适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法
【专利摘要】本发明公开适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法。该方法包括如下步骤：(1)明胶0.3-l.Og，透明质酸钠1-8mg和软骨素6-磷酸钠盐0.05-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中而构成溶液；(2)用1-5mL0.5-5%EDC加入所述溶液中混匀；(3)在室温放置1-lOmin，然后在-20°C冷冻0.5-3h，-60?80°C再冷冻0.5-3小时；(4)最后经-50°C冻干机条件下冻干48-96小时以得到初步脚手架；(5)将所述初步脚手架和5-20mL0.1-0.5%EDC在室温作用12-48h；(6)再在-20?-30°C的条件冷冻12-48h后，最后，在-50°C冻干机条件下冻干48-96小时，制得脚手架，这样的脚手架具有多孔海绵状空间立体架构、组织相容性好、质地好、孔径大小合适以及吸水度好、没有毒性也可完全降解。
【专利说明】适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程学的医学组织工程材料，尤其涉及适合细胞生长的多孔径组 织工程脚手架的制造方法。
【背景技术】
[0002] 组织工程是指应用生命科学与工程学的原理和方法来设计、组建、维护人体细胞 和组织的生长，以恢复受损伤的组织或器官的功能。组织工程的发展为组织或器官的修复 与再建提供了可能。组织工程材料也日益受到人们的重视，研究开发具有良好组织相容性 的材料已成为组织工程发展的基石。
[0003] 以前的脚手架一般为颗粒状、线条状结构，不具有多孔空间立体架构。另外，以前 的脚手架常常组织相容性不好、或具有一定毒性、或不能可完全降解，或吸水度不好。这样 的脚手架不利于细胞在一定的空间架构中生长，不利于它们的相互作用和细胞通讯，不符 合在机体中实际的自然状态。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的问题是现有的脚手架不具有多孔空间立体结构的问题。
[0005] 为解决上述问题，本发明提供一种适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造 方法，该方法包括如下步骤：（1)、明胶0. 3-1. 0g，透明质酸钠 l-8mg和软骨素6-磷酸钠盐 0. 05-0. 5g溶解在5-10ml双蒸水中而构成溶液；（2)、用l-5mL0. 5-5% EDC加入所述溶液中 混匀；（3)、在室温放置Ι-lOmin，然后在-20°C冷冻0. 5-3h，-60?80°C再冷冻0. 5-3小时； (4)、最后经-50°C冻干机条件下冻干48-96小时以得到初步脚手架；（5)、将所述初步脚手 架和5-20mL0. 1-0. 5% EDC在室温作用12-48h ; (6)、再在-20?-30°C的条件冷冻12-48h 后，最后，在_50°C冻干机条件下冻干48-96小时，制得脚手架。
[0006] 在进一步方案中，所述明胶的数值范围是0. 4?0. 7g、透明质酸钠的数值范围是 3?8mg、软骨素6-磷酸钠盐的最好范围是是0. 2?0. 4g或双蒸水的数值范围是7. 0? 8. 5ml。
[0007] 在进一步方案中，在步骤2中所述EDC的数值范围是1. 5?2. 5ml。
[0008] 在进一步方案中，在步骤3中，所述在室温放置时间是2?5min、在_20°C冷冻放 置时间的数值范围是1. 5?2. 5h或在-80°C冷冻放置时间的数值范围是1. 5?2. 5h。
[0009] 在进一步方案中，在步骤4中-50°C的条件下冻干时间的数值范围是64?80h。
[0010] 在进一步方案中，在步骤5中，EDC的数值范围是8?13ml、在室温放置时间的数 值范围是18?30min。
[0011] 在进一步方案中，在步骤6中，在-20°C冷冻在室温放置时间的数值范围是18? 30min或在冻干时间最好的数值范围是64?80h。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0013] 由于本发明采用上述制备条件并将各成分控制在上述范围内，所以，制得的工程 脚手架具有多孔海绵状空间立体架构、组织相容性好、质地好、孔径大小合适以及吸水度 好，而且，由于采用所述材料，所以，没有毒性也可完全降解。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是本发明适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法的流程图；
[0015] 图2是通过本发明的方法制造的一种工程脚手架的结构图，该图显示工程脚手架 钼金喷镀后扫描电子显微镜放大2000倍照片，该照片显示本材料呈光滑的多孔海绵状空 间构架，标尺20um，P为海绵多孔结构，孔径均匀，表面光滑，经测量孔径大小为60-80um。
【具体实施方式】
[0016] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所达成目的及功效，下面将结合实施例 并配合附图予以详细说明。
[0017] 请参阅图1，本发明适合细胞生长的多孔径海绵状组织工程脚手架包括如下步 骤：
[0018] (1)、明胶0· 3-1. 0g，透明质酸钠 l-8mg和软骨素6-磷酸钠盐0· 05-0. 5g溶解在 5-10ml双蒸水中而构成溶液；
[0019] 在该步骤中，当明胶小于0. 3g时，脚手架质地会太软，不易冻干成型，无法形成多 孔状结构，孔径大小合适；当明胶大于I. Og时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本 发明中，明胶为 〇· 3g、0. 35g、0. 4g、0. 42g、0. 47g、0. 5g、0. 53g、0. 57g、0. 59g、0. 65g、0. 7g、 0· 75g、0. 78g、0. 81g、0. 84g、0. 89g、0. 92g、0. 95g、0. 97g 或者 I. 0g，明胶最好的数值范围是 0. 4?0. 7g，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。
[0020] 在该步骤中，当透明质酸钠小于Img时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差，大于 8mg 时，孔径变小，质地变软。比如，可以是 lmg、l. 5mg、l. 8mg、2mg、2. 5mg、2. 7mg、2. 9mg、 3mg、3. 4mg、3. 6mg、4mg、4. lmg、4. 2mg、4. 9mg、5mg、5. 7mg、5. 9mg、6mg、6. 3mg、6. 5mg、6. 8mg、 6. 9mg、7mg、7. 2mg、7. 8mg或者8mg。在本发明中，透明质酸钠最好的数值范围是3?8mg。
[0021] 在该步骤中，所述软骨素6-磷酸钠盐可以是0.05g、0. lg、0. 13g、0. 15g、0.2g、 0· 23g、0. 27g、0. 3g、0. 35g、0. 4g、0. 41g、0. 43g、0. 47g 或者 0· 5g。在本发明中，软骨素 6-磷 酸钠盐的最好范围是是〇. 2?0. 4g。
[0022] 在该步骤中，当双蒸水的量小于5ml时,质地变脆；当双蒸水的量大于IOml时,不 易冻干。比如，5ml、5. 5ml、5. 8ml、6ml、6. 2ml、6. 7ml、6. 9ml、7ml、7. 1ml、7. 3ml、7. 7ml、8ml、 8. 5ml、8. 9ml、9ml、9. lml、9. 3ml、9. 6ml、9. 9ml 或者 10ml。双蒸水的最好数值范围是 L 0 ? 8. 5ml 〇
[0023] (2)、用 l_5mL0· 2 % l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC) 加入所述溶液中混匀；
[0024] 在该步骤中，当EDC小于Iml时，脚手架质地会太软，不易冻干成型，无法形成多孔 状结构；当EDC大于5ml时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，EDC为lml、 L 3ml、l. 6ml、l. 9ml、2ml、2. 2ml、2. 5ml、2. 8ml、3. lml、3. 4ml、3. 7ml、4. 0ml、4. 3ml、4. 6ml 或 者5ml，在本发明中EDC最好的数值范围是I. 5?2. 5ml，脚手架质地和吸水度合适。
[0025] (3)在室温放置Ι-lOmin，然后在-20°C冷冻0· 5-3h，-80°C再冷冻0· 5-3小时；
[0026] 在该步骤中，当在室温放置时间小于Imin时，脚手架质地会太软，不易冻干成型， 无法形成多孔状结构；当EDC大于IOmin时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明 中，在室温放置时间为 lmin、2min、3min、4min、5min、6min、7minl、8min、9min 或 lOmin，在室 温放置时间最好的数值范围是2?5min，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。
[0027] 在该步骤中，当在_20°C冷冻放置时间小于0. 5h时，将有冰晶形成，不能使用冻干 机冻干；当-20°C冷冻放置时间大于3h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明 中，在室温放置时间为0. 5h、l. Oh、l. 5h、2h、2. 5h、3h，在-20°C冷冻放置时间最好的数值范 围是1. 5?2. 5h，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。
[0028] 在该步骤中，当在_80°C冷冻放置时间小于0. 5h时，脚手架冷冻不足，不能使用冻 干机冻干；当-80°C冷冻放置时间大于3h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明 中，在室温放置时间为0. 5h、l. Oh、l. 5h、2h、2. 5h、3h，在-80°C冷冻放置时间最好的数值范 围是1. 5?2. 5h，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。
[0029] (4)、最后经-50°C冻干机条件下冻干48_96h以得到初步脚手架；
[0030] 在该步骤中，当冻干时间小于48h时，脚手架冻干不足，还呈粘稠状，无法得到初 步脚手架；当冻干时间大于96h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，在冻干 时间为4811、5611、6411、7211、8011、8811、9611，在冻干时间最好的数值范围是64?8011，在该范围 内脚手架质地和吸水度合适。
[0031] (5)、将所述初步脚手架和5-20mL0. 2% EDC在室温作用12-48h ;
[0032] 在该步骤中，当EDC小于5ml时，脚手架质地会太软，孔径将太小；当EDC大于20ml 时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，EDC为5ml、5. 2ml、5. 6ml、6. 3ml、7ml、 7. 5ml、8ml、IOml、I Iml、13ml、16ml、20ml，EDC最好的数值范围是8?13ml，在该范围内脚手 架质地和吸水度合适。
[0033] 在该步骤中，当在室温放置时间小于12h时，脚手架质地会太软；当EDC大于48h 时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，在室温放置时间为12h、18h、24h、30h、 36h、42h、48h，在室温放置时间最好的数值范围是18?30min，在该范围内脚手架质地和吸 水度合适。
[0034] ￠)、再在_20°C的条件冷冻12-48h后，最后，在-50°C冻干机条件下冻干48-96小 时，制得脚手架。
[0035] 在该步骤中，当在_20°C冷冻放置时间小于12h时，将有冰晶形成，不能使用冻干 机冻干；当-20°C冷冻放置时间大于48h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明 中，1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811，在室温放置时间最好的数值范围是18?3〇1^11，在该 范围内脚手架质地和吸水度合适。
[0036] 在该步骤中，当在_50°C冻干时间小于48h时，脚手架冻干不足，质地变软；当冻干 时间大于96h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，在冻干时间为48h、56h、 64h、72h、80h、88h、96h，在冻干时间最好的数值范围是64?80h，在该范围内脚手架质地和 吸水度合适。
【权利要求】
1. 适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征是：该方法包括如下步 骤： ⑴明胶〇· 3-1. Og，透明质酸钠 l-8mg和软骨素6-磷酸钠盐0· 05-0. 5g溶解在5-10ml 双蒸水中而构成溶液； (2) 用l-5mL0. 5-5% EDC加入所述溶液中混匀； (3) 在室温放置Ι-lOmin，然后在-20°C冷冻0. 5-3h，-60?80°C再冷冻0. 5-3小时； (4) 最后经-50°C冻干机条件下冻干48-96小时以得到初步脚手架； (5) 将所述初步脚手架和5-20mL0. 1-0. 5% EDC在室温作用12-48h ; (6) 再在-20?-30°C的条件冷冻12-48h后，最后，在-50°C冻干机条件下冻干48-96 小时，制得脚手架。
2. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤1中，所述明胶的数值范围是0. 4?0. 7g、透明质酸钠的数值范围是3?8mg、软 骨素6-磷酸钠盐的最好范围是是0. 2?0. 4g或双蒸水的数值范围是7. 0?8. 5ml。
3. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤2中所述EDC的数值范围是1. 5?2. 5ml。
4. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤3中，所述在室温放置时间是2?5min、在-20°C冷冻放置时间的数值范围是 1. 5?2. 5h或在-80°C冷冻放置时间的数值范围是1. 5?2. 5h。
5. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤4中-50°C的条件下冻干时间的数值范围是64?80h。
6. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤5中，EDC的数值范围是8?13ml、在室温放置时间的数值范围是18?30min。
7. 如权利要求1所述的适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法，其特征 是：在步骤6中，在-20°C冷冻在室温放置时间的数值范围是18?30min或在冻干时间最 好的数值范围是64?80h。
【文档编号】C08J9/36GK104211982SQ201310664598
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年11月30日 优先权日:2013年5月31日
【发明者】曾宪智, 沈慧娟, 刘鹏鹏 申请人:嘉兴学院