具有便于进入培养腔的盖子的生物反应器的制造方法与工艺

本发明涉及一种生物反应器，其设置有便于容易且快速地进入培养腔的盖子。具体而言，培养腔的端壁由该盖子构成，以便该盖子的移除使得能完全进入该培养腔。

背景技术：
在基本上平的培养皿中进行“传统的”细胞培养的过程中，初生细胞通常趋向于去分化并且活检组织尤其趋向于去分化。可以看到，当细胞从一块组织迁移出到培养皿的平的支撑表面上时，活检组织呈现“融化冰淇淋效应”。这些“迁移”细胞中的基因表达被改变，这些细胞在生物化学上开始表现为如同分离细胞，而不是像分化组织的细胞组分那样。与完整有机体中的相应细胞的正常表达相比，去分化细胞表达出了不同的生物化学路径。另外，与完整有机体中的相应的会死亡的细胞相比，不死细胞通常已经失去了一些或许多专门功能。与“传统的”细胞培养条件不同，“微重力”条件在培养中保留了许多类型细胞的分化状态。微重力生物反应器通过典型的圆筒形或管状培养腔或隔室的持续旋转维持了微重力环境。这种持续旋转有助于防止细胞附着到培养腔的壁上，从而利用最小的剪切力使细胞悬浮在流体环境中。这诱使它们相互作用并聚集成集落。这些集落已经被赋予了各种名字，包括球状体、细胞集块(conglomerates)、细胞集合体(aggregates)和ProtoTissueTM(在此所有这些均被认为是等同的)。对于微重力培养，细胞在最初通常被播散出到小(大约100μm直径)珠子上(这加快了微组织结构的形成)，但这不是必要的，在文献中公开了几种其他可供选择的方案，例如，使用架(scaffolds)[LeeKW、WangS、DadsetanM、YaszemskiMJ、LuL，通过具有受控孔结构的三维纳米复合架来增强细胞的内生长和增殖(Enhancedcellingrowthandproliferationthroughthreedimensionalnanocompositescaffoldswithcontrolledporestructures),Biomacromolecules,11:682-9,2010]，或者使用交联水凝胶[VillanuevaI、KlementBJ、VonDeutschD、BryantSJ，交联密度改变封装在聚(乙二醇)水凝胶中并且在旋转壁器皿中培养的软骨细胞中的早期新陈代谢活动(Cross-linkingdensityaltersearlymetabolicactivitiesinchondrocytesencapsulatedinpoly(ethyleneglycol)hydrogelsandculturedintherotatingwallvessel),BiotechnolBioeng.，102:1242-50,2009]。随着通过细胞围绕这些珠子生长而形成球状体，这些珠子通常变成被细胞完全覆盖。这种方式形成的球状体变得高度分化到类似成熟组织的程度[NavranS.,低剪切模型微重力在三维细胞生物学和组织工程中的应用(Theapplicationoflowshearmodelledmicrogravityto3-Dcellbiologyandtissueengineering),BiotechnolAnnRev.,14:275-296,2008][FreedLE、Vunjak-NovakovicG和LangerR.,细胞-聚合物软骨植入体在生物反应器中的培养(CultivationofCell-PolymerCartilageImplantsinBioreactors),JCellBiochem.,51:257-64,1993][BrownLA、ArterburnLM、MillerAP、CowgerNL、HartleySM、AndrewsA、SilberPM、LiAP,在旋转壁器皿中作为球状体培养的大鼠肝细胞中肝功能的保持(MaintenanceofLiverFunctionsinRatHepatocytesCulturedasSpheroidsinaRotatingWallVessel),InVitroCellDevBiolAnim.；39:13-20,2003]。微重力生物反应器已经被用于各种环境。早期的研究表明，微重力生物反应器系统通过减少作用在细胞上的剪切应力，帮助细胞形成三维结构[剪切应力减小：哺乳动物组织在模拟微重力中形成三维装配的能力中的主要部分(Reducedshearstress:amajorcomponentintheabilityofmammaliantissuestoformthree-dimensionalassembliesinsimulatedmicrogravity),GoodwinTJ、PrewettTL、WolfDA、SpauldingGF.,JCellBiochem.,1993年3月；51(3):301-11]。目前大量文献表明在微重力生物反应器系统中生长的细胞分化加大。为回顾，可参见：[NavranS.，低剪切模型微重力在三维细胞生物学和组织工程中的应用(Theapplicationoflowshearmodelledmicrogravityto3-Dcellbiologyandtissueengineering)，BiotechnolAnnRev.，14:275-296,2008]和[微重力中的组织生长(Growingtissuesinmicrogravity)，UnsworthBR、LelkesPI，NatMed.，1998年8月；4(8):901-7]。例如，微重力培养诱导神经前体细胞形成细胞群集或“神经球”。这些神经球的特征在于天然的、但有组织的构造，其具有未成熟增殖细胞(巢蛋白-和增殖细胞核抗原-阳性)的表面层，该细胞包围更加分化的细胞(β-微管蛋白III-和胶质纤维酸性蛋白-阳性)的层。这些“神经球”有希望发育成可移植的神经组织。参见例如[神经前体细胞在旋转壁器皿生物反应器中形成未成熟的类组织结构(Neuralprecursorcellsformrudimentarytissue-likestructuresinarotating-wallvesselbioreactor)，LowHP、SavareseTM、SchwartzWJ,InvitroCellDevBiolAnim.,2001年3月；37(3):141-7]以及参见[旋转壁生物反应器中生长的Sertoli-NT2细胞组织结构中的NT2细胞的快速分化(RapiddifferentiationofNT2cellsinSertoli-NT2celltissueconstructsgrownintherotatingwallbioreactor)，SaportaS、WillingAE、ShamekhR、BickfordP、ParedesD、CameronDF，BrainResBull.，2004年12月150；64(4):347-56]。或者作为另外一个例子，多能人类视网膜细胞株的微重力培养导致体内接近显型的表达，这在细胞在其他条件下生长的情况下是不能实现的[NASA生物反应器中由人类视网膜细胞株生成3D视网膜样结构(Generationof3Dretina-likestructuresfromahumanretinalcelllineinaNASAbioreactor)，DuttK、Harris-HookerS、EllersonD、LayneD、KumarR、HuntR，CellTransplant，2003；12(7):717-31]。在其它组织中也已证实了改善的分化[FreedLE、Vunjak-NovakovicG和LangerR，细胞-聚合物软骨植入体在生物反应器中的培养(CultivationofCell-PolymerCartilageImplantsinBioreactors)，JCellBiochem.，51:257-64,1993][BrownLA、ArterburnLM、MillerAP、CowgerNL、HartleySM、AndrewsA、SilberPM、LiAP，在旋转壁器皿中作为球状体培养的大鼠肝细胞中肝功能的保持(MaintenanceofLiverFunctionsinRatHepatocytesCulturedasSpheroidsinaRotatingWallVessel).InVitroCellDevBiolAnim.；39:13-20,2003]。已报道微重力生物反应器存在一些技术问题。例如，当使用平的培养器或微重力生物反应器生产颞下颌关节(TMJ)盘组织时，在总母体含量和压缩硬度上没有明显差别，尽管在整体外形、组织结构以及I型胶原质和II型胶原质(生物反应器盘具有更多的II型胶原质)的分布上差别显著。作者给出结论，微重力生物反应器培养系统必须进行改进[DetamoreMS、AthanasiouKA，使用旋转生物反应器用于组织工程化生产颞下颌关节盘(Useofarotatingbioreactortowardtissueengineeringthetemporomandibularjointdisc)，TissueEng.，2005年7月-8月；11(7-8):1188-97]。DNA修复系统似乎也受到不利的影响[KumariR、SinghKP、DumondJWJr，模拟微重力降低了DNA修复能力并诱导人类淋巴细胞中的DNA损坏(SimulatedmicrogravitydecreasesDNArepaircapaci...