆或填充管的形状。本发明的组合物和/或聚 合物支架可具有接缝或他们可以是无缝的。本发明的组合物或聚合物 还可任选地包括原料，例如细胞，生物分子，或药学上可接受的赋 形剂。这些排列，形状，和附加的组分可有助于改善或再生或取代生 物学功能。本发明组合物不包括支撑架。该组合物可被用于组织工程 以改善，再生或取代生物学功能。II a)纤维性聚合物支架第一方面，本发明提供了包含纤维性聚合物支架的組合物。 纤维性聚合物支架包括可具有一定范围直径的一种或多种纤维。在一 个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约 0. 1纳米到约50000纳米。在另一个示例性的实施方案中，纤维性聚 合物支架中纤维的平均直径为约25纳米到约25, 000纳米。在一个示 例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约50纳米 到约20，000纳米。在一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中 纤维的平均直径为约100納米到约5， 000纳米。在一个示例性的实施 方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约l，OOO纳米到约 20，000纳米。在一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维 的平均直径为约IO纳米到约1， 000纳米。在一个示例性的实施方案中， 纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约2, 000纳米到约10， 000纳 米。在一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直 径为约0. 5纳米到约100納米。在一个示例性的实施方案中，纤维性 聚合物支架中纤维的平均直径为约0. 5纳米到约50纳米。在一个示例 性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约l纳米到 约35纳米。在一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的 平均直径为约2纳米到约25纳米。在一个示例性的实施方案中，纤维 性聚合物支架中纤维的平均直径为约90纳米到约1， 000纳米。在一个 示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架中纤维的平均直径为约500 纳米到约1, 000納米。在一个示例性实施方案中，纤维性聚合物支架选自纳米纤 维性聚合物支架和微米纤维性聚合物。微米纤维性聚合物支架具有微 米尺度特征(平均纤维直径约l，OOO纳米到约50，000纳米，和尤其约 l,OOO纳米到约20， 000纳米)，而纳米纤维性聚合物支架具有亚微米 尺度特征(平均纤维直径约IO纳米到约l，OOO纳米，和尤其50纳米 到约1， 000纳米)。这些聚合物支架的每一个可模仿治疗区域的物理结构。例如天然胶原纤维或其他的胞外基质。多种聚合物(合成和/或天然来源的)可用于构成这些纤维 性聚合物支架。纤维可由单体或亚基制得。例如，可利用乳酸或聚(乳 酸)或羟基乙酸或聚羟基乙酸形成聚丙交酯(PLA)或聚(L-丙交酯) (PLLA)纳米纤维或聚(乙交酯)(PGA)纳米纤维。纤维还可由多于 一种的单体或亚基制得从而形成共聚物，三元共聚物等。例如，乳酸
或聚(乳酸)与羟基乙酸或聚羟基乙酸结合形成该共聚物聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)。用于本发'明的其他共聚物包括聚(乙烯-共 聚-乙烯醇)。在一个示例性的实施方案中，纤维包括选自如下的聚合 物或亚基脂肪族聚酯，聚环氧烷烃，聚二曱基硅氧烷，聚乙烯醇， 聚赖氨酸，胶原，层粘连蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白，藻酸盐，纤维 蛋白，透明质酸，粘蛋白，多肽及其组合。在另一个示例性的实施方 案中，纤维包括选自如下组分的两种不同聚合物或亚基脂肪族聚酯， 聚环氧烷烃，聚二甲基硅氧烷，聚乙烯醇，聚赖氨酸，胶原，层粘连 蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白，藻酸盐，纤维蛋白，透明质酸，粘蛋白， 多肽及其组合。在另一个示例性的实施方案中，纤维包含选自如下组 分的三种不同聚合物或亚单元脂肪族聚酯，聚环氧烷烃，聚二甲基 硅氧烷，聚乙烯醇，聚赖氨酸，胶原，层粘连蛋白，纤连蛋白，弹性 蛋白，藻酸盐，纤维蛋白，透明质酸，粘蛋白，多肽及其组合。在一 个示例性的实施方案中，该脂肪族聚酯为直链或分支的。在另一个示 例性的实施方案中，该直链脂肪族聚酯选自如下乳酸(D-或L-)， 丙交酯，聚(乳酸)，聚(丙交酯)，羟基乙酸，聚(羟基乙酸)，聚 (乙交酯)，乙交酯，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)，聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)，聚己酸内酯及其组合。在另一个示例性的实施方案中， 该脂肪族聚酯是分支的并包含选自如下的至少一种连接到连接物或 生物分子的乳酸(D-或L-)，丙交酯，聚(乳酸)，聚(丙交酯)，羟 基乙酸，聚(羟基乙酸)，聚(乙交酯)，乙交酯，聚(丙交酯-共聚 -乙交酯)，聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)，聚己酸内酯及其組合。在另 一示例性的实施方案中，其中所述聚环氧烷烃选自如下聚环氧乙烷，聚乙二醇，聚环氧丙烷，聚丙二醇及其组合。在某些实施方案中，该纤维性聚合物支架由单个连续纤维 组成。在其他实施方案中，该纤维性聚合物支架由至少二，三，四， 或五种纤维组成。在一个示例性实施方案中，该纤维性聚合物支架中 的纤维的数量选自2-100,000。在一个示例性实施方案中，该纤维性 聚合物支架中的纤维的数量选自2-50,000。在一个示例性实施方案 中，该纤维性聚合物支架中的纤维的数量选自50， 000-100， 000。在一 个示例性实施方案中，该纤维性聚合物支架中的纤维的数量选自 10-20， 000。在一个示例性实施方案中，该纤维性聚合物支架中的纤维 的数量选自15-1， 000。该纤维性聚合物支架可包含至少一种组合物的纤维。在一 个示例性的实施方案中，该纤维性聚合物支架包含许多不同类型的纤 维，且该数选自1， 2， 3, 4， 5， 6， 7, 8， 9和10中的一个。在另一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架的一个 或多个纤维为可生物降解的。在另一个示例性的实施方案中，该纤维 性聚合物支架的纤维包含可生物降解的聚合物。在另一个示例性实施 方案中，该可生物降解聚合物包含选自乳酸和羟基乙酸的单体。在另 一个示例性实施方案中，该可生物降解聚合物是聚(乳酸)，聚(羟 基乙酸)或其共聚物。优选的可生物降解聚合物是由美国食品与药物 管理局批准的用于临床使用那些物质，例如聚(乳酸)和聚(羟基乙 酸)。在另一个示例性的实施方案中，本发明的可生物降解聚合物支 架可用于引导工程化组织的形态形成并在该组织集合之后逐渐降解。 该聚合物的降解率可通过本领域技术人员调整以与该组织的生成率相 匹配。例如，如果快速生物降解的聚合物是所需的，可选择约50:50 PLGA的组合。其他增加聚合物支架生物降解性的方式包括选择更亲水 的共聚物(例如，聚乙二醇)，减小聚合物的分子量，因为较高的分 子量通常意味着较慢的降解率，和改变孔隙率或纤维密度，因为较高 的孔隙率和较低的纤维密度通常导致更大的吸水率和更快的降解。在 另一个示例性的实施方案中，该组织可选自如下肌肉组织，血管组
43织，神经组织，脊髓组织和皮肤组织。在另一个示例性的实施方案中， 肌细胞，肌管，和骨骼肌肌肉组织聚集之后逐渐降解。 纤维性聚合物支架的制造方法本发明的聚合物支架可以多种方式制造。在一个示例性的 实施方案中，该聚合物支架可通过静电纺纱制造。静电纺纱是一种导 电流体的雾化过程，其利用静电场和该导电流体之间的相互作用。当 外部静电场施加于导电流体时(例如，半稀释聚合物溶液或聚合物熔 体)，形成了悬浮圆锥形的微滴，从而该微滴的表面张力与该电场平 衡。在该静电场足够强以克服该液体的表面张力时，发生静电雾化。 然后该液滴变得不稳定且细小的射流从该微滴的表面射出。在它到达 接地目标的同时，可将该材料收集为互相连接的网，该网含有相对细 小，即小直径纤维。由这些小直径纤维得到的薄膜(或膜)具有非常 大的表面面积与体积的比率和小的孔径尺寸。静电纺纱设备的详细说 明在Zong， et al. ， Polymer, 43 ( 16 ) :4403-4412 ( 2002 ); Rosen etal.， Ann Plast Surg. ， 25: 375-87( 1990 ) Kim， K. ， Biomaterials 2003, 24， (27) , 4977—85; Zong， X， Biomaterials 200， 26， (26 ) , 5330-8中提供。在静电纺纱之后，可利用挤出工艺和铸模工 艺进一步成型该聚合物。为了将纤维组织调节成排列对齐的纤维性聚 合物支架，利用图案化电极，巻丝筒集电极，或后加工方法例如单轴 拉伸可以成功。Zong, X. ， Biomaterials 2005， 26， (26)， 5330-8; Katta， P. ， N ano Lett 2004， 4， ( 11 ), 2215-2218; Li， D.， Nano Lett 2005，5, ( 5 ) ， 913 -6。可以几种方式中一种制造聚合物溶液。 一种方法包括将单 体聚合和在适当的溶剂中溶解所产生的聚合物。该过程可以在喷射组 件中实现或其可随后载入到喷射组件内。另一种方法包括购买商品化 的聚合物溶液或商品化的聚合物和将他们溶解以生成聚合物溶液。例 如，PLL可以从DuPont (Wilmington,DE )，聚(丙交酯-共聚-乙
44交酉旨)可以从Ethicon (Somerville， NJ )和Birmingham Polymers (Birmingham, AL )购买，Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)和 Polysciences (Warrington, PA)购买。其他制造商包括Lactel Absorbable Polymers (Pelham， AL )。其他本发明的聚合物支架组分， 例如细胞和生物分子也是商品化的，可购自供应商例如Invitrogen (SDiego， CA) ， Cambrex ( Walkersvi 1 le， MD ) ， Sigma-Aldrich， Peprotech ( Rocky Hill, NJ ) , R & D Systems ( Minneapol is, MN ), ATCC ( Manassas, VA ) , Pierce Biotechnology ( Rockford， IL)。用于形成聚合物支架的聚合物首先溶于溶剂。该溶剂可以 是任何溶剂，该溶剂能够溶解该聚合物单体和/或亚基和提供能够导电 和静电纺纱的聚合物溶液。典型的溶剂包括选自如下的溶剂N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃(THF) ， 二氯曱烷，二氧杂环己烷， 乙醇，六氟异丙醇(HFIP)，氯仿，水及其组合。该聚合物溶液可任选含有产生过量电荷作用以促进该静电 纺纱过程的盐。适合的盐的例子包括NaCl, KH艮K2HP04， KI0" KCl， MgSO,， MgCl" Na跳，CaCl2或这些盐的混合物。形成该导电流体的聚合物溶液优选具有约1 wt %-约80 wt %的聚合物浓度，更优选约8 wt %-约60 wt %。导电流体优选具有约 50 mPX s-约2000 mPX s的粘度，更优选约200 mPX s-约700 mPX s。在静电纺纱过程中产生的电场优选在约5 kV-约100 kV的 范围内，更优选约10 kV-约50 kV。该导电流体进料到喷丝头(或电 极)的速度优选在约0. 1微升/分钟-约1000微升/分钟的范围内，更 优选在约1微升/分钟-约250微升/分钟。单个或多个喷丝头位于平台上，该平台可调，改变平台和 接地集电极基材之间的距离。该距离可以是任何允许溶剂在聚合物与 接地集电极基材接触之前基本完全蒸发的距离。在一个示例性的实施 方案中，这个距离可在1 cm到25 cm之间变化。增加接地集电极基材 和该平台之间的距离通常可制造更细的纤维。在需要旋转芯轴的静电纺纱的情况下，该芯轴和电动机通
45常通过钻夹头机械连接。在一个示例性实施方案中，该电动机以约1
rpm-约500 rpm的速度旋转芯轴。在另一个示例性实施方案中，该电 动机以约200 rpm-约500 rpm的速度旋转芯轴。在另一个示例性实施 方案中，该电动机以约l rpm-约100 rpm的速度旋转芯轴。本文描述了用于静电纺纱过程和设备的其他实施方案或修改。
导电流体的电/机械性能的变化由静电纺纱制造的所得膜的性质受该导电流体的电性能和 机械性能影响。该聚合物溶液的导电率可通过添加离子无机/有机化合 物来剧烈改变。该聚合物溶液的磁流体力学性质可依赖于物理和机械 性能的组合，(例如，液体的表面张力，粘度和粘弹性)和电性质(例 如，液体的电荷密度和极化度)。例如，通过添加表面活性剂到聚合 物溶液中，可减少流体表面的张力，以致该静电场可以在更宽的条件 范围内影响该射流形状和该射流。通过耦联可将流速控制在恒定压力 下或在恒定流速下的喷射泵，可减轻该导电流体粘度的影响。
电极设计在另一个用于制造本发明膜的实施方案中，在静电纺纱期 间进一步优化射流形成过程以提供对纤维尺寸更好的控制。并非如上 所讨论的仅提供带电喷丝头和接地板，带正电的喷丝头仍对该聚合物 溶液微滴的形成负责且中心具有小出口孔的电极板对该射流的形成负 责。该出口孔提供了使射流穿过该电极板的工具。因此，如果带正电 的喷丝头上的该聚合物微滴具有2-3 mm的典型尺寸和该电极板位于距 离该喷丝头约10 mm处，可以形成合理的静电势。两个电极之间的短 距离意味着静电势可相当低。但是，该所得的电场强度对于静电纺纱 过程可以是足够强的。通过改变喷丝头的电势，可控制和调节射流的 形成。这样的电极构造将大大减少喷丝头上需要的外加电势，典型地， 从约15 kV下降到约1.5-2 kV (相对于地面板极电势)。对稳定射流
46形成所需的确切喷丝头电势依赖于特定导电流体的电/机械性能。 射流加速和输送的控制在另一个制造本发明聚合物支架优选的实施方案中，射流 射程也是精确控制的。通过该电极板出口孔的射流是带正电的。虽然， 该流体具有在飞行时自身矫直的倾向，在无外部电场限制下，射流在 其轨线上很快变得不稳定。换句话说，该带电流体开始散开，导致对 流体的微观和宏观特性失去控制。该不稳定性可以通过在电极板和一 系列(等)间隔电极板之后立即使用小心设置的试探电极来去除。该 电极组件(或复合电极)，即，试探电极和电极板，可产生沿着(直 的)飞行路线静电势的均匀分布。通过将喷丝头的基础电势置于比目 标(接地电势)高约+20到+ 30 kV，同时调节试探电极的静电势低于 该电极板的基础电势来形成加速电势。该复合电极能够将射流递送到 所需的目标区。该复合电极还将用于操作该射流。通过改变静电势， 改变射流的加速度，导致形成的聚合物纤维的直径变化。这个静电势 变化改变了射流的稳定性，因此，复合电极的相应改变可用于稳定新 的射流。这些程序可用于在静电纺纱过程期间微调和改变的纤维直径。
喷射操作在又一个的实施方案中，射流可以通过使用广泛用于高能 物理学的加速器技术的"交变梯度，，(AG)技术来聚焦。基本思想是 使用两对静电四极透镜。第二个透镜具有与第一个透镜相同的几何排 列而具有反转的(交替的)电梯度。带正电的射流将会聚集，例如， 在第一个透镜之后的xz平面内，然后在第二个透镜之后的yz平面内 重新聚集。注意Z轴方向表示起始飞行路径的方向。通过将附加的三 角形波形信号施加到一对四极上的电势，该喷射可以席巻目标区，使 射流的方向处于控制之中。此外，由于变化的"席巻"电势信号波形， 在目标上可形成所需的图案。具有单独芯轴的静电纺纱设备静电纺纱聚合物纤维可沉积在静止或旋转的基材上。过去， 静止金属集电极用于静电纺纱纤维的随机沉积。在静电纺纱期间使用 旋转金属芯轴。旋转金属芯轴引起在芯轴表面上纤维的随机沉积，当 除去芯轴时其可制造管。具有圆周纤维排列对齐的管也可以通过修饰 该方法和高速(〉100rpm)旋转芯轴来制造。如果大直径和/或长度的 转鼓用作集电极基材，非排列对齐和排列对齐的纤维性聚合物支架薄 片可通过从该转鼓切割并除去沉积的纤维性聚合物支架而制造。之前 也已显示在静止金属集电极内部制造气隙(孔)诱发了穿过间隙沉积 的静电纺纱纤维的排列(Li， D. ， Wang Y。 LL， Xia, Y。 N.， Electrospinning of Polymeric 和 Ceramic Nanofibers as Uniaxially Aligned Arrays。 Nano Letters, 2003。 3(8) : p。 1167-71)。但是，在Li，或任何其他文献中，都没有对排列对齐的 三维管或杆的制造或直接由纵向排列对齐的纤维构成的静电纺纱管或 杆的描述。在另一个方面，本发明包括在旋转芯轴上对排列对齐纤维 性聚合物支架静电纺纱的方法。这些纤维性聚合物支架可以用户所需 的任何取向排列。在一个示例性实施方案中，该支架基本纵向或基本 圆周排列。通过这个方法产生的纤维性聚合物支架既可以具有接缝也 可以是无缝的。在一个示例性的实施方案中，纤维性聚合物支架是无 缝的。在另一个示例性实施方案中，纤维性聚合物支架在沿着与该聚 合物支架纵轴基本平行的方向上是无缝的。在另一个方面，本发明包括允许无缝管，无缝填充管和无 缝杆静电纺纱的单独芯轴。在另一个示例性实施方案中，该无缝管， 无缝填充管和无缝杆具有非排列对齐的纤维取向。在另一个示例性实 施方案中，该无缝管，无缝填充管，无缝杆的纤维是排列对齐的。在 另一个示例性实施方案中，该无缝管，无缝填充管，无缝杆具有基本
纵向排列对齐的纤维。在另一个方面，本发明包括允许整体形成的管，填充管和
48杆静电纺纱的单独芯轴。在另一个示例性实施方案中，该整体形成管， 填充管和杆具有非排列对齐的纤维取向。在另一个示例性实施方案中， 该整体形成管，填充管和杆的纤维是排列对齐的。在另一个示例性实 施方案中，该整体形成管，填充管和杆具有基本纵向排列对齐的纤维。在一个示例性实施方案中，芯轴与能够以其纵轴为中心旋 转芯轴的发动机装置连接。在静电纺纱设备中，该旋转芯轴是接地的 并位于喷丝头的下面。聚合物溶液被递送到喷丝头的尖端并通过电源 使带电。在喷丝头和芯轴之间产生的电场诱发喷丝头顶端的带电聚合 物溶液形成喷射。该喷射向芯轴方向喷射。该聚合物接触芯轴的一导 电区然后接触该芯轴的第二导电区，穿过该芯轴不导电区或气隙沉积。 这导致形成了排列对齐纤维沉积在不导电区或气隙上。通过旋转芯轴， 得到排列对齐纤维的均匀涂敷层。该沉积纤维层与芯轴或芯轴之间的 气隙的形状一致，因此在有些情况下形成薄片，在有些情况下为管或 在其他的情况下为杆。包含薄片，管或杆的纤维会沿着管或杆的长度 方向排列，因此形成了具有纵向排列对齐纤维的薄片，管或杆。在一 个示例性的实施方案中，该管或杆是无缝的。在另一个示例性实施方 案中，该管或杆沿与该管或杆的长轴基本平行的方向是无缝的。在一个实施方案中，本发明提供了具有至少两导电区和至 少一个不导电区的芯轴。这样的芯轴可以许多方式设计；该芯轴的示 例性描述提供于图3B和作为制造本发明薄片和/或管设备一部分的 芯轴的描述叙述在图1， 2， 2A，和2B中。在一个示例性的实施方案 中，导电材料是金属。在另一个示例性实施方案中，该金属选自钢和 铝。 一种情形下，导电芯轴的区域可由不导电材料覆盖。这个芯轴的 示例性横截面提供于图3D。在一个示例性实施方案中，该不导电材料 选自如下胶带，绝缘胶带，聚四氟乙烯，和塑料。另一种情形下， 可制造具有至少三个部分， 一个互连两个导电芯轴区的不导电区。另 一个情形下，不导电区为在两个导电芯轴区之间延伸的不连续部分。 这个芯轴的示例性横截面提供于图3C。附加不导电区可通过将不导电 区置于该芯轴的导电区之上，或通过互连在芯轴两个导电区之间的不
49导电区添加到该芯轴上。这些附加不导电区，如果与附加喷丝头结合使用，可同时促进在相同芯轴上不止一个管的生产。在一个实施方案中，本发明提供了具有至少三导电区和至少两个不导电区的芯轴。在一个实施方案中，本发明提供了具有至少四导电区和至少三个不导电
区的芯轴。在一个实施方案中，本发明提供了具有至少五导电区和至少四个不导电区的芯轴。在一个实施方案中，本发明提供了具有第一导电区，第二导电区和在第 一导电区和第二导电区之间气隙的芯轴。这样的芯轴可以许多方式设计；该芯轴的示例性描述提供于图3E。该芯轴作为生产本发明杆设备的一部分的示例性描述描述在图6, 7,和7A。提供的具有多头喷丝头的实施方案描述在图11中。在一个示例性的实施方案中，导电材料是金属。在另一个示例性实施方案中，该金属选自钢和铝。在一个示例性实施方案中，芯轴的各导电区与另一个排列成行。在一个示例性实施方案中，芯轴的各导电区与能够以相同速度旋转的组件连接。这可通过将电动机组件连接到芯轴的各导电区和保证各电动机在相同的速度下运转来实现。这也可通过保证芯轴的各导电区与相同的电动机连通来实现。在静电纺纱完成之后，本发明的聚合物支架从芯轴上移开。对于薄片支架聚合物，该薄片可从芯轴剥离。对于管聚合物支架，该芯轴可从电动机组件内取出，然后移出管。在一些实施方案中，移出还可通过将在中间的芯轴拆开或也还可通过切割管来实现。对于杆聚合物支架，该杆可从导电区的金属端剥离。某些情形下，该沉积纤维的长度不是等同的，导致在聚合物支架的一端或两端为锯齿状边缘。任选地，为了产生具有基本相同尺寸长度的聚合物支架，可切割该聚合物支架的一端。当聚合物支架在芯轴上时，或在其已从芯轴移开之后，可进行这样的切割。本文描述的该聚合物支架的特征可通过变化多个参数来改变。例如。有几个方法，其既可以单独使用也可以结合使用，可减少纤维性聚合物支架内纤维的平均直径。 一种方法是添加更多的盐到该
50聚合物溶液中。在聚合物溶液中使用极性更强的溶剂也易于降低平均纤维直径，在喷丝头和芯轴之间增加距离也起到同样的作用。減少支架直径其他方法包括增加设备的电压和增加聚合物的浓度。多层聚合物支架可由本文所述的通过完成几个芯轴旋转的方法来形成。例如，多层管可以由完成几个芯轴的旋转来形成。也可制造其他具有多于一种类型的层的聚合物支架。在一个示例性实施方案中，该纤维的圆周排列也可通过改变芯轴旋转的速度而调节或变化。因此可以制造具有内部纵向排列层和外部圆周排列层的聚合物支架。为了制造具有特定排列各层的多层空心管支架，可以使用各种芯轴和转速。在一个示例性实施方案中，将空心管形纤维性支架制造为具有纵向排列对齐的腔层和圆周排列对齐的纤维外层。制造这样的支架的一种方法包括使用如前所述的具有不导电区的芯轴。该芯轴低速旋转以允许由纵向排列对齐纤维组成的管形纤维性支架的形成。然后增加芯轴的转速，其引起静电纺纱纤维在沿围绕纵向排列对齐的纤维性管的圆周排列。在另一个示例性实施方案中，内层纵向排列而该外层由随机排列对齐的纤维组成。这可通过使用之前描述的相同装置实现，除了当形成外层时，该芯轴以防止纤维纵向和圓周排列对齐的中速旋转。
II. b)微图案化的聚合物支架在第二方面，本发明提供了包含微图案化的聚合物支架的组合物。因为微图案化，软蚀刻技术用于形状或化学改变该聚合物的空间和几何组织以在基材表面生成微米尺度特征。Taylor， A。 M.，NatMethods 2005， 2, (8) ， 599-605; Dow, J。 A. ， J Cel 1 Sci Suppl1987, 8, 55-79; Kane， R。 S. ， Biomaterials 1999, 20， ( 23-24 )，2363 -76。由这些技术生成的聚合物支架可用于控制细胞行为的许多方面，包括细胞尺寸，形状，空间组织，增殖和生存。Chen， C.S.，Science 1997， 276， ( 5317 ) ， 1428-8; Bhatia， S. N. ， Faseb J1999， 13， (14)， 1883-900; Deutsch, J. ， J Biomed Mater Res2000, 53， (3) ，267—76;Folch, A.，謹Rev Biomed Eng 2000，2， 227-56; Whitesides， G. M. , A画Rev Biomed Eng 2001, 3,335 -73。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)是一种可通过微图案化具有高再生性，并可为细胞连接提供柔韧基材的弹性体。Wang,N. ， CellMotil Cytoskeleton 2002， 52， (2) ， 97-106。
II. c)聚合物支架的排列本发明的聚合物支架可具有排列取向或随机取向。在排列取向内，包含聚合物支架的至少50%纤维是沿着排列均轴取向。在一个示例性实施方案中，该组合物具有选自如下的排列基本纵向的，基本圆周的和十字交叉的。当纤维在沿着管、填充管或杆状的聚合物支架长轴方向排列时，存在纵向排列。当纤维是沿着聚合物支架短轴方向排列时，存在圆周排列。当组合物中的一种聚合物支架纤维以第一聚合物支架排列均轴相对于第二聚合物支架(其与第
一聚合物支架邻接)排列均轴成一定角度的方式排列时，存在十字交叉的排列，纵向排列或圆周排列对齐的聚合物支架可以具有不止一层的纤维。十字交叉排列聚合物支架需要不止一层的纤维。在另一个示例性实施方案中，聚合物纤维具有与纤维束中心轴的标准偏离。在一个示例性实施方案中，所述纤维的标准偏离选自如下约0° -约1° ，约0° -约3° ，约0° -约5° ,约0° -约10° ，约0° -约15° ，约0° -约20° ,和约0° -约30° 。排列的聚合物支架对细胞骨架的排列，细胞迁移和细胞功能具有深刻的影响。排列的聚合物支架可以诱导和引导细胞迁移因此提高组织的再生。这样的支架是解决多种组织例如肌肉，血管组织，神经和脊髓再生最有前景的方法。例如，纵向排列对齐的纤维性聚合物支架可以提高和特定引导神经，皮肤，肌肉和/或血管组织穿过损伤间隙生长。其中排列的聚合物支架位于的方向可影响替换或改善排列的聚合物支架的生物学功能。例如，当排列聚合物支架位于伤口内，伤口愈合更快，此时排列对齐的聚合物支架垂直于而不是平行于伤口
52的长轴。在一个示例性实施方案中，该束排列对齐的聚合物支架的中心长轴位于垂直于改善或替换排列的聚合物支架的材料的方向。在另一个示例性实施方案中，该束排列对齐的聚合物支架的中心长轴位于与改善或替换排列聚合物支架的材料方向平行的方向。在另一个示例性实施方案中，本发明的排列的组合物(例如聚合物支架)可包含可生物降解聚合物。这些组合物可用于引导其他类型具有各向异性结构组织的形态形成，例如，神经，皮肤，血管，骨骼肌，心肌，腱和韧带。本发明这些排列，可生物降解的组合物还可用于三维组织的形成。使用静电纺纱可生物降解的纤维性聚合物支架，可以生成神经组织，脊髓组织，皮组织，血管组织和肌肉组织的三维构造。在一个示例性实施方案中，本文所述组合物可包含不止一个聚合物支架。那些聚合物支架的每一个可具有与组合物中其他一个或多个聚合物支架相同或不同的排列。在一个示例性实施方案中，该组合物包含两个聚合物支架。第一聚合物支架有管形状且是纵向排列对齐的。第二聚合物支架围绕第一个聚合物支架的外部和具有选自如下取向的取向随机，圆周，十字交叉，和纵向。在一个示例性实施方案中，第二个聚合物支架的取向选自随机和圓周。
II.D)聚合物支架的形状/制造聚合物支架的方法
技术领域：
本发明的聚合物支架可形成为多种形状，依赖于解决问题的性质。本发明的组合物和/或聚合物支架具有各种尺寸。在一个示例性实施方案中，聚合物支架是0.1 mm-50 cm长。在另一个个示例性实施方案中，该聚合物支架是O. lmm-lmm长。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架是lmm-lcm长。在另 一个示例性实施方案中，该聚合物支架是lcm-10 cm长。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架是10cm-50cm长。在另 一个示例性实施方案中，该聚合物支架
53是lcm-5 cm长。在另 一个示例性实施方案中，该聚合物支架是2. 5cm-15 cm长。在另 一个示例性实施方案中，该聚合物支架是5mm-6cm长。在另一个示例牲实施方案中，该聚合物支架是8mm-3cm长。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架是10cm-25cm长。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架是0. 5cm-2cm长。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架是O. lcm-2cm长。本发明组合物和/或聚合物支架可由各种纤维层组成。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约1-约2,000个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约1-约l，OOO个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约1-约500个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约1-约20个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约1-约10个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约5-约25个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约500-约1， 500个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约10-约20个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约35-约80个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约10-约100个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约5-约600个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约10-约80个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约2-约12个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约60-约400个纤维层。在一个示例性实施方案中，该组合物具有约l， 200-约1,750个纤维层。在一个示例性实施方案中，聚合物支架具有薄片或膜的形状。聚合物支架膜可通过静电纺纱制成。在膜内部的各纤维可在使用转鼓作为集电极的静电纺纱期间或者在机械单轴拉伸之后排列。在另一个示例性实施方案中，该聚合物支架具有十字交叉状。为了形成十字交叉薄片，排列聚合物薄片或膜的层可以彼此以选自如下角度的角度排列大于20度但是小于160度，大于30度但是小于150度，大于40度但是小于140度，大于50度但是小于130度，大于60度但是小于120度，大于70度但是小于110度，和大于80 度但是小于100度。有制造十字交叉薄片的各种方式。在一个示例性实施方案 中，使用不含不导电区的旋转金属转鼓集电极。纤维排列层在鼓上生 成，然后将其从鼓上剥离。该排列层旋转90度然后放回鼓上。在该鼓 高速旋转的同时添加静电纤维的下一个附加层。其他十字交叉层可通 过重复这些步骤来添加。在另一个示例性实施方案中，使用有不导电 区的转鼓。此处，该转鼓緩慢旋转第一阶段使该纤维沉积并纵向排列 在不导电部分。然后该转鼓快速旋转从而该纤维被迫圆周排列。其他 的十字交叉层可通过重复这些步骤来添加。在另一个示例性实施方案中，聚合物支架具有管形。管的 示例性描述提供于图4A和管的横断面视图的示例性描述提供于图5A。 管可以具有各种尺寸，依赖于其长度，以及其内径和外径。在一个示 例性实施方案中，该管的内部空间基本上无纤维性聚合物支架。可变 化这些参数以适应，例如，多种组织的尺寸和应用。在一个示例性的 实施方案中，该管壁由排列对齐纤维组成。在另一个示例性实施方案 中，该纤维纵向排列或圆周排列。另一个示例性的实施方案中，该管 具有接缝。在另一个示例性实施方案中，该管的接缝基本与管的纵轴 平行。在另一个示例性的实施方案中，该管是无缝的。在另一个示例 性实施方案中，该管在管的纵轴平行方向上基本无缝。在另一个示例 性实施方案中，该管的内壁由纵向排列对齐的纤维层组成而管的外壁 由非排列对齐的纤维组成。在另一个示例性实施方案中，与该管的纵
轴平行的管是无缝的，和该管的内壁由纵向排列对齐纤维层组成而该 管的外壁由非排列对齐纤维组成。在这一情况下限定的管由于存在作 为外层鞘壳随机定向纤维显示出更大的结构完整性。在另一个示例性 实施方案中，管的内壁由非排列对齐随机取向的纤维组成而管的外壁 由纵向排列对齐的纤维层组成。在另一个示例性实施方案中，这个与
55管纵轴平行的管是无缝的。在另一个示例性实施方案中，该管的内壁 由纵向排列对齐的纤维组成而管的外壁由圆周排列对齐的纤维组成。 在另一个示例性实施方案中，这个与管纵轴基本平行的方向的管是无 缝的。在一个示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距离 为约lnm到50,000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该管的内壁和 外壁之间的距离为约lnm到10, 000 nm。在另 一个示例性实施方案中， 该管的内壁和外壁之间的距离为约lnm到5，000 nm。在另一个示例性 实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距离为约lnm到500 nm。在另 一个示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距离为约lnm到50 nm。在另一个示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距离为约 lnm到5 nm。另一个示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距 离为约IO認到500 nm。在另 一个示例性实施方案中，该管的内壁和 外壁之间的距离为约100nm到1， 000 nm。在另 一个示例性实施方案中， 该管的内壁和外壁之间的距离为约5，000nm到15,000 nni。在另一个 示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距离为约20， 000nm到 50，000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该管的内壁和外壁之间的距 离为约75nm到600 nm。在另 一个示例性实施方案中，该管的内壁和 外壁之间的距离为约2， 000 rnn到7,000 nm。在一个示例性实施方案中，该管的内径为约lnm到50, 000 nm。在另 一个示例性实施方案中，在该管的内径为约lnm到10， 000 nm。 在另一个示例性实施方案中，在该管的内径为约lnm到5， 000 nm。在 另一个示例性实施方案中，在该管的内径为约lnm到500 nm。在另一 个示例性实施方案中，在该管的内径为约lrnn到50 nm。在另一个示 例性实施方案中，在该管的内径为约lnm到5 nm。在另一个示例性实 施方案中，在该管的内径为约10nm到500 nm。在另一个示例性实施 方案中，在该管的内径为约lOOnm到1, 000 nm。在另一个示例性实施 方案中，在该管的内径为约5，000nra到15,000 nm。在另一个示例性 实施方案中，在该管的内径为约20， OOOnm到50， 000 nm。在另一个示
56例性实施方案中，在该管的内径为约75nm到600 nm。在另一个示例 性实施方案中，在该管的内径为约2， 000 nm到7, 000 nm。本文所述的管可以多种方式制造。在一个示例性的实施方 案中，该管不是通过静电纺纱制造的。在另一个示例性实施方案中， 该管由随机无定向的纤维或随机无定向的聚合物支架组成。在一个示例性实施方案中，将纤维性聚合物支架薄片轧压 制造具有接缝的管。首先，纤维性聚合物支架薄片是通过静电纺纱制 造的。包含薄片的纤维可在静电纺纱期间排列。制造排列静电纺纱纤 维的某些方法包括使用转鼓作为接地集电极基材的方法或通过使用本 文所述芯轴的方法。在一个示例性的实施方案中，该芯轴是芯轴56A。 包含薄片的纤维也可在静电纺纱之后通过机械单轴拉伸排列。然后排 列对齐的纤维性聚合物支架薄片在芯轴周围轧压以形成管。该芯轴既 可在固定该管之前也可之后除去。在一个示例性实施方案中，然后将
与聚合物支架纵轴平行的薄片的两个端固定在一起以制造纵向排列对 齐的接缝管。在另一个示例性实施方案中，该薄片在该芯轴周围轧压 不止一次和该薄片的一端固定到管的一部分上以生成纵向排列对齐的
接缝管。通过退火(热)，粘合或缝合来实现该固定。粘合剂的例子 包括溶剂或生物学粘合剂例如血纤蛋白粘合剂和胶原凝胶剂。现在将详细参考本发明的几个实施方案，其例子在附图中 示例。尽管本发明将会结合随后实施方案详细描述，但应该理解他们 并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括 在由所附权力要求所限定的本发明的精神和范围内的备选方案，修改 方案和等价方案。在另一示例性实施方案中，本发明提供了无缝管。图l为 制造这样结构的静电纺纱设备30。聚合物溶液38,其包含溶于溶剂的 聚合物，包含在喷射组件36之内。该喷射组件36为喷射泵组件32 的 一部分，其中计算机34通过控制压力或流速来控制聚合物溶液排出 该喷射器的速率。任选地，可对所选喷丝头提供和控制不同的流速。 依赖于该聚合物支架所需的物理性质改变流速，即，膜的厚度，纤维直径，孔径尺寸，膜的密度等。该喷射器泵組件32将聚合物溶液进料到喷丝头42，该喷 丝头42位于平台44。该喷丝头为尖形，其允许喷射形成和递送而无 干扰。利用高压电源48通过电线41A将约10 kV-约30 kV的电压施 加到该喷丝头上。芯轴56A (其,如同图3B所提到的包括55， 57A和57B) 位于喷丝头42下面从而在带电喷丝头和芯轴56A之间形成电场。该电 场使一束聚合物溶液从该喷丝头喷出并喷射到芯轴56A,形成微米或 纳米直径的细丝或纤维46。该钻夹头使用接地线41B和41C接地。该芯轴56A连接与电动机52连接的第一钻夹头54 (连接 到不导电轴承60)和第二钻夹头54A (连接到不导电轴承60A)。该 电动机52与速度控制器50连接，该速度控制器50控制该电动机旋转 芯轴56A的速度。任选地，可提供不同的旋转速度。依赖于该聚合物 支架所需的物理性质改变旋转速度，即，膜的厚度，纤维直径，孔径 尺寸，膜的密度等。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供通过图2静电 纺纱设备制造的无缝管。这个设备类似于图1的设备，但还包括容纳 平台44的塔40。具有多层聚合物支架的管可以多种方式制造。在一个示例 性实施方案中，可将附加的聚合物支架薄片缠绕在本文所述的管外或 本文所述的管内。在一个示例性实施方案中，生成纵向排列对齐的纤 维性聚合物支架，其为无缝或具有接缝。然后非排列对齐的微米/納米 纤维纤维性聚合物支架薄片位于纵向排列管的周围以生成具有内部纵
向排列对齐的纤维层和外部非排列对齐的纤维层的双层管。具有其他 层数的管(3, 4， 5， 6等)是这些方法可能延伸。缝合或粘合剂可 任选地添加到该聚合物以维持这个结构。在另一个示例性实施方案中，生产纵向排列对齐的纤维性 聚合物支架，其为无缝或具有接缝。然后将圆周排列对齐纤维性聚合 物支架薄片置于纵向排列管的周围以形成具有内部纵向排列对齐纤维层和外部非排列对齐纤维层的双层管。缝合或粘合剂可任意地添加到 该聚合物以维持这个结构。在另一个示例性实施方案中，生成具有内壁和外壁的无缝 纤维性聚合物支架管，其中内壁由纵向排列对齐的纤维组成和外壁由 圆周排列对齐的纤维组成。在静电纺纱期间使用本文所述在不导电区 两侧具有两导电区的芯轴。该芯轴以低速旋转以形成纵向排列对齐纤 维的均匀沉积。然后该芯轴以高速旋转以形成圆周排列对齐纤维的均 匀沉积。得到无缝纤维性聚合物支架管，其具有内部纵向排列对齐的 纤维层和外部圆周排列对齐的纤维层。在另一个示例性实施方案中，生成具有内壁和外壁的无缝 纤维性聚合物支架管，其中内壁由纵向排列对齐的纤维组成和外壁由 圆周非排列对齐的纤维组成。上述在不导电区两侧具有两导电区的特 定芯轴在静电纺纱期间使用。该芯轴以低速旋转以形成纵向排列对齐 纤维的均匀沉积。然后该芯轴以中速旋转，该速度防止沉积纤维的纵 向和圆周的排列。得到无缝纤维性聚合物支架管，其具有内部纵向排 列对齐的纤维层和外部随机排列对齐的纤维层。在另一个示例性实施方案中，聚合物支架具有杆的形状。 杆的示例性描述提供于图4B和杆的横断面视图的示例性描述提供于 图5B。杆可以具有各种尺寸，依赖于其长度，以及其直径。也可以变 化杆内纤维的数量，这将影响该杆的密度。可变化这些参数以适应， 例如，各种组织的尺寸和应用。在一个示例性的实施方案中，该杆由 排列对齐纤维组成。在另一个示例性实施方案中，该纤维纵向排列或 圆周排列。另一个示例性的实施方案中，该杆具有接缝。在另一个示 例性实施方案中，杆的接缝基本与杆的纵轴平行。在另一个示例性的 实施方案中，该杆是无缝的。在另一个示例性实施方案中，该杆在与 杆纵轴平行的方向基本上是无缝的。在另一个示例性实施方案中，该 杆包括纵向排列对齐的纤维层，其被由非排列对齐纤维组成的管覆盖。
59在另一个示例性实施方案中，该杆在与杆纵轴平行的方向基本上是无 缝的，并且该杆包括纵向排列对齐纤维层，其被由非排列对齐纤维组 成的管覆盖。由于作为外层鞘壳随机定向纤维的存在，将在这一情况 下限定的材料设计为显示出更大的结构完整性。在另一个示例性实施 方案中，杆由非排列对齐的随机取向纤维组成而该管由纵向排列对齐 纤维组成。在另一个示例性的实施方案中，该杆在与杆纵轴平行的方 向基本上是无缝的。在另一个示例性实施方案中，该杆由纵向排列对 齐的纤维组成，其被由圆周排列对齐的纤维组成的管覆盖。另一个示 例性的实施方案中，该杆在与杆纵轴平行的方向基本上是无缝的。在一个示例性实施方案中，该杆的直径约lnm到50,000 nm。在另一个示例性实施方案中，该杆的直径为约lnm到10, 000 nm。 在另一个示例性实施方案中，该杆的直径为约lnm到5, 000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该杆的直径为约lnm到500 nm。在另一个示 例性实施方案中，该杆的直径为约lnm到50 nm。在另一个示例性实 施方案中，该杆的直径为约lnm到5 nm。在另 一个示例性实施方案中， 该杆的直径为约IO認到500 nm。在另 一个示例性实施方案中，该杆 的直径为约100nm到1， 000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该杆的 直径为约5，000nm到15, 000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该杆 的直径为约20， OOOnm到50， 000 nm。在另 一个示例性实施方案中，该 杆的直径为约75nm到600 nm。在另 一个示例性实施方案中，该杆的 直径为约2， 000 nm到7， 000 nm。本文所述的杆可以多种方式制造。在另 一个示例性的实施 方案中，该杆不是通过静电纺纱制造的。在另一个示例性实施方案中， 该杆由随机无定向的纤维或随机无定向的聚合物支架组成。在一个示例性实施方案中，将纤维性聚合物支架薄片轧压 制造具有接缝的杆。首先，纤维性聚合物支架薄片是通过静电纺纱制 造的。包含薄片的纤维可在静电纺纱期间排列。制造排列对齐的静电 纺纱纤维的某些方法包括使用转鼓作为接地集电极基材或本文所述芯 轴的方法。在一个示例性的实施方案中，该芯轴是芯轴56B。包含薄
60片的纤维也可在静电纺纱之后通过机械单轴拉伸排列。然后该排列对 齐的纤维性聚合物支架薄片自身轧压形成杆。然后该聚合物支架薄片 的一端固定在该杆的一部分上以生成纵向排列对齐的接缝杆。通过退 火(热)，粘合或通过缝线来将该薄片固定在一起。粘合剂的例子包 括溶剂或生物学粘合剂例如纤维蛋白粘合剂和胶原凝胶。现在将详细参考本发明的几个实施方案，其例子在附图中 示例。尽管本发明将会结合随后实施方案详细描述，但应该理解他们 并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括 在由所附权力要求所限定的本发明的精神和范围内的备选方案，修改 方案和等价方案。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了无缝杆。图6 为制造这样结构的静电纺纱设备80。聚合物溶液38,其包含溶于溶剂 的聚合物，包含在喷射组件36之内。该喷射组件36为喷射泵組件32 的一部分，其中计算机34通过控制压力或流速来控制聚合物溶液排出 该喷射器的速率。任选地，可对所选喷丝头提供和控制不同的流速。 依赖于该聚合物支架所需的物理性质改变流速，即，膜的厚度，纤维 直径，孔径尺寸，膜的密度等。该喷射器泵组件32将聚合物溶液进料到喷丝头42，该喷 丝头42位于平台44上。该喷丝头为尖形，其允许喷射形成和递送而 无干扰。利用高压电源48通过电线41A将约10 kV到约30 kV的电压 施加到该喷丝头上。芯轴56B (其如同图3C所提到的，包括57A， 57B和58) 位于喷丝头42下面。该芯轴56B具有第一导电区57和第一导电面"C， 第二导电区57B和第二导电面57D，从而在带电喷丝头和该芯轴 之间生成电场。该电场使 一 束聚合物溶液从该喷丝头喷出并喷射到芯 轴56B，形成在58内的微米或纳米直径的细丝或纤维。钻夹头使用接 地线41B和41C接地。第一导电区57A连接到第一钻夹头54(连接到不导电轴承 60)且第二导电区57B与第二钻夹头54A连接(连接到不导电轴承60A)，该第二钻夹头54A与电动机52A连接。电动机52和52A与速 度控制器50A连接，该速度控制器50A控制电动机旋转芯轴56B的速 度。任选地，可提供不同的旋转速度。依赖于该聚合物支架所需的物 理性质改变旋转速度，即，膜的厚度，纤维直径，孔径尺寸，膜的密 度等。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供通过图7静电 纺纱设备制造的无缝杆。这个设备类似于图6的设备，但还包括容纳 平台44的塔40。具有多层聚合物支架的杆可以多种方式制造。在一个示例 性实施方案中，可将附加的聚合物支架薄片缠绕在本文所述的杆外。 在一个示例性实施方案中，生成纵向排列对齐的纤维性聚合物支架， 其为无缝或具有接缝。然后非排列对齐的微米/纳米纤维的纤维性聚合 物支架薄片位于纵向排列杆的周围以生成具有内部纵向排列对齐纤维 层和外部非排列对齐纤维层的双层聚合物支架。具有其他层数的管(3，
4， 5， 6等)是这些方法的可能延伸。缝合剂或粘合剂可任选地添加 到该聚合物以维持这个结构。这些多层杆实施方案的一些也可称为"填 充管"。在另一个示例性实施方案中，生成纵向排列对齐的纤维性 聚合物支架，其为无缝或具有接缝。然后圆周排列对齐的纤维性聚合 物支架薄片置于纵向排列对齐的杆周围以形成具有内部纵向排列对齐 纤维层和外部圆周排列对齐纤维层的双层杆。缝合或粘合剂可任意地
添加到该聚合物以维持这个结构。在另一个示例性实施方案中，无缝纤维性聚合物支架具有 内部杆和外部管或套管，其中该内部杆由纵向排列对齐的纤维组成和 外部管或套管由圓周排列或随机排列对齐的纤维组成。无缝纵向排列 对齐纤维性聚合物杆支架如本文所述制造。为了形成圆周排列对齐纤 维的外部管或套管，芯轴的旋转增加到高速以允许围绕在纵向排列对 齐的纤维性聚合物杆周围的圓周排列对齐纤维的均匀沉积。或者，为 了形成随机排列对齐纤维的外部管或套管，芯轴的旋转增加到中速，
62该中速防止在纵向排列对齐的纤维性聚合物杆上沉积的纤维纵向和圓 周排列。在从芯轴中除去该支架杆时，得到具有具有内部杆和外部管 或套管的无缝纤维性聚合物支架，其中该内部杆由纵向排列对齐的纤 维组成和外部管或套管由圆周排列和非排列对齐的纤维组成。
填充管在一个示例性实施方案中，该聚合物支架具有填充管的形 状。该填充管可以如下制造(l)如本文所述形成管；和(2)用于填 充管的填充材料由纵向排列对齐纤维组成。该填充材料可以是松散的， 高孔隙度的材料。在一个示例性的实施方案中，该填充材料通过静电 纺纱制成排列对齐的纤维的薄膜。然后该材料直接插入到本文所述的 管内部，其以与该管的长轴平行的方向取向。另一个情况下，纵向排 列对齐纤维杆如本文所述制造。然后这个杆或者(l)直接插入到充 分形成的管内部或者(2)用作围绕纤维薄片轧压围绕的芯轴然后用缝 合剂或粘合剂密封以形成填充管。
II. f )附加组合物或聚合物支架组分 II. fl)细胞在一个示例性实施方案中，本文所述的组合物和/或聚合物 支架进一步包含细胞。该细胞可在组合物和/或聚合物支架的表面或包 埋其中或嵌入其中。在一个示例性实施方案中，该细胞共价连接到本 发明的组合物和/或聚合物支架或非共价与本发明的組合物和/或聚合 物支架联系。在某些实施方案中，该细胞被用于促进新組织的生长。 在一个示例性实施方案中，该细胞选自如下自体的(供体和受体是 相同的个体)，同种异体的(供体和受体不是相同的个体，但是来自 于相同的物种)和异源的(供体和受体来自于不同的物种)。在一个 示例性的实施方案中，该细胞不是干细胞。在一个示例性的实施方案 中，该细胞是干细胞。在一个示例性实施方案中，该细胞选自如下 成年干细胞和胚胎干细胞。在另一个示例性实施方案中，成年干细胞
63可以是间充质干细胞(MSC )(来源于骨髓)或衍生自脂肪组织(ADAS ) 的成年干细胞。在另一个示例性实施方案中，该千细胞选自如下单 能性干细胞，多能性(multipotent)干细胞，多能性(pluripotent ) 干细胞和全能性干细胞。在一个示例性的实施方案中，该细胞是祖细 胞。在另一个示例性实施方案中，祖细胞可以是成纤维细胞，成肌细 胞，神经祖细胞，生血祖细胞，和内皮祖细胞。在另一个示例性实施 方案中，该细胞选自成肌细胞和肌肉祖细胞。在另一个示例性实施方 案中，该细胞选自如下成年肌细胞，肌肉祖细胞，肌肉千细胞或其 结合。在另一个示例性实施方案中，该细胞选自如下成年血管细胞， 血管祖细胞，血管干细胞或其结合。在另一个示例性实施方案中，该 细胞选自如下成年神经细胞，神经胶质细胞，神经祖细胞，神经胶 质祖细胞，神经干细胞，神经上皮细胞或其结合。在另一个示例性实 施方案中，该细胞选自施旺细胞，成纤维细胞和血管细胞。在另一个 示例性实施方案中，该细胞选自如下成年皮肤细胞，皮肤祖细胞， 皮肤干细胞。近来，用于指导细胞生长，功能，和组织的納米纤维基 材的可行性已经在成纤维细胞，血管细胞，和间充质干细胞上得到证 明。Zong, X. ， Biomacromoleucles 2003， 4, (2)，416-23; LiD. ，Adv Mater 2004， 16， (4), 1151-1170; Boland， E。 D. ， Front Biosci 2004， 9， 1422-32; Bhattarai， S。 R。 Biomaterials 2004, 25, (13) ， 2592-602; Yoshimoto, H.，B, iomaterials 2003， 24， (12) 2077 82。在另一个实施方案中，本文所述的有细胞包埋的组合物和/ 或聚合物支架可被用于三维组织的发展。在另一个示例性实施方案中， 有成肌细胞包埋的聚合物支架可用于发展肌肉组织，神经细胞-包埋的 聚合物支架可用于发展神经组织，血管细胞包埋的聚合物支架可用于 发展血管组织，脊髓细胞包埋的聚合物支架可用于发展脊髓组织和皮 肤细胞包埋的聚合物支架可用于发展皮肤组织。细胞可以在静电纺纱或后-制造之后掺入该组合物和/或聚 合物支架内部。II. f2)生物分子生物分子(例如核酸，氨基酸，糖或脂质)可共价连接到 本文所述的组合物和/或聚合物支架或非共价连接到本文所述的组合 物和/或聚合物支架。在一个示例性实施方案中，所述生物分子选自如 下受体分子，胞外基质组分或生物化学因子。在另一个示例性实施 方案中，生物化学因子选自生长因子和分化因子。在一个示例性实施 方案中，所述生物分子选自糖胺聚糖和蛋白聚糖。在一示例性的实施 方案中，该生物分子选自如下肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸乙酰肝素 蛋白聚糖及其组合。在另一个示例性实施方案中，第一分子(其可能或可能不 是生物分子)共价连接到本发明的组合物和/或聚合物支架。这个第一 分子可用于与第二生物分子相互作用。在一个示例性实施方案中，第 一分子是连接物，和第二生物分子选自如下受体分子，生物化学因 子，生长因子和分化因子。在一示例性的实施方案中，第一个分子选 自如下肝素，硫酸乙酰肝素，疏酸乙酰肝素蛋白聚糖及其組合。在 一个示例性实施方案中，第二生物分子选自如下受体分子，生物化 学因子，生长因子和分化因子。在另一个示例性的实施方案中，第一 个分子通过连接物共价连接，在另一个示例性的实施方案中，连接物 包括选自如下的成员水溶性聚合物和非水溶性聚合物。在另一个实 施方案中，连接物包括选自如下的成员聚磷腈，聚(乙烯醇)，聚 酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，聚丙烯酰胺，聚亚烷基二醇，聚亚烷基 氧化物，聚对苯二甲酸亚烷基酯，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯卤化 物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙醇酸交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，聚(曱基丙 烯酸甲酯)，聚(曱基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙 烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(曱基丙烯酸异癸酯)，聚(甲 基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸曱酯)，聚(丙烯 酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯， 聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(乙酸乙烯酯)，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，普卢兰尼克，聚乙烯苯酚， 糖类(例如葡聚糖，直链淀粉，透明质酸，聚(唾液酸)，乙酰肝素，
肝素，等等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸 及其共聚物。在另一个示例性的实施方案中，连接物包括选自如下的 成员聚乙二醇("PEG")和聚丙二醇("PPG")或它们的混合物。在另一 个实施方案中，所述PEG或PPG包括许多单体亚单位，其数目是从约 1-约5000的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单 位数目是从约10到约1000的整数。在另一个示例性的实施方案中， 所述许多单体亚单位数目是从约IO到约500的整数。在另一个示例性 的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约20到约400的整数。 在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约20 到约250的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单 位数目是从约50到约200的整数。在另一个示例性的实施方案中，所 述许多单体亚单位数目是从约50到约125的整数。在另一个示例性的 实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约50到约100的整数。在 另 一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数目是从约60到约 90的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述许多单体亚单位数目 是从约60到约90的整数。在另一个示例性的实施方案中，所述连接 物选自二氨基聚(乙二醇)，聚(乙二醇)及其组合。对于不与肝素 结合的生物分子，直接缀合到聚合物支架或通过连接物(例如PEG, 氨基PEG和二氨基PEG )连接也是可行的。
I. a)抗血小板剂在一个示例性实施方案中，所述生物分子是抗血小板剂。
可用于本发明组合物的抗血小板剂的非限制性实施例包括腺苷二磷酸 (ADP)拮抗剂或P2Yu拮抗剂，磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，腺苷再摄取 抑制剂，维生素K拮抗剂，肝素，肝素类似物，直接凝血酶抑制剂， 糖蛋白1IB/III抑制剂，阿司匹林、非阿司匹林的NSAID、抗凝血酶， 以及可药用盐、异构体、对映体、包括无定形形式的多晶形，溶剂化物，水合物，共结晶，络合物，活性代谢物，活性衍生物和修饰物、 其前药等。 ADP拮抗剂或P2Yu拮抗剂阻断血小板细胞膜上的ADP受 体。这种P2Y12受体在血小板凝聚、通过纤维蛋白的血小板的交联方 面是重要的。这种受体的阻断通过阻断糖蛋白1Ib/IIIa途径的激活而 抑制了血小板的聚集。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板剂是 ADP拮抗剂或P2Yu拮抗剂。在另一个示例性的实施方案中，抗血小板 剂是噻吩并吡啶。在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P山2拮 抗剂是噻吩并吡啶。在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P2Y^拮抗剂是 选自如下的成员磺吡酮，噻氯匹定，氯吡格雷，prasugrel，R-99224 (由 Sankyo销售的 prasugrel 的活性代谢物)，R-1381727 ， R-125690(Lilly) , C-1330-7 ， C-50547(Mi1lennium Pharmaceuticals) ， INS-48821 ， INS-48824 ， INS-446056 ， INS-46060，INS-49162 ， INS-49266 , INS-50589 (Inspire Pharmaceuticals)和Sch-572423 (Schering Plough)。在另一个示例 性实施方案中，ADP拮抗剂或P2Y12拮抗剂是噻氯匹定盐酸盐 (TICLID )。在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P2Yu拮抗剂 是选自如下的成员磺吡酮，瘗氯匹定，AZD6140，氯吡格雷，prasugrel 及其混合物。在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P2Yu拮抗剂 是氯吡格雷。在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P山2拮抗剂 是选自如下的成员氯吡格雷酸式硫酸盐(PLAVIXTM)，氯吡格雷硫酸氢 盐，氯吡格雷氬溴酸盐，氯吡格雷甲磺酸盐，坎格雷洛四钠盐(AR-09931 MX)， ARL67085, AR-C66096 AR-C 126532，和AZD-6140(AstraZeneca)。 在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P^2拮抗剂是prasugrel。 在另一个示例性实施方案中，ADP拮抗剂或P2Yu拮抗剂是选自如下的 成员氯吡格雷，噻氯匹定，磺吡酮，AZD6140, prasugrel及其混合 物。PDE抑制剂是阻断磷酸二酯酶(PDE)的五个亚型中的一个
67或多个，防止细胞内第二信使-环磷腺苷(cAMP )和环单磷酸鸟苷(cGMP ) 被各种PDE亚型灭活的药物。在一个示例性实施方案中，抗血小板剂 是PDE抑制剂。在 一个示例性实施方案中，抗血小板剂是选择性的cAMP PDE抑制剂。在一个示例性实施方案中，PDE抑制剂是西洛他唑 (Pletal )。腺苷再摄取抑制剂防止细胞再摄取腺苷进入血小板、红细 胞和内皮细胞，导致细胞外的腺苷浓度增加。这些化合物抑制血小板 聚集并引起血管扩张。在一个示例性实施方案中，抗血小板剂是腺苷 再摄取抑制剂。在一个示例性实施方案中，腺苷再摄取抑制剂是潘生 丁 (Persantine )。维生素K抑制剂应用于人们用来防止血栓形成(血管中不 适当的凝块)。这对于初级和次级预防有深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗 死和中风倾向的人是有用的。在一个示例性实施方案中，抗血小板剂 是维生素K抑制剂。在一个示例性实施方案中，维生素K抑制剂是选 自如下的成员醋硝香豆素，氯苯双酮，双香豆素(Dicoumarol) ， 二 苯茚酮，双香豆素乙酯，苯丙香豆素，苯茚二酮，缘氯香豆素和华法 令。肝素是生物物质，有时从猪小肠制备。其通过激活抗凝血 酶III起作用，抗凝血酶III阻断凝血酶的凝血作用。在一个示例性 实施方案中，抗血小板剂是肝素或肝素的前药。在一个示例性实施方 案中，抗血小板剂是肝素类似物或肝素类似物的前药。在一个示例性 实施方案中，肝素类似物是选自如下的成员抗凝血酶III,贝米肝 素，法安明，达那肝素，伊诺肝素，磺达肝癸(皮下)，那屈肝素，栓 复欣，瑞维肝素，舒洛地希和亭托肝素。直接凝血酶抑制剂(DTIs)是通过直接抑制凝血酶而发挥抗 凝血剂作用(延迟血液凝固)的一类药物。在一个示例性实施方案中， 抗血小板剂是DTI。在另一个示例性实施方案中，DTI是单价的。在 另一个示例性实施方案中，DTI是二价的。在一个示例性实施方案中， DTI是选自如下的成员水蛭素，比伐卢定(IV)，重组水蛭素，地西
68卢定，阿加曲班(argatrob) (IV)，达比加群，达比加群酯(口服制剂)， 美拉加群，希美加群，其前药及类似物。糖蛋白IIB/IIIA抑制剂通过抑制血小板表面上的 GpIIb/III受体而起作用，从而防止血小板聚集和血栓形成。在一个 示例性实施方案中，抗血小板剂是糖蛋白1IB/IIIA抑制剂。在一个示 例性实施方案中，糖蛋白1IB/IIIA抑制剂是选自如下的成员阿昔单 抗，依替巴肽，tirofib及其前药。由于这些药物仅仅可通过静脉内 给药，因此糖蛋白1IB/IIIA抑制剂的前药对于口服给药是有用的。抗凝血酶也可以用于本发明。在一个示例性实施方案中， 抗血小板剂是适合用于口服给药形式的抗凝血酶。在另一个示例性实 施方案中，抗凝血酶是选自如下的成员阿替普酶，蝮蛇抗栓酶， treplase，溶栓蛋白酶，Drotrecogin alfa，纤维蛋白溶酶，蛋白C， 瑞替普酶，次鲁普酶，链激酶，替奈普酶，尿激酶。在一个示例性实施方案中，抗血小板剂是选自如下的成员 阿洛普令，贝拉普罗，阿司匹林钙-尿素，氯克罗孟，去纤苷，双苯唑 醇，依前列醇，吲哚布芬，伊洛前列素，吡考他胺，rivaroxab(口服 FXa抑制剂)treprostinil，三氟醋石克酸，或其前药。
连接生物分子和/或细胞到仿生支架的方法可以以多种方法将生物分子和/或细； 在一个实施方案中，生物分子可以非共价包埋或吸收到本文所述的第 一纤维性聚合物支架上。在另一个示例性实施方案中，生物分子是直接或通过连接 物共价连接到第一纤维性聚合物支架。共价连接是通过第一纤维性支 架上的互补反应性基团的与生物分子或细胞之间反应而形成的，或通 过第一纤维性支架上的连接物与生物分子或细胞之间反应形成的，或 第一纤维性支架和生物分子或细胞上的连接物之间反应形成的。
用于实施本发明的互补反应性官能团和反应类型是生物缀合物 化学领域的技术人员公知的。目前有利的可用于本发明的反应性官能团的反应类型是在相对温和的条件下进行反应的那些。这些包括但不 限于亲核取代(例如胺和醇与酰卣、活性酯的反应)，亲电取代(例如烯
胺反应)和加入碳-碳和碳-杂原子多键(例如Michael反应， Diels-Alder加成反应)。这些和其他有用的反应描述在例如March, Advanced Organic Chemistry,第三版，John Wi ley & Sons， New York, 1985;Hermanson， Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996;和Feeney等，Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol。
198， AmericChemical Society, Washington, D。 C.，1982。有用的反应性官能团包括，例如
(a) 羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯， N-羟基苯并三唑酯，酸性卣，酰基咪唑，硫酯，对-硝基苯基酯，烷基， 链烯基，炔基和芳香酯；
(b) 羟基基团，其可以转化成酯、醚、醛等。
(c) 囟代烷基，其中卣素可以在之后被亲核基团例如，胺，羧酸阴 离子，硫醇阴离子，阴碳离子，或醇盐离子代替，从而在卣原子的位点 产生新基团的共价连接；
(d) 二烯亲合物基团，其能够参与Diels-Alder反应，诸如马来酰 亚胺基团；
(e) 醛或酮基团，使得之后的衍生成为可能，其通过羰基衍生物， 例如亚胺、腙、半卡巴腙或肝的形成，或通过诸如Grignard加成反应 或烷基锂加成反应机制实现；
(f) 磺酰卣基团用于之后与胺的反应，例如用以形成磺胺类药
物；
(g) 硫醇基团，其可以转化为二硫化物或与酰卣反应；
(h) 胺或巯基基团，其可以被例如酰化、烷基化或氧化；
(i) 烯烃，其可以进行例如环加成作用、酰化、Michael加成 反应等；
(j) 环氧化物，其可以与例如胺或羟基化合物反应；和
70(k) 亚磷酰胺和其他用于核酸合成的标准官能团。在一个示例性实施方案中，反应性官能团选自如下<formula>formula see original document page 71</formula>其中R31和R32独立地选自如下成员取代或未取代的烷基，取 代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环 烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基。
反应性官能团的另外的实例，以及可与之反应的相应的官能团 提供在下表中表1
可能的反应性取代基和与此反应的位点
反应性官能团 琥珀酰亚胺酯 酸酐类 酰叠氮
异硫氰酸酯，异氰酸酯
磺酰氯
磺酰氟
肼，
取代的肼 羟胺，
取代的幾胺 酸性卣化物
卣代乙酰胺，马来酰亚胺 碳化二亚胺 亚磷酰胺 叠氮化物
对应的官能团 伯胺，仲胺，羟基 伯胺，仲胺，幾基 伯胺，仲胺 氨基，硫醇，羟基 氨基，羟基
醛，酮 氨基，羟基
氨基，羟基 硫醇，咪哇, 羧基 羟基
羟基，氨基
炔烂
例如，为了将本发明的化合物连接到丝氨酸上的羟基部分，示例性的 反应性官能团包括琥珀酰亚胺酯，酸酐类，异硫氰酸酯，硫氰酸酯， 磺酰氯，磺酰氟，酸性卣化物，卣代乙酰胺，马来酰亚胺和亚磷酰胺。可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰组建本发明化 合物所需的反应。或者，可以通过存在保护基来使反应性官能团不参 与反应。本领域技术人员理解并知道如何保护特定基团，使得它不千 扰反应条件的选定设置。关于有用的保护基团的实例，例如参见 Greene等人,Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991。在一个示例性实施方案中，羧酸部分被连接到氨基部分。第 一羧酸部分与碳化二亚胺反应以生成0-酰基异脲，它可以与氨基部
分反应以产生连接两部分的酰胺部分。在一个示例性实施方案中，可以通过几种方法实现生物分 子与本文所述的纤维性聚合物支架的连接。例如，生物分子(诸如抗血 小板剂)可以连接到任选包含连接基团的本文所述的聚合物支架，这通 过用EDC/磺基-NHS (即l-乙基-3 ( 3-二甲氨基丙基碳化二亚胺/N-羟 基磺基-琥珀酰亚胺)处理来实现，这有利于纤维性聚合物的氨基末端 与生物分子的羧基的连接，或促进连接到结合于纤维性聚合物的含胺 连接物。应当注意，连接可以是相反的情况，如(羧基可以在纤维性聚 合物上，而胺基可以在生物分子上)。如本领域技术人员很容易理解的， EDC/磺基-NHS可以由任何适当的基团代替，包括但不限于N-5-叠氮 -2-硝基苯酰氧基琥珀酰亚胺；p-叠氮苯酰基溴化物；p-叠氮苯基乙 二醛；n-4-(叠氮苯基硫代)酞酰亚胺；双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二 酸盐；双-马来酰亚胺己烷；双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)-乙基] 砜；1， 5-二氟-2， 4-二硝基苯；4， 4' -二异硫氰基-2， 2' -二磺酸均二 苯乙烯；二甲基己二亚酰胺化物-2盐酸盐；庚二亚氨酸二曱酯二盐 酸盐；辛二亚氨酸二曱酯二盐酸盐；二疏醇双(琥珀酰亚胺丙酸酯)； 辛二酸二琥珀酰亚胺酯；酒石酸二琥珀酰亚胺酯；3，3-二^L代双丙亚 氨酸二甲酯二盐酸盐；4， 4'-二>5危代双苯基叠氮化物；3， 3-二石充代双 (磺基琥珀酰亚胺基-丙酸酯)；乙基-4-叠氮苯基-l， 4-二硫代-丁基亚 胺酯；乙二醇双(琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯)；l-叠氮-4-氟代-3-硝基 苯；N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯；甲基-4-叠氮苯甲酰亚 胺酯；m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯；N-羟基 琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸；p-硝基苯基-2-重氮-3， 3， 3-三氟-丙酸 酯；N-琥珀酰亚胺基(4-叠氮苯基)-l， 3'-二-硫代丙酸酯；磺基琥 珀酰亚胺基2-0n-叠氮-o-硝基-苯酰氨基)-乙基-l， 3'-二硫代丙酸 酯；N-琥珀酰亚胺基-6(4'-叠氮-2'-硝基-苯基-氨基)己酸酯；磺 基琥珀酰亚胺基2-(p-叠氮水杨酰基-酰氨)乙基-l，3'-二硫代-丙酸 酯；N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基-苯甲酸酯；4- (N-马来酰
73亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸琥珀酰亚胺酯；琥珀酰亚胺基4-(p-马来 酰亚胺基苯基)-丁酸酯；N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡咬二硫代)丙酸 酯；双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基-羰基-氧基)乙基]砜；二磺基琥 珀酰亚胺基酒石酸酯；乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基)-琥珀酸酯；m-马来酰亚胺基苯曱酰基-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯；磺基琥珀酰亚胺 基(4-叠氮苯基二硫代)-丙酸酯；磺基琥珀酰亚胺基6-(4'叠氮-2'-硝基-苯基氨基)己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基-苯甲 酸酯；4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯； 磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯；和2-亚氨基硫 烷盐酸盐。
II， f3)药学上可接受的赋形剂/药物制剂药学上可接受的赋形剂还可被归入具有本发明的聚合物支 架的组合物中。在一个示例性实施方案中，本发明提供了组合物，该 组合物是包含a)本发明的聚合物支架；和b)药学上可接受的赋形 剂的药物制剂。在一个示例性的实施方案中，该药物制剂是其中存在 药学上可接受赋形剂的聚合物支架。在一个示例性实施方案中，该药 学上可接受的赋形剂选自如下惰性稀释剂，成粒和崩解剂，粘合剂， 脱模剂，和时间延迟材料。本发明的药物制剂可以采取适用于所选的给药途径的各种 形式。本领域的技术人员将会认识到可用于制备掺入本文所述化合物 的无毒药物制剂的各种合成方法。本领域的技术人员将会认识到可用 来制备本发明化合物溶剂化物的多种无毒药学上可接受的溶剂，例如 水，乙醇，丙二醇，矿物油，植物油和二甲基亚砜(DMSO)。本发明的组合物可通过外科切口 ，局部，或肠胃外以剂量 单位施用包含常规无毒药学上可接受栽体，佐剂和赋形剂的制剂。在另一个示例性实施方案中，本文所述的组合物和/或聚合 物是试剂盒的一部分。这个试剂盒可包含教导本发明方法和/或描述该 试剂盒的组分用途的使用手册。III.组合物的用途在另一个方面，本发明组合物(例如聚合物支架)可用于 受试者以取代，再生或改善生物机能。在一个示例性的实施方案中， 该组合物可取代，再生或改善受试者神经的机能或肌肉的机能或皮肤 的机能或血管的机能。在另一个方面，本发明提供治疗受试者损伤的 方法，所述方法包括(a)让所述受试者与足以治疗损伤的药物有效 量的本发明组合物接触。在一个示例性实施方案中，该组合物接触受 试者的损伤位点。在另一个示例性实施方案中，所述损伤选自如下 断开的神经，受损伤的神经，断开的肌肉，受损伤的肌肉，断开的血 管，受损伤的血管，皮肤伤口和挫伤的皮肤。在另一个方面，本发明 提高受试者组织生长的方法，所述方法包括(a)让所述受试者与足 以促进所述组织的生长的药物有效量的本发明组合物接触。在一示例 性的实施方案中，该组织可选自如下肌肉组织，血管組织，神经组 织和皮肤组织。该组合物可在体外或体内使用以试验其效力。在另一 个示例性的实施方案中，受试者为动物。在另一个示例性实施方案中， 该动物选自如下人，狗，猫，马，大鼠和小鼠。以下为本发明组合物用途的例子。
III. a )涉及神经的用途在一个示例性实施方案中，本文所述的组合物可用于取代 断开的或损伤的神经。 一个用途是用于损伤外周神经的再生。外周神 经损伤可以由外伤，自身免疫病，糖尿病等所引起。外周神经由神经 纤维组成，该神经纤维通过身体从脊髓伸到全身各种终末靶。外周神 经损伤导致运动和感觉功能在神经终末靶至少部分损失。最严重的损 伤形式，神经完全断开和在近端的和远端的神经残端之间形成大的损 伤缺口。在近端的神经纤维能够再生但是不能同样有效地作用于几毫 米长的缺口。因此将损伤缺口用有效引导神经纤维从神经近段到神经 远段的神经纤维再生的材料桥连是迫切的。
在外周神经被损伤并且不再连续的临床情况下，可以使用 至少一种本文所述的纵向排列对齐的纤维性聚合物支架。该聚合物支
架具有管、填充管或杆的形状。导致神经不连续的损伤通常发生在四 肢。该排列对齐纤维状支架可以植入这些区域以提高穿过损伤缺口的 神经再生和允许四肢运动和感觉机能的回复。该支架可用于所有的涉 及间断受损伤的神经的情况，其中在神经残端之间的缺口足够大以防 止直接的再连接。在每种情形下，该支架将桥连该神经的两端，缝合 到神经段并且提高和引导神经纤维从神经近段到神经远段的再生。构
上。因p此，:排列对齐的:架纤维可提供「特定^的,指导^索，i线索; 导神经纤维有效穿过损伤缺口的再生。该纵向排列管聚合物支架可通 过对位于近端周边的神经纤维的初期促进引导生长而起作用。该杆状 和填充管形纵向排列对齐的聚合物支架可能连续地引导所有神经纤维 从近端到远端神经节段。该聚合物支架也可负载生物分子例如胞外基 质蛋白质，多肽，生长因子和/或分化因子以进一步提高并且引导神经 纤维的再生。可被添加到聚合物支架的胞外基质蛋白质包括胶原，层 粘连蛋白，和纤连蛋白。可被添加到聚合物支架的生长因子包括碱性 成纤维细胞生长因子，神经生长因子和血管内皮细胞生长因子。可被 添加到聚合物支架的多肽包括聚赖氨酸，基于RGD的多肽和层粘连蛋 白模仿多肽。其他可被添加到该聚合物支架的生物分子包括肝素和硫 酸乙酰肝素蛋白聚糖。这些生物分子还可用于非共价俘获层粘连蛋白， VEGF和BFGF到纤维性聚合物支架上。可以对该支架塑型和调节尺寸以匹配患者的神经损伤的特 定需求。例如，该管，填充管的内径和杆状聚合物支架的总体直径可 为约lmm到约20 mm。在另 一个示例性实施方案中，该直径为约2mm 到约8mm。在另一个示例性实施方案中，该直径为约5mm到约10mm。 在另一个示例性实施方案中，该直径为约hm到约l5 mm。在另一个 示例性实施方案中，该直径为约12mm到约18mm。在另一个示例性实 施方案中，该直径可为约lmm， 1. 5mm， 2mm， 2. 5mm， 3mm， 3. 5mm， 4mm,
764. 5mm， 5mm， 5. 5mm， 6mm, 6. 5mm, 7mm, 7. 5mm， 8mm, 8.5mm， 9mm, 9.5mm, 10mm, 10. 5mm， llmm， 11. 5mm， 12mm， 12. 5mm， 13mm, 13. 5mm, 14mm， 14. 5mm， 15mm， 15. 5mm, 16mm， 16. 5mm， 17mm, 17. 5mm， 18mm， 18. 5mm, 19mm, 19. 5mm， 20mm， 21mm作为与受损伤的神经相匹配的特 定尺寸。支架长度可在lcm到约50 cm之间变化以适应大范围的损伤 缺口。在另一个示例性实施方案中，支架长度为约4cm到约15 cm。 在另一个示例性实施方案中，支架长度为约14cm到约30 cm。在另一 个示例性实施方案中，支架长度为约lcm到约5 cm。在另一个示例性 实施方案中，支架长度为约2cm到约8cm。在另一个示例性实施方案 中，支架长度可为约lcm， 1. 5cm， 2cm， 2. 5cm， 3cm， 3. 5cm， 4cm， 4. 5cm， 5cffl， 5. 5cm， 6cm， 6. 5cm， 7cm， 7.5cm， 8cm, 8. 5cm， 9cm， 9. 5cm， 10cm， 10. 5cm， llcm， 11. 5cm， 12cm， 12. 5cm， 13cm， 13.5cm， 14cm， 14. 5cm, 15cm， 15. 5cm, 16cm, 16. 5cm， 17cm, 17. 5cm， 18cm， 18. 5cm， 19cm, 19. 5cm， 20cm, 20. 5cm。所有形式的纵向排列对齐纤 维状支架可充当神经自体移植物的取代物，其为现在最广泛使用的但 远非治疗神经损伤的理想形式。该支架也可用于桥连由当前合成的神 经指导产品覆盖范围外的长损伤缺口。例如，被桥连的损伤缺口可超 过3cm。在一个示例性实施方案中，受试者具有长损伤缺口，并且杆 状聚合物支架或填充管聚合物支架可为最优选的用于穿过长损伤缺口 神经再生的支架形状。临床情况下，其中外周神经是损伤的而非断开的，本发明 所迷的纵向排列对齐的纤维状支架可被制成形状为薄片并用作缠绕神 经包覆物和/或可被制成形状为杆状或填充管状或管状并且直接插入 到损伤区域内。该纵向排列对齐的纤维状支架还可用本文所述的相似 生物分子负载。本发明所述支架的另一用途是用于损伤脊髓的再生。排列 对齐纤维性聚合物支架可插入损伤区域中以桥连脊髓組织。该排列对 齐纤维性聚合物支架可提高和引导脊神经纤维的再生。该支架还可用 生物分子和/或细胞负载。生物分子可以包括如上列出的胞外基质蛋白质，多肽，生长因子和/或分化因子并且可以引发和增强脊神经的再生。 细胞可以包括神经干细胞，神经胶质细胞，和/或神经祖细胞。该细胞 可取代损失神经元和神经胶质细胞和/或可支持和增强脊神经的生长。在另一个示例性实施方案中，纵向排列对齐的聚合物管支 架用作神经引导管以促进穿过损伤缺口的神经再生。
III.b)涉及皮肤的用途本发明描述的聚合物支架可用于临床和个人伤口的照料和 软组织再生。在本发明的一个方面，聚合物支架薄片用作损伤敷料或 外层皮肤伤口的移植物。在临床装置中，这些薄片可用于治疗由于外 伤，烧伤，溃疡，擦伤，划破，手术，或其他损伤导致的伤口。外科 医生可使用这些移植以覆盖和保护受伤区域，以临时取代损失或损伤 的皮组织，和引导新组织生成和损伤愈合到损伤区域。在临床装置中， 微米/纳米纤维薄片可使用缝合剂，粘合剂，或重叠绷带固定到伤口区 域。这些微米/納米纤维伤口敷料可被切割以匹配伤口的尺寸，或可叠 盖在伤口边缘。在本发明的另一个方面，该聚合物支架薄片可制作用于个 人/居家照料，这通过将薄片与粘合底布结合制成聚合物支架绷带来达 到。该粘合部分将聚合物支架薄片保持在受伤区域的位置上，并可在 纤维降解或与该组织熔接时除去。该聚合物支架薄片还可用液体或凝 胶粘合剂固定。本发明的另 一个方面，大的聚合物支架薄片可被用做纱布 以吸收液体和保护大的伤口 。这个聚合物支架纱布可缠绕在受伤区域 周围或用胶带固定。在本发明的另一个方面，聚合物支架薄片可用于治疗内部 软组织伤口例如羊膜嚢内的伤口，胃肠道或粘膜内的溃疡，齿龈损伤 或塌陷，内部外科切口或活组织检查等。该聚合物支架移植物也可以 缝合或粘附到填充或覆盖损伤组织区域的部位。聚合物支架具有许多对伤口愈合有用的特征。首先，本文
78所述聚合物支架包括具有纳米多孔和可呼吸性质的纳米纤维。他们可 防止微生物和传染性粒子穿过，但是其允许对伤口自然愈合关键的气 流和水分的渗透。第二，本发明中的纤维是可生物降解的，这允许在新组织 最终向内生长之前临时伤口覆盖。可决定用于聚合物支架伤口敷料材 料的选择以与包括机械强度和降解/组织再生速率的天然组织特征匹 配。第三，聚合物支架可被包埋或与各种因子结合，其中该因 子在降解时释放。这些因子可包括，但不限于表皮生长因子(EGF)， 血小板衍生生长因子(PDGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)， 转化生长因于-p (TGF-P )，和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)， 其已经被证明在伤口愈合中是有益的。Fu, X。 et al.， Wound Repair Regen， 13 ( 2 ) :122-30 ( 2005 )。其他伤口愈合因子例如抗生素， 杀细菌剂，杀真菌剂，含银的试剂，镇痛药，和释放氧化氮的化合物 还可引入到聚合物支架伤口敷料或移植物中。第四，用于伤口愈合的聚合物支架移植物可与细胞接种用 于更快的组织再生和更天然的组织结构。这些细胞包括，但不限于成 纤维细胞，角质形成细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞，和/ 或胚胎干细胞。第五，纳米纤维性聚合物支架的纳米尺度构造紧密模仿许 多常见软组织的胞外基质(ECM)的构造。例如，纳米尺度纤维在结构 上类似于在皮肤及其他组织中发现的胶原纤维。这种构造可通过提供 用于细胞迁移到伤口的有組织的支架防止伤疤的形成。本发明的这个 方面，聚合物支架的排列(与随机取向的纤维相反)对保持细胞排列 和有组织是重要的，而不是允许其如同在伤疤组织的形成中那样随机 排列。排列对齐的聚合物支架可针对伤口给定的轴取向以允许组织更 快的向内生长和伤口的覆盖。聚合物支架排列还将用于紧密匹配天然组织ECM的构造。 这可包括在单个方向排列，正交方向十字交叉排列，或更复杂纤维构造的纤维。在本发明的情况下，聚合物支架包括在各层中具有特定纤 维取向的多层纤维。类似地，每个聚合物支架层还可包含特异性因子 或细胞类型例如之前列出的那些。这允许可紧密匹配天然组织构造和 组成的聚合物支架生成。例如，简单的聚合物支架伤口敷料或移植物 可以包括单层排列对齐纤维。在另一方面，更复杂的聚合物支架皮肤 移植物可以包括多层十字交叉重叠的纤维薄片，底部薄片上为成纤维
细胞和在顶端薄片上为角质化细胞，以及在底部薄片上为bFGF和在顶 端薄片上为抗微生物剂。其他这样的结合是可能的，依赖于患者的特 定需要。
III.c)涉及血管系统的用途本文所述聚合物支架可用于取代或绕过各种损伤，切断或 改变的血管。在一个示例性实施例中，该管或填充管聚合物支架用于 冠状动脉旁路术手术。此外，这些移植物通过用聚合物支架对血管进 行完全取代或通过生成象套子一样的鞘壳用于支持和稳定血管动脉瘤 (即，腹主动脉瘤通常需要合成聚合物取代移植物，例如ePTFE或 Dacron)。其他增强技术包括缠绕聚合物支架薄片在动脉瘤位点周围。 其用途不限于较低躯体血管取代，但是可包括其他动脉瘤的公共位点； 例如-Willis环绕，涉及任何局部动l^，包括内部颈动脉，后4区沟通， 后脑等。在一个示例性实施方案中，该由套管围绕的聚合物支架用 于取代或再生血管。可将套管围绕聚合物支架以提高其机械强度，刚 性，可塑性或任何其他物理或化学性质。这个套管可位于纳米纤维性 聚合物支架管周围，例如使得基础纳米纤维具有特别的排列方向并且 该套管可具有相同或不同的排列方向。非排列对齐或随机排列对齐的 ;敞米或纳米纤维还可充当套管材料或基础纳米纤维构造。多个套管可 用于生成具有不同物理或化学性质的多层构造。
多细胞型移植物
80
管状构造可通过将聚合物支架的不同区域接种不同的细胞 类型制成。例如，图40显示具有对细胞腔加衬的细胞类型l和在移植 物的中部的细胞类型2和通过在移植物的另一个区域上接种而包住移 植物的细胞类型3。
纳米纤维管状构造的修饰在一个示例性实施方案中，本发明提供了用于血管系统的 聚合物支架，其在植入前不具有生物化学或细胞修饰。在另一个示例 性实施方案中，本发明进一步包括聚(乙二醇)或相似生物化学修饰 以生成无污垢的、不形成血栓的刷子层，该层防止血小板与纳米纤维 粘附。该刷子层可共价移植于纳米纤维性聚合物支架上用于减少血栓 形成。在另一个示例性实施方案中，聚合物支架进一步包括肝素，水 蛭素或其结合。肝素能够结合抗凝血酶III,该凝血酶III可在血液 中阻断因子Xa和凝血酶。水蛭素是凝血酶的抑制剂。肝素和水蛭素可 通过使用二氨基聚(乙二醇)连接物共价移植到聚合物支架上。在一 个示例性的实施方案中，聚合物支架包含PLL纤维。可用于与受试者 的血管系统连通的本发明的聚合物支架减少了血栓形成并增加了移植 效力。在另一个示例性实施方案中，用于与血管系统联系的聚合 物支架进一步包含人骨髓衍生间充质干细胞。在一个示例性实施方案 中，该间充质干细胞将在植入前至少"小时接种。在另一个示例性的 实施方案中，细胞将在植入前2天接种到移植物上。脱细胞-人骨髓衍生间充质干细胞或任何细胞类型将如上 所述接种2天。植入前几个小时，杀死该细胞，同时保持细胞结构和 细胞表面的完整。在另 一个示例性实施方案中，用于与血管系统联系的聚合 物支架进一步包含内皮前体细胞。在一个示例性的实施方案中，该内 皮前体细胞将在植入前2天接种到移植物上。这些内皮细胞可以通过 高效细胞膜表面防止血小板粘合/活化，血栓形成和纤维化形成，该细胞膜表面包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和几个由细胞自身分泌的因子。在另一个示例性实施方案中，用于与血管系统联系的聚合 物支架进一步包含人胚胎干细胞衍生血管祖细胞。这些胚胎干细胞可 通过胶原IV整联蛋白信号分化成血管祖细胞系并能够在生长因子刺 激下充分分化成内皮和平滑肌细胞。
III.d)涉及肌肉的用途包括本发明聚合物支架的肌肉移植物可治疗性地植入肌内 用于增强由于急性损伤之后重要肌肉损失的肌肉再生。生长因子及其
其将促进所^有肌肉的治愈。生长因子可包括胰岛素样生长因子-l (IGF-1 ),碱性生长因子(bFGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)， 和血小板衍生生长因子(PDGF)。该生长因子可通过共价结合或生理 涂敷引入到移植物种。有关的方法包括遗传修饰细胞以过表达这样蛋 白质的基因。移植物的另一个治疗应用是用于具有肌肉疾病的动物或人 的遗传修饰例如肌营养不良，其特征为特异基因的遗传突变。对于这 种类型的基因治疗应用，具有正常基因的成肌细胞可在移植物内递送 到肌肉。或者，该基因可直接以质粒DNA形式连接到支架上。在身体
对基因治疗的目的来说，该聚合物支架提供用于植入细胞的存活和生 长的基质和/或充当用于质粒DNA的释放和随后吸收的递送介质。该移植物可为片或管的形状。在两种情况下，纤维方向平 行于肌肉的方向。对于啮齿类，该支架的物理尺寸的范围为0.5-5.0 x 0.5-5.0 x 0.1-0.5 cm。对于人移植物，该支架尺寸的范围为 1. 0-50. Oxi. 0-50. 0x0. 1-5. 0 cm。最适于这类治疗法的肌肉是具有排列几何形状和靠近脉管 系统以滋养移植物的那些。这种肌肉包括二头肌，四头肌，前部胫骨 肌，和腓肠肌。
在一个示例性实施方案中，用成肌细胞埋入的管可用于生 长骨骼肌。在另一个示例性实施方案中，用间充质干细胞埋入的管能 被用作血管移植物。在另一个示例性实施方案中，与神经干细胞包埋 的管能被用作神经移植物。在另一个示例性实施方案中，本发明提供 制造该組合物的方法，该方法包含(i )将该聚合物与细胞接种；(ii) 将产品轧压在芯轴周围，从而形成用于聚合物的管状；和(iii)除去 该芯轴。在另一个示例性实施方案中，本发明提供(iv)将该聚合物 的第一部分连接到该聚合物的第二部分。这种连接借助于退火(热)， 粘合(例如生物粘合剂)或缝线缝合而实现。
III. e)具有微图案化聚合物支架的肌肉移植物具有微图案化聚合物支架的肌肉移植物应用类似于如上所 述的纳米支架的应用，除了微图案化聚合物支架为薄片形状。本发明通过如下实施例示例。该实施例并不旨在限定或限 制本发明的范围。
实施例 实施例1 成肌细胞的制备鼠C2C12成肌细胞(ATCC, Manassas, VA)用于研究细胞 组构和装配。将该成肌细胞在生长培养基中培养，该生长培养基由 dulbecco， s Modified Eagle， s培养液(醒M) ， 10%胎牛血清，和 1%青霉素/链霉素组成。为了引发成肌细胞分化和汇合，在样品汇合 24小时之后，该生长培养基被分化培养液取代，该分化培养基由DMEM， 5%马血清和1%青霉素/链霉素组成。在所有的实验中，时间点通过在 分化培养液中的温育时间来表示。
实施例2
PLLA纳米纤维支架的制备
将可生物降解的聚(L-丙交酯)(PLLA )( Lactel Absorbable Polymers, Pelham， AL， 1.09 dL / g固有粘度)用于通过静电纺纱 制造纳米纤维支架。(Zong， X. ， Biomacrofflolecules, 4(2): 416-23
(2003 ))。简而言之，将该PLLA溶液(10% w / v在氯仿内)通过 可编程泵以25亳升/分钟的流速递送到电极出口孔。高压电源
(GlassmHigh Voltage Inc., High Bridge, NJ )用于施加20千伏 的电压。收集板在转鼓上，该转鼓通过步进电机接地和控制。为了排 列纳米纤维，静电纺纱的支架在60 r单向延伸到200%的工程应变。 纳米纤维支架大约为150 jam厚。该纳米纤维支架表面在细胞接种前 涂敷有2%明胶或纤连蛋白(5|ng/cm2)。没有在明胶和纤连蛋白涂层 间检测到在细胞粘合和形态方面的显著差异。随机取向的支架用作对 照。
维排列。SEM图像显示导致排列纳米纤维的单轴拉伸(图24A-B)。 该支架内的平均纳米纤维直径为大约500 rnn,并具有大约4yra的平 均缺口尺寸。
实施例3
在分化培养液下的纳米纤维支架上成肌细胞的生长/表征
将汇合成肌细胞在分化培养液内納米纤维支架上培养至7 天。为了测定在随机取向和排列对齐的纳米纤维支架上的细胞组织和 细胞骨架结构，对纤维状肌动蛋白，肌球蛋白重链(MHC)和细胞核进 行荧光染色(Supporting Information)。纤维状肌动蛋白使用荧光 素(FITC)-缀合的鬼笔环肽(Molecular Probes, Eugene, OR)进 行染色。MHC用小鼠抗骨骼肌快速MHC抗体(Sigma， St.Louis， M0) 进行免疫染色。细胞核用ToPro染料(Molecular Probes)染色。使 用Nikon TE300显微镜和LeicTCS SL共聚焦显微镜进行荧光显微镜检 查。
84实施例4
微图案化基材的微制造通过改进的Thakar， R。 G. ， Biochem Biophys Res Com醒， 307 ( 4 ) :883 -90 ( 2003 )中的方法由硅晶片反模板(s i 1 icon wafer inverse template)制造由聚二甲基硅氧烷(PDMS )或聚L-丙交酯-共聚-乙交酯-共聚-s-己内酯(PLGC)聚合物组成的微图案化薄膜。 为了生成微图案化模板，晶片在丙酮中清洗，然后再用疏酸与过氧化 氢4: 1的洗涤溶液(Piranhacid)清洗。干燥该晶片并涂敷六曱基二 硅氮烷(HMDS) 5分钟以提高光致抗蚀剂向基材的粘附力。首先产生 具有图案化乳液条的掩膜。平行条为10-jum宽，10-jum间隔，和4-cm 长。为了将该图案转移到硅晶片上，I-line (OCGOiR 897-10i, Arch Chemicals, Norwalk, CT)光致抗蚀剂以820RPM的速度旋转到晶片上 1分钟，生成大约2. 8-nm厚的光致抗蚀剂层。然后将该光致抗蚀剂 暴露于具有KS校准器的紫外线之前，该晶片在90 。C烘焙60分钟以 硬化该光致抗蚀剂。在120。C进行曝光后烘焙60秒以有助于光致抗蚀 剂定型和驱使该光化产品的扩散。使用光致抗蚀剂显影液OPD 4262 对曝光的光致抗蚀剂显影60秒，具有未膝光光致抗蚀剂的晶片在120 。C放入primer烘箱15分钟以允许剩余的光致抗蚀剂定型。在这个点， 晶片随时可用于PDMS薄膜的制备。用于PLCG薄膜制造的模板需要利 用STS Deep Reactive Ion Etcher蚀刻的附加步骤2-3分钟以生成大 约2iLim深的细微紋沟。微图案化和非图案的PDMS薄膜按照厂家(Sylgard 184， Dow Corning, MI)的指导来制备。在真空下脱气之后，15 gPDMS倾 倒在晶片在上。具有PDMS的晶片放置在光致抗蚀剂旋转器并以100 rpm的速度旋转30秒，然后以200 rpm的速度旋转2分钟，其形成了 具有大约350jam等厚度的PDMS薄膜。具有旋转涂敷PDMS的晶片保存 在室温下10分钟，然后放置在80。C的烘箱内15分钟以允许PDMS的 聚合。在烘焙后，PDMS冷却到室温然后从晶片上移走。在制造过程后， 该PDMS膜在水中进行超声处理清洗。为了杀菌和促进细胞黏附，该膜
85用氧等离子体处理并在细胞接种前涂敷2%明胶30分钟。对于可生物降解的微图案化薄膜，以70: 10: 20组分比率(Mn 约100， 000 )使用三嵌段的共聚物PLGC ( Aldrich， St.Louis， MO )。 PLGC溶液在氯仿中制备浓度为50 mg / mL并在台式搅拌器 (stirplate)中搅拌直到溶解。然后该溶液倾倒在硅铸模上并使溶剂 蒸发，形成聚合物薄膜。在制造后，PLGC薄膜在70%乙醇灭菌2小时 并在PBS中漂洗。在细胞接种前，该薄膜用2%明胶涂敷30分钟以增 强细胞的连接。
实施例5
由扫描电子显微术(SEM)对组合物进行表征包含细胞的组合物或样品通过在溶于0.1 M二甲胂酸钠緩 冲液中的2%戊二醛固定以进行SEM。在用乙醇连续脱水后，干燥样品 并濺射涂敷铱和金鉑(40:60 )的粒子到厚度为10-15 nm。样品在 环境扫描电子显微镜(Philips XL-30)下显象。
实施例6 免疫荧光染色样品固定在4%多聚甲醛15分钟，用0.5% Triton X-100 透化IO分钟，并用1%牛血清清蛋白(BSA)预先处理30分钟。纤维 状肌动蛋白装配通过荧光素(FITC)-缀合的鬼笔环肽(5 U/mL， Molecular Probes )温育染色1小时。对于肌球蛋白重链染色，样品 与小鼠抗骨骼的快速肌球蛋白重链(87 jug/ mL， Sigma)温育，然后 与FITC-缀合的驴抗小鼠(6. 25 |u g/mL, Jackson Imm圃Research， West Grove, PA)抗体一起温育。细胞核在用Nikon TE300 microscope 或LeicTCS SL共焦显微镜显象以前用ToPro (IjuM， Molecular Probes)染色。共焦图像表示三维堆叠图像的两维投影。
实施例7BrdU掺入对于细胞周期分析，样品用溴脱氧尿苷(BrdU, 1:1000， Amersham， Piscataway, NJ )在生长培养基中脉冲2小时，然后固定 在4。/。多聚甲醛并在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中洗涤。该样品用50%甲醇 预先处理30分钟，然后在0. 5% Triton X-100透化IO分钟，然后2N 盐酸盐处理30分钟。之后，样品用小鼠抗-BrdU (2.5|ig/ mL， BD Biosciences, Bedford, MA)温育，然后是FITC-缀合驴抗小鼠(6. 25 pg/mL)抗体。用珙化丙锭(1)ig/ mL, Molecular Probes)对细胞 核染色。
实施例8
细胞融合和增殖的分析抗骨骼肌球蛋白染色的荧光免疫图像在至少5个代表性的 高功率的40x )和低功率(10x )视野下获得。使用SP0T4。 0. 5软件 (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)， 分另'J利用高 倍放大率和低倍放大率对肌管宽度，长度，和相对于排列纳米纤维或 细微紋沟的轴的排列进行量化。0度的最小肌管排列值表示了沿纳米 纤维轴平行排列和90度的最大值代表垂直排列。对于随机取向的纳米 纤维支架和非图案化的PDMS基材的排列分析，使用任意的排列轴。此 外，以高功率对融合核，BrdU-阳性细胞，和条紋状肌管的百分比进行 量化和平均。对平均宽度进行量化和平均。在低倍放大率下的系列图 像合并以定量肌管长度。所有的数据用平均数土标准偏差(n>3)来 表示。由两组的student氏t检验计算统计学显著性或用Holm， s调 整的方差分析进行多重比较。
实施例9 管在矩形排列纳米纤维薄片上成肌细胞分化7天。为了生成 三维结构，该纳米纤维薄片绕l-2 mm直径的钢杆轧压(图27)。该
87管状结构由在该管状构造两端上的7-OTicron缝合来固定。然后该样 品低温切割用于组织分析。该低温切割样品由常规的苏木精和曙红(H & E)染色和纤维状肌动蛋白的免疫荧光染色来分析。制造的管状构造直径为大约2-3 mm和纵向长度为10mm。 用于这些构造截面的整体形态的H & E染色证明该构造的管状结构可 成功地制造(图28)。可在整个支架层上看到显著紫色-着色的核， 尽管更多细胞在各个层的表面上是可见的。免疫荧光染色纤维状肌动 蛋白的共焦显微证明细胞渗透到该多层构造内(图29)。细胞采用 拉长的形态和按照纳米纤维的方向排列。这些结果证明了使用纳米聚 合物操纵排列三维骨骼肌的可行性。
实施例10
纳米纤维性聚合物的生长可生物降解的聚(L-丙交酯)(PLLA) (Lactel可吸收的 聚合物，Pelham， AL， 1.09 dL / g固有粘度)用于之前由Rosen et al.，Ann Plast Surg. ， 25: 375-87 ( 1990 )所述的静电纺纱来制造纳 米纤维支架。PLLA溶液(10。/。 w / v在氯仿中)由可编程序的泵递送 到在高电场中的接地收集板，产生随机纳米纤维。为了排列纳米纤维， 该静电纺纱的支架在60 X:单轴拉伸到200%的工程应变。納米纤维支 架大约为150]um厚。扫描电子显微术(SEM)用于显象在单轴拉伸之 后的纳米纤维排列。SEM图像显示产生高度排列纳米纤维的单轴拉伸 (图12A-B)。平均納米纤维直径大约为500 nm。为了化学修饰纳米纤维， 一种ECM蛋白质(层粘连蛋白) 和一种神经营养因子(基本成纤维细胞因子或bFGF)被选为代表性的 例子。层粘连蛋白和bFGF都已经显示出促进体外神经突的延伸。 Manthorpe et al.，J Cell Biol.，97:1882-90 (1983) ; Rydel et al.，J Neuroscl. ， 7:3639-53 ( 1987 )。此外，这两种蛋白质通过 它们的肝素结合域与肝素相连。肝素也已经显示出防止bFGF降解并在 bFGF细胞信号转导途径中起到了关键作用。Gospodarowicz et al. ， JCell Physiol. ， 128: 475-84 ( 1986 ) ; Sakselet al. ， J Cell Biol., 107: 743-51 ( 1988 ); Yayonetal。
Cell, 64:841-8 ( 1994 )。
肝素功能化納米纤维使用二氨基聚(乙二醇)(二-氨基 -PEG)作为连接物分子(图12C)来生成。首先，在PLLA纳米纤维上 的活性羧基的密度通过用0. OINNaOH (Sigma, St. Louis, MO )来处 理来增加。然后使用零-长度交联剂l-乙基3- ( 3-二甲基氨基丙烷) 碳二亚胺盐酸盐(EDC )和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS ) ( Pierce Biotechnology, Rockford， IL)将二-氨基-PEG (MW 3400， Sigma) 分子与在PLLA纳米纤维上的羧基共价连接。然后通过EDC和磺基-NHS 将肝素(Sigma )分子与在二-氨基-PEG分子上的自由胺共价连接。在 纳米纤维支架上的任何剩余活性位点通过在10% w / v甘氨酸在磷酸 盐緩冲液盐溶液(PBS)温育样品来阻断。然后bFGF (50ng / cm2， Peprotech， Rocky Hi 11， NJ )和层粘连蛋白(10 jag / cm2， Sigma)
在纳米纤维的表面上。 bFGF分子与肝素功能化的PLLA纳米纤维的连接通过使用 修正的ELISA技术来验证。为了比较固定bFGF不同方式的效率，用在 PBS中的bFGF温育三个具有同样尺寸，未处理的，二-氨基-PEG修饰 和肝素功能化的纳米纤维膜的纳米纤维支架。然后用在PBS溶液中1% 牛血清清蛋白(BSA)温育所有膜以最小化抗体的被动吸附。随后，样 品用HRP-缀合的抗-bFGF小鼠单克隆IgG抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN )温育。彻底洗涤该膜，转移到微量离心管并用HRP 基材溶液(过氧化氩和chromagen， tetramethylbenzidine )温育。 然后使用2N硫酸停止该反应。然后使用分光光度计对该溶液的吸光率 (450 nm波长)读数。非特异的bFGF抗体的吸附在阴性对照样品上 测试，并被认为是微不足道的(数据未显示)。结果(图12D)显示 bFGF涂层在用肝素功能化的纳米纤维上大为有效。这些结果进一步在 用聚(丙烯酸)涂敷的组织培养聚苯乙烯基材上检验并用二-氨基-PEG 和肝素以在PLLA纳米纤维所使用的相同方式缀合(图12E)。
从P4-P5大鼠中收获的DRG组织用于研究納米纤维支架上 的神经突外延。在补充有B27和0. 5 mM L-谷氨酰胺(invitrogen， Carlsbad, CA )神经基础培养液中培养在以下排列对齐的和非排列对 齐的PLLA纳米纤维支架上的DRG组织6天未经处理的，用层粘连蛋 白(LAM)肝素功能化的，和用层粘连蛋白和bFGF肝素功能化的
(LAM+bFGF)。在体外培养6天后，使用免疫荧光染色分析神经突外 延。首先所用样品用4%多聚曱醛固定，然后用0.5% Triton-X100在 PBS溶液中透化细胞膜。用山羊多克隆的抗神经丝-M(NFM) IgG抗体
(SantCruz Biotechnology SantCruz， CA )随后用FITC-缀合驴抗山 羊IgG抗体(Jackson Imnumoresearch， West Grove， PA)温育样品。 该样品设置在载玻片上并使用Zeiss荧光显微镜和Leica共焦荧光显 微镜显象。由DRG组织的神经突外延在非排列对齐未经处理納米纤维 支架上不能观察到(图13未处理的)。从在非排列对齐的LAM纳米纤 维上培养的DRG组织的神经突外延是最小的(图13LAM)。可观察到 各种神经突从在非排列对齐的LAM+bFGF纳米纤维上培养的DRG组织 延伸出。神经突在从DRG组织以半径的形式向外伸展并缺乏排列一致 性。从DRG组织的神经突生成物约为lmm。与非排列对齐未经处理的纳米纤维相反，在未经处理排列 纳米纤维上观察到神经突外延。神经突从DRG组织两个不同区域伸出 并沿纳米纤维方向排列。图14显示了神经突从组织的两个区域之一 伸出。在未经处理的纳米纤维上的神经突生成物为约0. 7mm。这些结 果表明排列对齐的纳米纤维提供了诱导从DRG组织内感觉神经元的神 经突延伸的指导。类似排列对齐的但更长的神经突在排列对齐的LAM 纳米纤维上观察到(图14LAM)，暗示ECM蛋白质可以进一步增强排 列纳米纤维的指导。在LAM纳米纤维上的神经突生成物为约1. 3mm。 最长和最密集的神经突延伸在排列对齐的LAM+bFGF纳米纤维上观察 到(图14LAM+bFGF)。在LAM+bFGF生成物上的神经突生成物约4. 8mm。 这些结果清晰显示了来自层粘连蛋白和bFGF的化学线索和来自排列纳米纤维基材的物理线索，个别地或结合，大大地增强和指导神经突 从感觉神经元的延伸。高倍-放大率共焦显微学证明延伸的神经突遵循 生物活性纳米纤维的指导，和在随机和排列对齐的纳米纤维上形成不
同的图案(图15)。 实施例11
纵向排列对齐的聚合物支架管可生物降解的聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)(PLLA) (Lactel 可吸收的聚合物，Pelham， AL, 0.82 dL / g固有粘度)用于通过静 电纺纱制造纳米纤维支架。PLGA溶液(20% w / v在HFIP内)以1 毫升/小时的流速通过可编程序泵递送到电极出口孔。高压电源用于施 加11千伏的电压。集电极基材是连接能够围绕其长轴旋转芯轴的电动 机的接地钢芯轴。Teflon胶带缠绕在芯轴一部分周围以生成不导电 区。芯轴低速旋转<15 rpm)同时静电纺纱PLGA纤维。在由不导电的 Teflon带区域分离芯轴的两个部分之间交替射流产生与芯轴长轴平 行的PLGA纤维的沉积。芯轴的旋转确保PLGA纤维在芯轴周围的均匀 覆盖。在完成静电纺纱后，静电纺纱的PLGA纤维状管的边缘用小刀弄 钝然后从Teflon带和芯轴中移走该管。为了检验纤维排列，该管沿其长轴方向切割并用光学显微 镜显象纤维形态。大多数纤维在纵向排列(即沿着管的长轴)。
实施例12
纵向排列对齐的聚合物支架杆可生物降解的聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)(PLLA) (Lactel 可吸收的聚合物，Pelham， AL, 0.82 dL / g固有粘度)用于通过静 电纺纱制造纳米纤维支架。PLGA溶液(20% w / v在HFIP内)以1 毫升/小时的流速下通过可编程序泵递送到电极的出口孔。高压电源用 于施加11千伏的电压。为了静电纺纱过程形成杆状纵向排列对齐的纤 维，可使用特定的集电极基材。集电极基材可由两个首尾相连排列对
91齐的接地金属芯轴组成，其中在中间(即2 cm)有气隙并且可放置电 极的出口孔下(即15cm)。每个芯轴可与电子控制的电动机连接，该 电动机可围绕芯轴的长轴以同步的方式旋转芯轴。在静电纺纱的过程 期间，可以低速旋转芯轴(<10rpm)以确保静电纺纱聚合物纤维的均 匀沉积。在静电纺纱过程期间，聚合物溶液将形成向收集基材移动的 射流。在这些情形下，该射流将穿过在两个芯轴的端点之间的气隙， 形成沿着缺口长度方向排列对齐的纤维(和具有和芯轴的长轴方向相 同的取向)。在完成静电纺纱时，该静电纺纱的聚合物材料可通过使 用小刀并沿芯轴边缘切割与两个金属芯绅端点分离。形成杆状静电纺 纱纤维性聚合物支架，其具有沿其长轴方向排列对齐的纤维。
实施例13
纵向排列填充管纤维性聚合物支架
的聚合物纤维填充，可使用以下方法首先，具有纵向排列对齐纤维 的空心管是静电纺纱的。为了制造2 cm长，内径O. 5 cm纵向排列对 齐的填充管，可使用以下条件。首先，纵向排列对齐的空心管可如本 文所述使用具有至少2cm长和直径为0. 5 cm的不导电区的芯轴静电纺 纱。然后纵向排列对齐的空心管从芯轴移走并切割尺寸。填充材料静 电纺纱为如同本文所述的高孔隙度的排列聚合物纤维薄片。排列对齐 的納米纤维薄片可制成空心管细胞腔的适当尺寸的形状。然后排列对
齐纤维薄片插入管中以生成沿长轴排列对齐的聚合物纤维填充的管支 架。填充材料可如排列对齐纤维组成的轧制薄片和由纵向排列 对齐纤维组成的杆一样制造。为了使用由排列对齐纤维组成的轧制薄 片制造填充材料，可使用本文所述方法。50微米厚的排列对齐纤维性 聚合物膜可为通过静电纺纱制造的并可将其切割成2cm x 2cm。然后 该薄片可以排列对齐纤维沿轧制薄片长度进行的方式轧压到自身上。 该薄片可轧压直到形成杆的直径为0.5厘米。然后切去多余材料。然
92后该轧压杆状填充材料可插入纵向排列对齐的空心管中，利用钳状体 形成纵向排列对齐的填充管。为了制造填充材料，可使用按照本文所 述方法的由纵向排列对齐纤维组成的杆状纤维性聚合物支架。为了制
造适当尺寸的杆，两个集电极芯轴直径可为0.5 cm并以至少2 cm间 隔以生成至少2 cm气隙。在如实施方案12静电纺纱杆后，该杆可使 用小刀移走，并沿芯轴边缘切割。然后杆状支架使用钳状体插入到空 心管内。
实施例14
PLGA納米纤维支架的制备可生物降解的聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)(PLLA) (Lactel 可吸收的聚合物，Pelham， AL， 1.09 dL / g固有粘度)用于通过静 电纺纱制造纳米纤维支架。PLGA溶液(20% w / v在HFIP内)以1 毫升/小时的流速通过可编程序泵递送到电极的出口孔。高压电源用于 施加11千伏的电压。纤维沉积在涂敷有铝箔(直径10cm,长度10cm) 的旋转钢制转鼓上(参见图41),该转鼓接地并通过步进电机控制。 对于排列对齐的纳米纤维，该集电极鼓以400 rpm的速度旋转。对于 非排列对齐的纤维，该集电极鼓以〈30 rpm的速度旋转。静电纺纱进 行到由500 nm直径纤维组成的纤维状支架大约130 nm厚。为了从该 鼓移走纤维性聚合物薄片，沿鼓的长度切割聚合物层和箔并从鼓上缠 下聚合物层和箔。然后纤维性聚合物层从铝箔剥离以制造大约30长和 10 cm宽的纤维性聚合物薄片。使用相差显微镜(Carl Zeiss )检验纤维的排列，和将纤 维性聚合物薄片切割成所需的尺寸以适合给定的应用。对于伤口愈合， 纳米纤维支架片可切割以匹配伤口的尺寸或扩张到伤口外。可选择纤 维的取向以与伤口给定轴成特定角度排列。
实施例15
十字交叉的纳米纤维支架的制备
具有十字图案纤维的纤维性聚合物支架可通过几个方法形
成。在一个实施方案中，静电纺纱可通过收集在转鼓上的纤维或通过
延伸非排列对齐的纤维用于生成如本专利之前所述排列对齐的纤维性 聚合物薄片。然后这些排列对齐的聚合物薄片从集电极鼓处移走并可
彼此层合，同时各薄片中的纤维垂直于上面和下面的纤维配列(图 38)。此外，该薄片可为了机械强度和稳定性缝合在一起。在第二实施方案中，该十字交叉图案可通过利用在中心具 有不导电部分的导电鼓形成用于沿鼓的纵向纤维静电纺纱。直径为10 cm和10 cm长的钢制鼓可固定到电动机上。Teflon胶带可在鼓周围轧 压以覆盖4 cm宽。为了生成十字图案，首先该鼓将緩慢旋转(〈30rpm) 以生成穿过不导电Teflon带区域沿纵轴排列对齐的纤维。随后快速旋 转鼓(〉100rpm)以生成与第一层垂直排列对齐的纤维。在该鼓的慢速 和快速旋转之间转换将生成沉积在Teflon带区域上沉积的一系列排 列对齐纤维层从而产生十字图案。或者，构造鼓，其中不导电区是夹 在两个导电金属区域之间，这类似于本发明之前描述芯轴的设计。在第三个实施例中，具有十字交叉排列对齐纤维的纤维性 聚合物支架薄片可使用转鼓作为集电极基材静电纺纱。静电纺纱装置 可以本文所述配备用于静电纺纱的排列对齐纤维性聚合物薄片。排列 对齐纤维层沉积在转鼓上。然后该纤维层可从鼓上剥离，旋转90度并 放回到鼓集电极上。然后该鼓再一次以高速(<100 rpm)旋转以形成
排列对齐纤维的沉积。这个过程可以重复许多次以制造十字交叉排列 对齐的纤维性聚合物支架薄片，其中任何给定纤维层相对应与其邻接
的纤维层垂直排列。
实施例16
微米/纳米纤维伤口愈合PLLA微米/纳米纤维薄片可如实施方案IO所述生成具有排 列和非排列对齐的纤维。人工伤口或缺口缺陷在如下这些纤维薄片上 的单层正常人皮肤的成纤维细胞(NHDF)内生成首先，使用手工钳夹将18号喷射器针头弄平。其次，纳米纤维PLLA网孔被切割成1 x 1 cm的尺寸。弄平的针头和网孔在70%异丙醇和紫外线下灭菌30分钟， 和将针固定穿过在关于纤维排列所需取向上的纳米纤维-纤维针对伤 口轴为是平行，垂直，或非排列对齐的(图35) 。 NHDF在全部区域共 混接种，但该针防止细胞结合在下面(图35)。在粘合细胞后，除去 该针，将"伤口"留在其位置上。培养物用5%二氧化碳保持在37 。C 湿润的孵化器内1-2天以允许有时间供细胞迁移和伤口覆盖。在接种 前，NHDF筒要地用Dil细胞跟踪器染色(1: 2000稀释度，IO分钟) 以观察原始伤口尺寸和监测细胞浸润入伤口的进展。在微米/纳米纤维上的NHDF用4%多聚曱醛固定，用0.1% Triton X-100透化，和用1%牛血清白蛋白阻断。对于细胞骨架染色， 样品用抗整体肌动蛋白一抗温育60分钟，然后用FITC-缀合抗山羊IgG 二抗(Jackson ImmunoResearch )温育60分钟。细胞骨架特征用于测 定细胞取向和形态，以及NHDF单层的总体组织和伤口覆盖度。NHDF 核用Hoechst染色5分钟以允许细胞计数。在非排列对齐的纤维上， 细胞迁移和伤口覆盖度是唯一在24小时后适度的，但是当纤维与伤口 的长边缘垂直取向时，其被大大地增强了 (图36)。还有，NHDF在非 排列对齐纤维上随机取向，但在排列对齐纤维上以纤维方向取向。
实施例17 伤口愈合仅使用排列对齐纤维如实施方案16所述生成PLLA纤维性 聚合物支架薄片用于伤口愈合。在细胞接种前，纤维性聚合物支架薄 片可用实施方案10所述的层粘连蛋白和/或bFGF功能化，bFGF固定 在所述聚合物支架薄片上，和以可溶形式存在于培养液中。在实施方 案16所述的这些薄片上的单层正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)内生成 人工伤口或缺陷。所有样品的纤维排列关于伤口的长轴垂直。用实施 方案16所描述的免疫染色和显微学分析细胞迁移和伤口覆盖度。未经 处理纤维上的NHDF在24小时后没有充分覆盖伤口区域，而处理纤维
95(层粘连蛋白或bFGF)上的NHDF向伤口更快地迁移并显示出增强的 伤口覆盖度(图37)。
实施例18
动物的纳米纤维伤口愈合排列可生物降解的聚合物纳米纤维薄片使用实施方案14 所述转鼓集电极生成，这些薄片将用作伤口敷料以有助于动物体内的 皮组织修补。外科医生将在大鼠背部切割以整块厚的缺口。将微米/ 纳米纤维薄片切割成伤口的尺寸，并缝合到外胚层内以有助于成纤维 细胞迁移到缺口。伤口愈合和组织再生使用数字摄影，组织学，和免 疫组织化学监测。
实施例19
制备水蛭素仿生支架的方法可以使用如下方法制备本发明的水蛭素仿生支架
1. 将15-"重量/体积百分比的聚(L-乳酸)、聚(乙醇酸)、 其两者的组合或任何其他可生物降解/可生物吸收的聚合物或掺合物 溶解于溶剂(1， 1， 1， 3， 3， 3-六氟-2-丙醇)中。
2. 可以将0. 1-5重量/重量百分比的盐(氯化钠，乙酸钠等)加 入到所述聚合物溶液中，以增加溶液的导电性并降低纤维直径。
3. 使用本文描述的静电纺纱技术将聚合物溶液应用到底物上 (芯轴直径O. 1 - 10 cm，收集平板)。
4. 使静电纺纱管内的溶剂蒸发几小时。
5. 将所述管在70%的乙醇中并放置在UV杀菌条件下至少30分 钟进行灭菌。
6. 用双蒸水彻底冲洗所述样本。
7. 用0.01-1标准NaOH处理所述管至少10分钟，以增加聚合 物上的羧基数量。
8. 用双蒸水彻底沖洗所述样本。
969. 用l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC 或EDAC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)将官能性胺连接到聚 合物上暴露的羧基上。双(胺)聚乙二醇(PEG)提供胺基基团，緩冲 液是pH为7.2的磷酸盐緩冲盐水(PBS)或0. 5摩尔的2-(N-吗啉代) 乙磺酸。该溶液与静电纺纱管在室温下温育一小时。
10. 用双蒸水彻底冲洗所述样本。
11. 用EDC， Sulfo-NHS和緩沖液将双(胺)PEG上的胺基基团 最终连接到水蛭素的羧基上。该溶液与静电纺纱管在室温下温育二小 时。
12. 样本用PBS彻底冲洗。
13. 在真空下干燥样本或风干，并保存在无菌条件下。
14. 在手术植入前，将移植物放置在无菌盐水中1-分钟。
实施例20
涉及仿生支架的动物研究所有方法均被在加利福尼亚大学，洛杉矶的制度性评价委 员会和动物管理和使用委员会获准。无胸腺大鼠(6-8周龄，约180g) 荻自国立癌症研究所的动物部门。大鼠用2.0%异氟烷麻醉并仰卧放 置。制作小切口以暴露并分离左颈总动脉(CCA)。 钳夹并结扎，将移 植物端-对-端放置，并用IO-O号线间断缝合。在植入之前或期间不在 任何点使用肝素或任何其它抗凝剂。移植物的取出涉及与用于植入过 程相同的初始步骤。将40单位的肝素注射到颈外静脉，以防止在取出 植入物期间发生凝血。通过在临近缝合线位置直接结扎天然CCA将移 植物取出。为了进行组织学分析，将样本放入OCT并在-20。C冷冻保 藏。制作IO nm厚度的冷冻切片。使用如下初级抗体进行免疫组织化 学染色来分析切片。CD31(BD Biosciences),肌球蛋白重链(Santa Cruz Biotech)和CD68 (Chemicon)。 使用小鼠IgG同种型歸o, Carpinteria， CA)代替初级抗体用于阴性对照。用Zeiss Axioskop 2 MOT显微镜拍摄免疫组织化学图像。物并植入到Sprague Dawley大鼠(约180 grams)的颈总动脉30天。 在植入前、期间或之后不在任何位点使用任何系统性抗血小板剂、抗 凝剂或肝素。图42A的Verhoeff's弹性染色显示移植物具有明显的内 部重塑、血栓形成和内膜增生。通过与PLLA移植物相比，血栓(染 色为深紫色)明显，内膜组织(离开移植物并朝向腔内生长)。图42B 显示了粘附到血栓組织并离开PLLA移植物的融合的单层内皮细胞。图 42C的平滑肌细胞特异性染色(肌球蛋白重链)显示内膜增生和向内 重塑的确定征兆。图42D显示与水蛭素移植物相比，单核细胞和巨噬 细胞(CD68)的数量略微增多并且存在于移植物的壁上。制备两个水蛭素缀合的移植物并植入到Sprague Dawley 大鼠(约180 g)的颈总动脉28天。在植入前、期间或之后不在任何位 点使用任何系统性抗血小板剂、抗凝剂或肝素。图43A的苏木精染色 显示100%畅通，腔内没有血栓。图43B显示直接粘附到PLLA纳米纤维 网表面的融合的单层内皮细胞(CD31)，并且显然移植物上没有血栓。 图43B的平滑肌细胞特异性染色(肌球蛋白重链)显示没有内膜增生 现象。图43D中单核细胞和巨噬细胞(CD68)的数量很少，并且仅限于 PLLA移植物的周围。VerhoefPs 弹性染色试剂盒购买自 American Master*Tech Scientific Inc.,用于显示弹性纤维和胶原纤维。OCT 包埋的冷冻样本被冷冻切片为7nm。图像显示弹性纤维为黑色，而胶 原纤维为红色。Verhoefrs working stain为苏木精、三氯化牵失和 碘溶液的混合物，将每种样本浸入其中15分钟。然后使用2%三氯化 铁分化溶液3分钟，然后将样本放入Van Gieson's染色30秒。将栽 玻片经过一系列梯度酒精脱水，用Safeclear II透明并用封盖胶封固。
苏木精和《尹红染色Harris方法材料都储存在红色Flammable箱内。
名称目录#
Histoprep 乙醇(乙醇)Fisher HC800
Safeclear II(二甲苯置换)试验设计044-192
伊红Y试验设计316-631
Harris苏木精试验设计245-678
染色Bluing SolutionHarleco 65354185
实验设计
在蒸馏水中冲洗载玻片。
浸入Harris苏木精3分钟。 用自来水冲洗直到透明，共3次，10秒。 在Bluing Solution中染蓝1分钟。 用自来水冲洗直到透明10秒。 用伊红复染30秒。
用梯度乙醇脱水95%, 100°/。， 100%，每个l分钟。 用二曱苯(或Safeclear II)脱水，每个5分钟。 用树脂封固介质(Permount)封固。 处置化学废品H， E，醇。 观察(H:紫色-核；E:粉色-基质，胞质溶胶)可以理解本文所述实施例和实施方案仅是为了示例性的目 的，本领域技术人员将获得在其教导下的各种修饰或变化的启示，并 包括在本申请的精神和限度以及所附权利要求的范围内。本文所引用 的所有出版物，专利和专利申请为所有目的通过引用并入本文。
99
权利要求
1. 一种组合物，包含第一纤维性聚合物支架管或填充的管，水蛭素，其中所述第一纤维性聚合物支架的一条或多条纤维是排列对齐的；其中所述水蛭素直接或通过连接物非共价连接或共价连接到所述第一纤维性聚合物支架。
2. 根据权利要求1的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架具 有选自如下的长度约0. Olcm到约20cm,约0. 05cm到约5cm，约0. 5cm 到约5cm,约lcffl到约5cm，约2cm到约5cm，约lcm到约3cm，约2cm 到约10cm，和约5cm到约15cm。
3. 根据权利要求1的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架基 本沿着选自纵向和圆周的方向排列。
4. 根据权利要求1的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架具 有接缝。
5. 根据权利要求1的組合物，其中所述第一纤维性聚合物支架是 无缝的。
6. 根据权利要求1的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架是 整体形成的。
7. 根据权利要求1的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架的 至少一条纤维包括选自如下的聚合物或亚基脂肪族聚酯，聚环氧烷 烃，聚二甲基硅氧烷，聚己酸内酯，聚赖氨酸，胶原，层粘连蛋白， 纤连蛋白，弹性蛋白，藻酸盐，纤维蛋白，透明质酸，蛋白聚糖，多 肽及其组合。
8. 根据权利要求7的组合物，其中所述脂肪族聚酯选自如下乳 酸(D-或L-)，丙交酯，聚(乳酸)，聚(丙交酯)，羟基乙酸，聚(羟 基乙酸)，聚(乙交酯)，乙交酯，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)，聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)，及其组合。
9. 根据权利要求7的组合物，其中所述聚环氧烷烃选自如下聚 环氧乙烷，聚环氧丙烷，及其组合。
10. 权利要求l的组合物，其中所述笫一纤维性聚合物支架的至 少一条纤维包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚L-丙交酯(PLLA)。
11. 权利要求l的组合物，其中所述水蛭素通过连接物共价连接 到所述第一纤维性聚合物支架。
12. 权利要求l的组合物，其中所述连接物包括选自如下的成员 肽，糖类，聚(醚)，聚(胺)，聚(羧酸)，聚(亚烷基二醇)，聚(乙二 醇)，聚(丙二醇)，乙二醇和丙二醇的共聚物，聚(oxyethylated polyol)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟丙基甲基丙烯酰胺) 聚(oc-羟酸)，聚(乙烯醇)，聚磷嗪，聚恶唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，聚唾液酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚交酯: 聚甘油酯及其共聚物和聚丙烯酸。
13. 权利要求11的组合物，其中所述连接物包括选自如下的成 员聚(乙二醇)，聚(丙二醇)及其组合。
14. 权利要求l的组合物，进一步包括围绕第一纤维性聚合物支 架管或填充管的外表面但不位于第一纤维性聚合物支架管或填充管的 腔内的袖管。
15. 权利要求14的组合物，其中所述袖管包括选自如下的聚合物 或其亚单位据对苯二甲酸亚乙酯和聚四氟乙烯。
16. 权利要求14的组合物，其中所迷袖管包括第二纤维性聚合物 支架，并且所述第二纤维性聚合物支架对齐或具有随机定向。
17. 权利要求16的组合物，还包括围绕第一纤维性聚合物支架 的第一端的第一袖管和围绕第一纤维性聚合物支架的第二端的第二袖 管。
18. 根据权利要求l的組合物，还包括细胞。
19. 根据权利要求18的组合物，其中所述细胞包埋在第一纤维性 聚合物支架内或在第一纤维性聚合物支架的表面上。
20. 根据权利要求18的组合物，其中所述细胞选自千细胞和祖细胞。
21. 根据权利要求18的組合物，其中所述细胞选自如下成年血管细胞，血管祖细胞，血管干细胞。
22. 根据权利要求l的组合物，该组合物通过将含有聚合物的聚 合物溶液施加到旋转芯轴上制得。
23. 根据权利要求l的组合物，其中所述聚合物支架通过包括具 有至少一个不导电区的旋转芯轴的静电纺纱过程制得。
24. 根据权利要求l的组合物，其中所述第一纤维性聚合物支架 是无缝的、周缘对齐的，并且所述第一纤维性聚合物支架的至少一条 纤维包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA);所述水蛭素通过连接物共 价连接到所述第一纤维性聚合物支架，所述连接物是选自如下的成员 二氨基聚(乙二醇)和聚(乙二醇)。
25. 权利要求24的组合物，其中所述组合物具有约lmm至约50cm的长度。
26. 权利要求24的组合物，其中所述组合物具有约0. 5 cm至约 10 cm的长度。
27. 权利要求24的组合物，其中所述组合物具有约3mm至约6mm 的长度。
28. 权利要求24的組合物，其中所述组合物具有约0.01 mm至 约6 mm的内径。
29. 权利要求24的组合物，其中所述组合物具有约3mm至约6 mm 的内4圣。
30. 权利要求29的组合物，其中所述组合物具有约4 cm至约8 cm 的长度。
31. 权利要求24的组合物，其中所述组合物用作A/V分流器 或血液透析通路移植物。
32. 药物组合物，其包括(a) 权利要求1的组合物；和(b) 药学上可接受的赋形剂。
33. 治疗受试者损伤的方法，所述方法包括(i )将权利要求1或24的组合物以足以治疗所述损伤的量并在足以治疗所述损伤的条件下施用到所述受试者的目标部位。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述目标位点选自如下冠状 动脉，股动脉，胭动脉，颈动脉，脑动脉，腹部，膝盖以上，膝盖以 下和桡骨。
35. 根据权利要求33的方法，其中所述目标位点选自颈动脉和膝 盖以下的血管组织。
36. 根据权利要求33的方法，其中所述损伤涉及断开的血管，所 述第一纤维性聚合物支架具有包含第一端和第二端的管或填充管的形 状，且所述断开的血管包括第一血管残端和第二血管残端，所述施用 包括(ii )将所述组合物的所述第一端连接到所述第一血管残端；和 (iii)将所迷組合物的所迷第二端连接到所述第二血管残端。
37. 增强受试者血管生长的方法，所述方法包括(i )将权利要求1或24的组合物以足以增强血管生长的量并在 足以增强血管生长的条件下施用到所述受试者的目标血管部位。
38. 制备权利要求1的组合物的方法。
39. 制备权利要求1的组合物的方法，所述方法包括(i )对一条或多条纤维进行静电纺纱过程，从而制造所述组合物。
40. 根据权利要求39的方法，其中所述静电纺纱过程包含具有至 少一个不导电区的旋转芯轴。
全文摘要
本发明提供了包含纳米纤维性聚合物的组合物，其中所述纳米纤维性聚合物的纤维是排列对齐的，并且分子直接或通过连接物与所述纳米纤维性聚合物共价连接。该分子能够共价或者非共价连接到选自如下的成员胞外基质组分，生长因子及其组合。本发明还提供了制造所述组合物的方法和使用所述组合物向受试者如人添加新组织的方法。
文档编号A61F2/00GK101500508SQ200780029262
公开日2009年8月5日 申请日期2007年6月11日 优先权日2006年6月9日
发明者C·哈什, 松 李 申请人:加利福尼亚大学董事会