一种新型皮肤填充剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医用生物材料技术领域，涉及一种新型交联透透明质酸钠凝胶的制备 方法，该交联透明质酸钠凝胶用于医学填充美容。
【背景技术】
[0002] 透明质酸钠是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，它由 (1-0 -4) f葡糖醛酸和（1-0 -3) A乙酰基氨基葡糖双糖单位重复连接而成，广泛使 用在修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹。透明质酸具有良好的理化性能及生物 相容性。然而，它在体内受到透明质酸酶的酶解作用而迅速降解，存留时间较短，需要重复 注射才能达到疗效。交联透明质酸是透明质酸经交联剂交联修饰得到的高分子凝胶，可以 弥补透明质酸存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果。
[0003] 经过近几年的快速发展及其市场整合，如今交联透明质酸钠凝胶的技术现状趋于 平稳和雷同，市场中的产品竞争也进入了白热化，仅在中国市场就有4-5家产品并存，但从 交联技术层面来讲，类型主要包括两大类即二乙烯基砜（DVS)和1，4- 丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE)作为交联剂；同时现有的产品在凝胶的化学结构是都是一致的即交联/修饰的位点 均在-OH上；众所周知上述两种交联剂具有很高的生物毒性或潜在的致癌性，虽然各生产 厂家采取了严格的控制措施确保产品的安全性，但交联透明质酸钠凝胶为长期植入体内的 三类医疗器械，因此临床上也缺乏大样本的长期跟踪数据来佐证该类产品的生物安全性； 同时由于市场需求的趋势，如今包括国外生产厂家都在追求更长的体内残留时间，这势必 提高产品的交联/修饰程度，加大交联剂的引入量，更加剧了人们对该类产品的担忧。
[0004] 因此，在世界范围内选择无毒或低毒的交联剂成交联透明质酸钠凝胶领域的必然 趋势。氨基酸是一类具有双官能团的化合物，是组成蛋白质的基本单位，可以被人体吸收利 用，相比其他传统的化学交联剂来讲，其毒性明显降低(表1)，因此选择氨基酸及其衍生物 作为交联剂制备交联透明质酸钠凝胶再生物安全性方面具有较大优势；同时在交联的凝胶 的分子结构上也具有显著区别于现有产品的独特优势，即利用透明质酸钠分子中的羧基与 氨基酸交联剂中的氨基形成酰胺键从而达到交联的效果，大量的文献研究结果表明酰胺键 具有的优良的热稳定性，这也显示利用氨基酸作为交联剂制备的透明质酸钠凝胶具有潜在 的抗高温灭菌的特性；众所周知透明质酸钠在体内的降解主要是通过特异性的透明质酸酶 来实现的，该过程的特异性识别位点为羧基，而利用氨基酸作为交联剂的反应位点恰为羧 基，因此利用氨基酸作为交联剂制备的凝胶具有显著区别于传统产品的抗酶解性。
[0005] 表1赖氨酸与常用交联剂毒性对比分析表
在透明质酸钠分子中引入酰胺键常用的方法有1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)-碳二 亚胺（EDC)活化、2-氯-1-甲基吡啶鐺碘化物（CMPI)活化等，但这些方法大都存在着诸多 的弊端，如EDC活化法对PH值的依赖性较强且接枝效率低，不适宜于大规模的产业化放大； 而CMPI活化法则存在着存在反应活性低、后处理复杂等弊端。
[0006] 鉴于上述方法的不足，本发明采用吗啉衍生物作为偶联试剂进行制备交联透明质 酸钠凝胶（以下简称DMTMM法)。DMTMM是目前较为理想的生成酰胺键的方法之一，其具有如 下几个优势：1.反应活性高，单一氨基酸的接枝率可达到70%以上；2.反应温和，低温和 室温下即可反应；3.对PH的依赖性弱，易于产业化生产；4.副反应少，未参加反应的吗啉 衍生物不与透明质酸钠反应，且易于去除，有利于产品的质量控制。
[0007] 本发明利用DMTMM法，采用人体内的必需氨基酸中的碱性氨基酸-赖氨酸和精氨 酸及其衍生物作为交联剂制备交联透明质酸钠凝胶从根本上避免了 DVS、BDDE等毒性较大 的交联试剂的使用，保证的透明质酸钠衍生物的安全性，同时赋予了凝胶以独特的物理特 性即热稳定性和抗透明质酸酶解性。
【发明内容】
[0008] 本发明的优点： 1.采用人体内的必需氨基酸中的碱性氨基酸-赖氨酸及其衍生物作为交联剂，上述交 联剂具有无毒特性同时具有独特的生物学活性。
[0009] 2.制备的交联透明质酸钠凝胶是通过酰胺键将透明质酸钠分子交联成三维立体 网状结构，区别于传统DVS和BDDE交联透明质酸钠凝胶。
[0010] 3.利用DMTMM法制备交联透明质酸钠凝胶，该反应条件温和、副产物少且易于规 模化生产。
[0011] 4.利用本发明制备的交联透明质酸钠凝胶封闭体内透明质酸酶的识别位点，延长 残留时间。
[0012]
【附图说明】： 图1样品透明质酸钠酶降解率对比图。
【具体实施方式】
[0013] 现结合实施例，以赖氨酸为例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0014] 实施例一 将赖氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为4,称取lg透明质酸钠干粉，搅 拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待完 全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0015] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0016] 实施例二 将赖氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6,称取lg透明质酸钠干粉，搅 拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待完 全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0017] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0018] 实施例三 将赖氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6. 5,称取lg透明质酸钠干粉， 搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待 完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0019] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0020] 实施例四 将赖氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7,称取lg透明质酸钠干粉，搅 拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待完 全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0021] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0022] 实施例五 将赖氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7. 4,称取lg透明质酸钠干粉， 搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待 完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0023] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0024] 实施例六 将赖氨酸〇. 1828g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7. 4,称取lg透明质酸钠干粉， 搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待 完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0025] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0026] 实施例七 将赖氨酸〇. 〇731g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7. 4,称取0. 8g透明质酸钠干 粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 5534g用5mL水完全溶解后加入凝胶中， 待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0027] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到40g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0028] 实施例八 将赖氨酸〇. 〇731g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7. 4,称取0. 8g透明质酸钠干 粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMMO. 2767g用5mL水完全溶解后加入凝胶中， 待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0029] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到40g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0030] 实施例九 将赖氨酸〇. 1462g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7.4,称取0.8g透明质酸钠干 粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 5534g用5mL水完全溶解后加入凝胶中， 待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0031] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到40g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0032] 实施例十 将赖氨酸〇. 1462g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7.4,称取0.8g透明质酸钠干 粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 2767g用5mL水完全溶解后加入凝胶中， 待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0033] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到40g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0034] 实施例^-一 将赖氨酸乙酯二盐酸盐〇. 309g溶解于15mL水中，用氢氧化钠调节pH为7. 4,称取lg 透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解 后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0035] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0036] 实施例十二 将赖氨酸一盐酸盐〇. 1142g溶解于15mL水中，用等摩尔的氢氧化钠将盐酸中和后，再 用盐酸调节pH为7.4,称取lg透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0037] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0038] 实施例十三 称取lg透明质酸钠干粉，用15mL水溶解均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应3天。
[0039] 将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每lh更换透析液1次并称重，直到 凝胶质量到50g后终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，得到交联透明质酸钠凝胶。
[0040] 实施例十四 由实施例五、七、十一、十二、十三得到的样品经蒸汽灭菌，（12rC、20min)后。取凝 胶0. 32g，加入透明质酸酶液8ml (240UI);同样取对照样品0. 32g，加入透明质酸酶液8ml (240UI)，37°C水浴48h，离心取上清液测定糖醛酸含量，绘制降解曲线，并与市售瑞蓝、润 百颜产品相比较。所得产品48h的酶降率在60%以下，显著低于目前市场上的主流交联产 品。
【主权项】
1. 一种新型皮肤填充剂的制备方法，其主要特征为以透明质酸钠为原料，采用 4-(4, 6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM)作为缩合剂，选择适量的天然 氨基酸及其衍生物作为交联剂，控制透明质酸钠的起始浓度、缩合剂的加入量、反应温度、 PH值以及反应时间，反应结束后，将凝胶切成小块放入磷酸缓冲液中进行透析，然后经过制 粒和灭菌工艺得到交联透明质酸钠凝胶。2. 权利要求1所述的交联剂是指天然氨基酸及其衍生物，包括L-赖氨酸、L-赖氨酸一 盐酸盐、L-赖氨酸二盐酸盐、L-赖氨酸乙酯二盐酸盐、L-精氨酸、L-精氨酸一盐酸盐、L-精 氨酸二盐酸盐，优先选择L-赖氨酸和L-精氨酸。3. 权利要求1所述的适量交联剂时指交联剂与透明质酸钠的比例为1/10~2/l(mol/ mol )〇4. 权利要求1所述的透明质酸钠起始反应浓度为2~10% (m/m%)。5. 权利要求1所述的缩合剂加入量与透明质酸钠的比例为1/10~2/1 (mol/mol)。6. 权利要求1所述的反应的温度范围为4~50°C。7. 权利要求1所述的反应的时间范围为4~120h。
【专利摘要】本发明涉及一种新型皮肤填充剂的制备方法，该方法采用低毒的氨基酸及其衍生物作为交联剂制备交联透明质酸钠凝胶；充分发挥了DMTMM法固有的反应活性高、条件温和以及处理简便等优势，选择人体必需氨基酸中的碱性氨基酸-赖氨酸和精氨酸或衍生物作为交联剂与透明质酸钠分子的羧基端发生交联反应，继而部分封闭了体内透明质酸酶的识别位点，延缓了酶的识别和降解，最终提高了体内的残留时间，为开发安全、长效的透明质酸钠类注射美容填充剂提供了一种新的技术，具有较好的市场开发前景。
【IPC分类】C08J3/24, C08L5/08, C08K5/357, C08K5/17, C08J3/075, A61L27/60, A61L27/20, A61L27/52
【公开号】CN105713211
【申请号】CN201410715492
【发明人】魏长征, 宋瑞瑞, 奚宏伟, 蒋丽霞
【申请人】上海其胜生物制剂有限公司