用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针的制造方法与工艺

用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针本申请要求于2013年8月9日提交的美国临时申请序列No.61/864.128的优先权权益，通过引用将其全部内容并入本文。发明背景1.技术领域本发明一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。2.

背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光色素。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光色素的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。发明概述本发明涉及用于DNA扩增和检测的系统和方法。特别是，本发明提供的系统和方法极大地提高了实时核酸扩增(例如经PCR)的多重能力。在一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团(reporter)；(ii)具有已知熔链点(meltpoint)的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第一引物组扩增所述靶核酸，其中在用淬灭基团(quencher)标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一引物上报告基团的信号改变(例如信号淬灭)来检测所述靶核酸分子的存在。因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一和第二引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列，其中所述第一和第二引物组的报告基团相同，并且其中所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹；(b)用所述第一和第二引物组扩增所述靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一和第二引物组之第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一或第二引物组之第一引物上的报告基团的信号改变来检测靶核酸分子的存在；以及(d)改变所述样品的温度并确定对应于所述报告基团未淬灭时的熔链点或熔链峰(meltpeak)，来确定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或两者的存在是否导致所述报告基团的信号淬灭，由此检测所述第一和第二靶核酸分子的一个或两者的存在(例如，基于所述第一和第二引物组的发夹的可区分熔链点)。在某些方面，该实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一引物5’端的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一方面，检测所述第一引物上报告基团的信号改变还包括与扩增产物杂交，所述扩增产物包含报告基团和淬灭基团(例如暗淬灭基团(darkquencher))。在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个引物之发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二引物组之两个第一引物的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹的熔链点的温度。实施方案的某些方面涉及采用至少一个非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸为异碱基(isobase)，例如异鸟嘌呤(isoG)或异胞嘧啶(isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一个在靶特异性序列中包含至少一个非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特异性序列中的非天然核苷酸调节序列特异性退火，由此增强了核苷酸的序列特异性扩增的引物-模板杂交(参见例如PCT公开WO2011/052078，通过引用并入本文)。在另一方面，所述实施方案的方法还包括：(a)将样品与第二(或其它)引物组接触，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第二(或其它)靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二(或其它)靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用第二引物组扩增所述第二靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第二(或其它)引物组之第一引物上报告基团的信号改变，来检测所述第二(或其它)靶核酸分子的存在。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二引物组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二引物组可以包含相同报告基团，以及在一些情况下，所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹(例如熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将所述样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核酸，和(v)靶特异性序列，其与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组扩增所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸，以获得扩增产物，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组的第一引物上报告基团的信号改变，来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸的存在。在一方面，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组中各自可以包含可区分的报告基团或具有可区分熔链点的发夹。因此，在另外一些方面，根据实施方案的多重方法可以包括采用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物组，其中每个引物组包含(1)包含具有可区分熔链点的发夹的第一引物，或(2)可区分的报告基团，以使得每个不同引物组的信号可以被单独分辨。在另一些方面，根据实施方案的至少一组引物包含第二引物，所述第二引物包含至少一个报告基团标记的非天然核苷酸(例如，以提供所述引物组的第二报告基团信号)。例如，至少一组引物可包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列和至少一个报告基团标记的非天然核苷酸，其中所述引物产生的扩增子的熔链点可与所述第一引物发夹的熔链点区分开。可替换地，或者另外地，所述第二引物可以包含这样的序列，所述序列具有至少一个报告基团标记的非天然核苷酸，其中所述报告基团不同于所述第一引物的报告基团。因此，当温度改变至(1)高于所述第一引物发夹的熔链点时和(2)高于所述引物所产生的扩增子的熔链点时，这样的引物组会产生可分辨的信号改变。这样的其它信号可以进一步确认靶核酸分子的存在。由此，在另一个实施方案中提供了组合物，其包含根据实施方案的至少第一引物组。例如，引物组可包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰(其可以形成部分发夹)；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列。在某些方面，根据实施方案的引物组的第二引物包含至少一个报告基团标记的非天然核苷酸。在一些方面，所述组合物还包含淬灭基团标记的非天然核苷酸、聚合酶、参照探针、参照样品和/或游离核苷酸。在另一方面，组合物还包含第二(或其它)引物组，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第二靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第二链上的区域互补的序列。在某些方面，所述第一和第二引物组包含可区分的报告基团和/或具有可区分熔链点的发夹。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物组。在另一方面，提供了试剂盒，其包含(a)第一引物组，其包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；和(b)淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含二、三、四、五或六个不同引物组。在某些方面，所述引物组包含可区分的报告基团或具有可区分熔链点的发夹。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：将所述样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员(例如报告基团)标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列(mirroredtagsequence)；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接(T-junction)；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员(例如淬灭基团)标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物(label)的信号改变来检测所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列，例如与所述下游探针的标签序列互补。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3，4，5，6，7，8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)来检测所述第二靶核酸。例如，可以顺序检测或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同报告基团，以及在一些情况下，所述第一和第二引物组形成具有可区分熔链点的发夹(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，每组探针包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变，来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接至所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号改变可以为荧光信号的降低。在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或者改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或降低至低于)样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当两个或更多个探针组存在的情况下，改变样品的温度可以包括将样品的温度从低于第一和第二探针两者之发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。因此，在另一个实施方案中，提供包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一探针组接触，所述第一探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，从而形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补(例如与所述下游探针的标签序列互补)的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列并至少包含第一未标记的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同报告基团，在一些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其至少包含第一报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上镜像标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二探针两者的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。因此，另一个实施方案提供了组合物，其包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。在另一个实施方案中，提供试剂盒，其包含：(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；和(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)经报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补(例如与所述下游探针的标签序列互补)的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在另一个实施方案中提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)将所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同的报告基团，在一些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，每组探针包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二探针两者的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹的熔链点的温度。因此，另一个实施方案提供了包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以产生扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与探针接触，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，所述探针还包含(iii)位于所述标签序列和与所述靶核酸第一链上之第一区域互补的序列之间的聚合酶延伸阻断修饰。因此，在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)将所述样品与至少第二引物组接触，所述第二引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第二靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以生成扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与第二探针接触，所述第二探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针之发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，在某些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)。在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组接触，所述引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以产生扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针接触，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接至所述探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号改变可以为荧光信号的降低。在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或者改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或降低至低于)样品中一个或多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个探针组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品的温度从低于第一和第二探针两者发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。因此，在另一个实施方案中，提供了包含第一引物的组合物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；和探针，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列。在另一方面，组合物还包含第二(或其它)引物组和探针，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第二靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第一链上的区域互补的序列；和第二探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列。在某些方面，所述第一和第二(或其它)探针包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一引物组，其包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)探针，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和(c)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些方面，所述探针包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测至少第一靶核酸之存在的方法，其包括：(a)将样品与第一靶特异性引物-探针组接触，所述引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，而另一个标记有淬灭基团；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；(f)通过检测所述第一或第二测定探针上报告基团信号的改变(例如未淬灭)来至少检测第一靶核酸。在某些方面，检测报告基团的信号改变包括检测对应于测定探针的熔链峰的减少或消除，这指示了所述第二测定探针被切割，并指示了所述靶核酸的存在。在另一些方面，所述引物-探针组之组分(i)-(iv)的一个或更多个分别与样品接触。例如，可以在所述靶特异性引物和/或探针之后添加所述第一或第二测定探针。在某些方面，所述报告基团可以为荧光团，信号改变可以为荧光信号的未淬灭。在一些方面，所述第一和/或第二测定探针至少包含第一非天然核苷酸，例如isoG和/或isoC。在某些方面，所述第一测定探针的第二区域包含2至5个非天然核苷酸，而所述第二测定探针包含与所述第一测定探针的2至5个非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸。在另一些方面，所述第一测定探针的至少第一非天然核苷酸标记有报告基团，所述第二测定探针的至少第一非天然核苷酸标记有淬灭基团(或反之)。在一些优选方面，所述第一测定探针的每个非天然核苷酸标记有报告基团，所述第二测定探针的每个非天然核苷酸标记有淬灭基团(或反之)。在某些方面，所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且检测报告基团的信号改变包括样品温度改变时检测报告基团的信号改变。在某些方面，样品的温度可以提高至高于(或降低至低于)所述第一和第二测定探针的熔链点，以观察报告基团的信号改变。在另一方面，所述第一靶特异性探针包含与所述靶核酸第一链上的第二区域互补的序列，其长度为5、10、15、20、25、30至40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一方面，所述5’标签序列的长度为6至50个核苷酸。在另一些方面，根据实施方案的靶特异性引物-探针组之第一测定探针的第二区域包含聚合酶延伸-阻断修饰。因此，当延伸所述靶特异性探针的标签序列时，第二测定探针只有一部分被切割，这导致了所述第一和第二测定探针之间的熔链点发生改变。所观察到的熔链点或熔链峰的这种改变可以用于检测靶核酸分子的存在。因此，在一些方面，至少检测第一靶核酸序列包括检测样品温度改变时报告基团(第一或第二测定探针上)的信号改变。在一个特定方面，实施方案的方法包括检测第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括(a)将样品与至少第一和第二靶特异性引物-探针组接触，每个引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，而另一个标记有淬灭基团；并且其中所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，其中所述第一引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点区分开；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述引物-探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；(f)通过检测所述第一和/或第二引物-探针组的第一或第二测定探针上报告基团的信号未淬灭来检测靶核酸；以及(g)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物-探针组、第二靶特异性引物-探针组或两者的第二测定探针是否被切割，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的减少或消除指示了所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，在一些方面，顺序或基本同时检测所述第一和第二(或其它)靶核酸的存在。在另一方面，所述第一引物-探针组的报告基团与所述第二引物-探针组的报告基团相同。在某些方面，所述第一5’标签和第一抗标签报告基团探针(anti-tagreporterprobe)的熔链点可与所述第二5’标签和第二抗标签报告基团探针的熔链点区分开。因此，在一些方面，实施方案的方法是多重方法，其包括采用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个或更多个引物-探针组，以检测靶核酸分子，其中每个引物-探针组包含(1)可区分的报告基团或(2)具有可区分熔链点的第一和第二测定探针。在另一些方面，所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5个非天然核苷酸)，所述第二测定探针至少包含与至少所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸(例如与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸)。在某些方面，实施方案的第一测定探针包含聚合酶延伸阻断序列，例如一个或更多个非天然核苷酸位置。因此，在某些方面，提供了用于检测第一和第二靶核酸的一个或两者之存在的方法，其包括(a)将样品与至少第一和第二靶特异性引物-探针组接触，每个引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域，所述第二区域包含聚合酶延伸-阻断修饰；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，所述第二区域包含延伸-阻断修饰，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述引物-探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针将杂交的标签序列延伸至延伸阻断序列，从而将与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针的一部分切割，其中在所述切割之后，所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且其中在所述切割之后，所述第一引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物-探针的第一和第二测定探针的熔链点区分开；(f)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物-探针组、第二靶特异性引物-探针组或两者的第二测定探针是否被切割，由此检测靶核酸，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的温度迁移(shift)指示了所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，将第二测定探针的一部分(与所述延伸阻断序列互补的5’序列)切割之后，实现了所述测定探针的可区分熔链点。在一些方面，在切割所述第二测定探针(的一部分)之后，所述第一靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点与所述第二靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点相差2℃至10℃。在另一些方面，在切割所述第二测定探针之前，所述第一靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点与所述第二靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点相同。例如，除了聚合酶延伸-阻断修饰的位置之外，所述第一和第二靶特异性引物-探针组的第一测定探针的第二区域可以相同。在另一些方面，所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5个非天然核苷酸)，所述第二测定探针至少包含至少与所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸(例如与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸)。在另一方面，所述方法还包括将样品与靶特异性引物接触，所述靶特异性引物与靶核酸第二链上的区域互补。在一些方面，方法还可包括进行多重聚合酶链式反应循环。在一些方面，检测报告基团的信号改变包括在进行多重聚合酶链式反应循环之前、期间、或之后(或循环期间)检测信号。在另一方面，检测报告基团的信号改变包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测信号。在该方面，所述方法还包括将所检测到的报告基团之信号与预定比相比较，所述预定比为所述报告基团的信号和非杂交探针上报告基团的参照信号的比。在一些方面，实施方案的方法还包括对所述样品中靶核酸的量进行定量。例如，对所述样品中靶核酸的量进行定量包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；或者通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的一个或多个引物-探针组的组合物。例如，组合物可以包含(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一测定探针或第二测定探针标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团。在另一些方面，所述第一测定探针包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域，所述第二区域至少包含第一非天然核苷酸；并且第二测定探针(iv)包含与所述第一测定探针的第二区域互补的序列，和至少与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸，其中所述第一测定探针的非天然核苷酸或所述第二测定探针的非天然核苷酸标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团。在某些方面，所述组合物还包含能够与所述测定探针的非天然核苷酸碱基配对的(未标记的)非天然核苷酸。在另一些方面，实施方案的测定探针包含2至5个非天然核苷酸。在一些方面，组合物还包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的靶特异性引物、具有核酸外切酶活性的聚合酶、参照探针、参照样品和/或游离核苷酸。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的引物-探针组。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含实施方案的一个或更多个引物-探针组。在另一方面，所述试剂盒还包含具有核酸外切酶活性的聚合酶、参照探针、游离核苷酸、游离非天然核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含具有报告基团的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基的3’序列(例如与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列)。在一些方面，所述上游探针的3’序列定义为与所述下游探针的标签序列具有互补序列，小于所述标签序列的全长。在某些方面，然而，在靶序列不存在下，所述上游和下游探针基本没有特异性杂交。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于55、50、45、40或35℃。在所述方法的另一方面，延伸所述上游探针包括合成与所述下游探针的标签序列互补的3’延伸，其包含淬灭基团标记的非天然核苷酸。在本文中，T-连接是指当与靶序列杂交时上游和下游探针形成的结构。特别是，所述上游和下游探针基本与所述靶核酸的相邻序列杂交，以使得所述下游探针的5’标签游离，并且不与靶标碱基配对。在一些方面，然而，所述下游探针的5’标签与所述上游探针的3’部分碱基配对(参见例如图4A，中间图)。在一些方面，下游探针(和/或上游探针)可以连接固体支持物，例如珠(例如编码的珠)或表面。在一方面，下游探针的5’非天然核苷酸为isoG(或isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。因此，在一些方面，延伸所述上游探针包括合成与所述下游探针的标签序列互补的3’延伸，其包含所述淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一些方面，检测所述下游探针上报告基团的信号改变还包括将延伸的上游探针和下游探针杂交。如本文进一步详述的，在某些方面，所述报告基团为荧光团，检测报告基团的信号改变包括检测荧光信号的降低。在某些方面，检测报告基团的信号改变包括样品温度改变时检测报告基团的信号改变。例如，检测报告基团的信号改变包括当样品的温度提高至高于(或降低至低于)延伸的上游探针和下游探针的熔链点时，检测报告基团的信号改变。在另一方面，方法包括：(a)将样品与第二探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。在某些方面，所述第一和第二探针组包含相同报告基团或可区分的报告基团。在另一些方面，第一和第二探针组包括在所述上游和下游探针之间可区分的熔链点。在另一方面，实施方案的方法为多重方法，其包括：(a)将样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，每组探针包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含报告基团的5’非天然核苷酸；(ii)标签序列和(iii)与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。优选地，所述第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针组各自包括在所述上游探针和下游探针之间...