一种海洋真菌中新天然产物的制备工艺及其降脂用途的制作方法

本发明属于药学领域，揭示了两个新颖tetramic acid类生物碱的制备方法及具降脂用途。

背景技术：

高血脂症是代谢综合症疾病中的一种，因其能够导致动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病，并呈现发病率逐年升高，人口年轻化趋势。降血脂药物已成为新药研究的重点方向之一。目前临床经常使用的降血脂药物主要有他汀类、贝特类、烟酸类，以及胆酸螯合剂类等。虽然具有较好的治疗效果，但也存在一定的不良反应。如他汀类大剂量服用后会产生肌肉毒性并升高肝转氨酶，贝特类及盐酸类药物会引起胃肠道不适、肝肾损伤等。随着现代生活节奏的不断加快、生活压力的不断加大，饮食结构的不合理现象增多，以及食品安全卫生等问题的日益严峻，高血脂症疾病的发病几率呈现逐年递增的趋势，因此研制高效、低毒的全新靶点降脂新药具有重要的社会意义。

专利发明者通过前期研究，从一株海洋真菌Eurotium intermedium中发现了两个化学结构新颖的tetramic acid类生物碱，并通过体外药理活性筛选，首次发现该类生物碱具有显著降脂活性，具有进一步开发成新型降脂药物的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供两个新颖结构的teramic acid类生物碱。

本发明的另一目的在于提供该类生物碱的制备方法。

本发明的另一目的在于揭示该类生物碱的降脂用途。

在本发明的第一方面提供式I和式II所示化合物，其药学上可接受的盐或它们的混合物的用途，用于制备药物，所述药物用于预防或治疗高血脂症疾病。

本发明的第二方面提供上述生物碱的制备方法，包括如下步骤：

1)以海洋来源Eurotium intermedium为菌种，利用液体或固体发酵培养，获得含上述生物碱的发酵物；

2)将发酵物萃取，萃取物用硅胶、凝胶、ODS等色谱手段分离与纯化，在同一发酵物中制备上述生物碱。

本发明中各生物碱的降脂活性通过以下药学实验得到证明：

1)使用人肝癌细胞，建立脂质堆积细胞模型，评价发明中各生物碱的降脂活性。

2)使用人肝癌细胞，建立脂质堆积细胞模型，评价发明中各生物碱对细胞内胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)合成的抑制作用。

附图说明

图1：式I和式II化合物对胆固醇(TC)的影响

图2：式I和式II化合物对甘油三酯(TG)的影响

图3：油红O染色实验

图4：式I化合物的¹H NMR谱

图5：式I化合物的APT谱

图6：式I化合物的高分辨质谱

图7：式II化合物的¹H NMR谱

图8：式II化合物的APT谱

图9：式II化合物的高分辨质谱

具体实施方案：

本发明所公开的技术内容，是为了让本领域技术人员更好的理解本发明的实质，下述实施方案仅作示例。

实例1：式I和式II化合物的制备

利用固体培养基对菌株Eurotium intermedium进行发酵，固体培养基的制备方法为：将100mL人工海水与100g大米加入500mL三角瓶中，静置12h，后于121℃高压湿热灭菌30min，放凉待用。菌株发酵方法为：在PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂)培养皿上挑取长有新鲜E.intermedium的琼脂片(1～2cm²)，接种于大米培养基上，培养30瓶，25℃下避光恒温培养25d，得到发酵产物。

发酵产物捣碎后用乙酸乙酯超声萃取3次，每次1.5h，减压浓缩得粗浸膏(51.4g)。浸膏用等比例硅胶(160～200目)扮样，利用减压硅胶柱色谱以石油醚/丙酮为流动相梯度洗脱。以石油醚/丙酮(20∶1，v/v)洗脱三个柱体积，后用石油醚/丙酮(10∶1，v/v)洗脱，得到白色粉末(5.2g)。取五分之一(约1g)该白色粉末，溶于2mL甲醇，利用半制备高效液相色谱以74％乙腈/水(v/v)为流动相洗脱纯化，得到式I化合物(6.4mg)，式II化合物(10.6mg)。

实例2：式I和式II化合物的降脂活性实验：

试验材料：式I和式II化合物，油酸，油红O，试剂盒(总胆固醇TC、总甘油三酯TG)

细胞株：人肝癌细胞株HepG2

试验方法：

发明中化合物的脂质调节作用

取对数生长期细胞，消化、计数，以适宜浓度接种到已放入无菌盖玻片的6孔板中，培养24h小时至细胞完全贴壁。细胞生长汇合至70％-80％时，用100μM不饱和脂肪酸-油酸(OA)刺激细胞制成脂质堆积模型；给药组同时给予不同浓度的式I和式II化合物(1μmol/L)；阳性药组给予辛伐他汀(1μmol/L)。24h后，弃去培养基，用PBS洗2遍，加4％多聚甲醛在4℃固定12h。每孔加油红O工作液20μL室温染色15min，PBS洗净油红工作液，每孔加DMSO 150μL微升溶解附着脂质上染料， 酶标仪358nm波长下测定OD值。

发明中化合物对脂质堆积模型细胞内TC、TG含量的影响

1)细胞培养

细胞分为空白组、模型组、给药组式I和式II化合物(1μmol/L)、阳性药组辛伐他汀(1μmol/L)，除空白组外，其它组需添加油酸100mmol/L共孵育24小时.。

2)细胞内TC测量

弃去培养液，用PBS洗2遍，收集细胞于管中；加200μL氯仿∶异丙醇∶NP40(7∶11∶0.1)，超声裂解细胞；13000r/min离心15min，取上清于新管中50℃烘1h，以除去氯仿；将样品放于真空浓缩离心机中抽干，除去剩余有机溶剂。试剂盒测定样品中TC含量，样品加200μL Assay Buffer溶解，具体操作见Cholesterol/Cholesteryl Ester Quantitation Kit(BioVision)说明书。BCA试剂盒测定样品中蛋白含量。

3)细胞内TG含量测定

收集细胞(约107个)，加300μL 5％NP-40超声破碎细胞；将样品放到80-100℃水浴中缓慢加热2～5min至样品变浑浊，冷却至室温，重复3次。于12000r/min离心2min，取上清于新管中，加适量去离子水稀释样品。试剂盒测定样品中TG含量，具体操作按Triglyceride Quantification Kit(BioVision)说明书进行。BCA试剂盒测定样品蛋白含量。

实验结果：用不饱和脂肪酸建立脂质堆积模型对式I和式II化合物降脂活性进行了研究，以辛伐他汀为阳性对照药，结果发现式I和式II化合物具有较好的降脂活性，对细胞内的总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG)均具有明显降低作用(见附图1-3，其中数值平均值±标准差表示，***P＜0.001，脂质堆积模型组vs正常对照组；+P＜0.05，++P＜0.01，+++P＜0.001，给药组vs脂质堆积模型组)。