用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针的制造方法与工艺

技术特征：
1.用于检测靶核酸存在的体外方法，其包括：(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述靶核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基的3’序列。3.如权利要求2所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列。4.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列。5.如权利要求4所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基的3’序列。6.如权利要求1所述的方法，其中在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游探针和所述下游探针的熔链点低于55℃。7.如权利要求1所述的方法，其中所述报告基团-淬灭基团对的第一成员为报告基团。8.如权利要求7所述的方法，其中所述报告基团为荧光团。9.如权利要求8所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括检测荧光信号的改变。10.如权利要求1所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品温度改变时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。11.如权利要求10所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品的温度升高至高于发夹探针的熔链点时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。12.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针连接固体支持物。13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或淬灭基团标记的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。14.如权利要求1所述的方法，其还包括：(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含第二上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接；(b)延伸所述第二上游探针以合成与所述第二下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成第二延伸的上游探针；(c)使所述第二延伸的上游探针与其自身杂交以形成第二发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述第二发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述第二上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述第二发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第二靶核酸。15.如权利要求14所述的方法，其还包括：(a)将所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，每组探针包含第三、第四、第五或第六上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第三、第四、第五或第六下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第三、第四、第五或第六上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第三、第四、第五或第六上游探针包含与所述第三、第四、第五或第六下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述第三、第四、第五或第六靶核酸杂交时，所述第三、第四、第五或第六探针组形成T-连接；(b)延伸所述第三、第四、第五或第六上游探针以合成与所述第三、第四、第五或第六下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成第三、第四、第五或第六延伸的上游探针；(c)使所述第三、第四、第五或第六延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述第三、第四、第五或第六发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述第三、第四、第五或第六上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述第三、第四、第五或第六发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。16.如权利要求14所述的方法，其中基本同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。17.如权利要求14所述的方法，其中顺序检测所述第一和第二靶核酸的存在。18.如权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物。19.如权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含相同的标记物。20.如权利要求19所述的方法，其中由所述第一和第二探针组形成的所述发夹探针包括可区分的熔链点。21.如权利要求15所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探针组形成的所述发夹探针各自包括可区分的标记物或可区分的熔链点。22.如权利要求1所述的方法，其还包括进行多重聚合酶链式反应循环。23.如权利要求22所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括在进行多重聚合酶链式反应循环之前和之后检测所述报告基团的信号。24.如权利要求22所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测所述报告基团的信号。25.如权利要求24所述的方法，其还包括将所检测到的标记物之信号与非杂交探针上标记物的参照信号相比较。26.如权利要求22所述的方法，其还包括对样品中靶核酸的量进行定量。27.如权利要求26所述的方法，其中对所述样品中靶核酸的量进行定量包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；或者通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。28.包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。29.如权利要求28所述的组合物，其还包含第二探针组，所述第二探针组包含第二上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接。30.如权利要求29所述的组合物，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。31.如权利要求29所述的组合物，其包含至少四组探针。32.如权利要求28所述的组合物，其还包含用报告基团标记的或者用淬灭基团标记的非天然核苷酸。33.如权利要求28所述的组合物，其还包含聚合酶、参照探针或游离核苷酸。34.试剂盒，其包含：(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及(b)用报告基团标记的或者用淬灭基团标记的非天然核苷酸。35.如权利要求34所述的试剂盒，其包含至少四组探针。36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。37.如权利要求34所述的试剂盒，其还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明。38.用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述...