本发明涉及微生物发酵工程技术领域，更具体的说，涉及一种粪肠球菌的培养方法。
背景技术：
近年来，抗生素作为饲用添加剂的副作用已引起人们的广泛关注，很多国家和地区都已限制了抗生素在饲料中的直接添加，因此寻找一种绿色、安全的饲料添加剂尤为重要。研究表明，粪肠球菌作为一种无毒副作用的饲料添加剂具有以下一些功能：1)粪肠球菌由于繁殖速度快，能够很快的定植于动物胃肠上皮细胞上，达到抑制病原菌的目的；2)粪肠球菌能够发酵糖类代谢生成乳酸和乙酸(audisio，2001)，迅速降低动物肠道中ph，也可抑制病原菌的繁殖；3)粪肠球菌可以作为一种非特异性的免疫调节因子，提高动物肠道的免疫力，同时还能够增加动物血液中免疫细胞的数量。
由于粪肠球菌具有以上一些优良的特性，吸引了国内外很多的研究者进行研究，大多集中在粪肠球菌菌株的筛选(孙卫.优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用:，cn101275158[p].2008.)、粪肠球菌液体发酵工艺研究(杜志琳，李雪平，尹望.一株粪肠球菌发酵罐发酵条件的研究[j].饲料研究，2015，(19):23-26.)、粪肠球菌固体发酵工艺研究(黄明媛.乳酸粪肠球菌固态发酵的初步研究[j].饲料研究，2013，(11).)等方面，对于饲用粪肠球菌液固两相发酵的具体工艺报道较少。
例如，cn102286417a号专利公开了一种高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺，用高密度固体发酵培养工艺，以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和活性炭作固态培养基料，于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；将固态发酵培养基灭菌后，接种粪肠球菌种液， 经培养，干燥，粉碎制得高密度粪肠球菌产品；所述的营养液培养基各质量组分组成为:葡萄糖5～20.0，蛋白胨1～10.0，牛肉膏1～5.0，酵母膏1～5.0，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.2，磷酸氢二钾:0.5～3.0，去离子水1000，ph6.0～7.5。该专利中，使用液固两相发酵法主要是通过液体发酵来获取大量的种子液，然后再接种到固体培养基中进行发酵。这种工艺能有效的降低液体发酵在接种过程中的染菌风险，同时也改进了传统固体发酵的接种方式，能够缩短种子制备时间，同时还能够发挥固体发酵的优势，解决了高耗能、后处理困难等问题。但是，液体菌种直接接种至固态发酵培养基会出现不适应的现象，导致培养初期菌体增长缓慢、杂菌滋生，另外，一般的固态发酵培养基很难满足粪肠球菌快速增殖过程中的营养需求，向固态培养基中流加液态营养液又会出现不均匀等问题，进而影响饲用粪肠球菌的品质。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种粪肠球菌的培养方法，解决现有液固两相发酵法在发酵初期不适应、菌体增长缓慢、培养时间长、染菌风险高等问题。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种粪肠球菌的培养方法，解决目前市场上的饲用粪肠球菌存在货架期较短、有效活菌数不高的问题。
本发明解决上述技术问题的方案在于：提供一种粪肠球菌的培养方法，包括如下步骤：
s100、种子液制备：将粪肠球菌的菌种接种至种子培养基，经过扩大培养获得种子液；
s200、配制固体培养基：麸皮50～60份，水40～50份，葡萄糖0.5～1份、磷酸二氢钾0.2～0.5份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，生石灰0.1～0.2份；其中，所述固体培养基包括的各组分以质量比计，灭菌后待用；
s300、大料固体发酵：称取固体培养基投料量1.0～2.0％的硫酸铵、0.5～1.0％的尿素、0.5～1.5％的复合酶制剂，与所述种子液混合后接种至固体培养基，搅拌均匀得到大料固体，30～35℃发酵培养20～30h。
在本发明提供的粪肠球菌的培养方法中，所述步骤s100中使用的所述种子培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖8.0～10.0g/l，蛋白胨8.0～12.0g/l，酵母浸出物10.0～15.0g/l，磷酸二氢钾0.5～1.0g/l，磷酸氢二钾0.3～0.8g/l，硫酸锰0.1～0.3g/l，余量为水。
在本发明提供的粪肠球菌的培养方法中，所述步骤s100之前还包括如下步骤：
s001、菌种活化及复壮：将保存的粪肠球菌冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-7时，在装有活化培养基的平板中进行划线分离进行培养挑取单菌落，再次进行划线分离培养，得到单菌落；
s002、斜面菌种制备：将所述单菌落接种至装有活化培养基的试管斜面中，30～35℃培养至少20h，制得斜面菌种。
在本发明提供的粪肠球菌的培养方法中，所述斜面菌种作为所述步骤s100中粪肠球菌的菌种；所述活化培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖5.0～8.0g/l，蛋白胨6.0～10.0g/l，酵母浸出物9.0～12.0g/l，磷酸二氢钾0.4～0.6g/l，磷酸氢二钾0.2～0.5g/l，硫酸锰0.1～0.2g/l，琼脂粉12～15g/l，余量为水。
在本发明提供的粪肠球菌的培养方法中，所述步骤s300中，称取的硫酸铵、尿素溶于水后煮沸，冷却待用；称取的复合酶制剂先置于35～40℃的无菌水中活化1～2h，每1g所述复合酶制剂包括蛋白酶1000～1500u、淀粉酶1000～2000u。u指每克消化酶中所含的单酶的活性，具体定义如下：
蛋白酶(u)：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在30℃、ph7.5的条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位(u)。
淀粉酶(u)：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃、ph7.5的条件下，1min水解淀粉产生1μmol葡萄糖，即为1个酶活力单位(u)。
在本发明提供的粪肠球菌的培养方法中，所述步骤s300中，所述大料固体浅盘装样，装样厚度为2～3cm，疏松均匀；发酵过程中需要对浅盘中的大料固体进行翻料2～3次。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明通过优化粪肠球菌的培养基， 使得液体种子快速适应固体培养环境，另外，固体培养基中添加合适种类的氮源和复合酶制剂，不用额外添加营养成分也可以满足发酵的营养需求；本发明粪肠球菌的培养方法发酵周期短，制得的饲用粪肠球菌有效活菌数高、杂菌率低、产品货架期长、生产成本低，应用前景巨大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。附图中：
图1为本发明粪肠球菌的培养方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
现有的液固两相发酵工艺，由于发酵适应期的存在，液体菌种不适应固体培养基会导致的菌体增长缓慢、培养时间长、染菌风险高等问题。本发明的主要创新点在于，在优化后的培养基中添加合适种类的氮源和复合酶制剂，简单的培养基组成即可满足粪肠球菌的营养需求而不用额外添加营养成分，产品生产成本低、产品的耐受性较强，同时还能够发挥固体发酵的优势，解决了高耗能、后处理困难等问题。
图1示出了本发明粪肠球菌的培养方法较佳实施例的流程，如图1所示，该培养方法包括如下步骤：
s100、种子液制备：将粪肠球菌的菌种接种至种子培养基，经过扩大培养获得种子液；本发明使用的种子培养基配方简单，特别是减少了无机氮源的添加，有机氮源含量也较低，制得的种子液抗逆性强，缩短种子液接种至固体培养基的适应期；
s200、配制固体培养基：麸皮50～60份，水40～50份，葡萄糖0.5～1份、磷酸二氢钾0.2～0.5份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，生石灰0.1～0.2份；其中，固体培养基包括的各组分以质量比计，灭菌后待用；麸皮作为固体培 养基最核心的营养物质，在复合酶制剂的作用下会分解为容易被粪肠球菌利用的小分析多肽、寡糖，满足粪肠球菌快速增殖过程的需要；另外，固体培养基的灭菌过程时间较长，利用高温蒸汽的作用软化、爆破麸皮，便于复合酶制剂的酶解作用；
s300、大料固体发酵：称取固体培养基投料量1.0～2.0％的硫酸铵、0.5～1.0％的尿素、0.5～1.5％的复合酶制剂，与种子液混合后接种至固体培养基，搅拌均匀得到大料固体，种子液的接种量为8～12％(v/m)，即每吨固体培养基接种种子液80～120l，30～35℃发酵培养20～30h；由于发酵过程中无需流加额外的营养液，浅盘装样发酵，发酵过程简单易操作，不会出现不同区域菌体生长不均匀的状况，且发酵时间大大缩短，成品的杂菌率低于0.5％，有效活菌数可达300～500亿/克。
实施例1
1)菌种活化及复壮
将保存的粪肠球菌冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-7时，在装有固体的活化培养基的平板中进行划线分离进行培养挑取单菌落，再次进行划线分离培养，得到单菌落。
其中，活化培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖5.0g/l，蛋白胨6.0g/l，酵母浸出物12.0g/l，磷酸二氢钾0.4g/l，磷酸氢二钾0.2g/l，硫酸锰0.1g/l，琼脂粉12g/l，余量为水。加热融化后分装于平板或试管，于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，取出冷却待用。
2)斜面菌种制备
将单菌落接种至装有固体的活化培养基的试管斜面中，30℃培养至少20h，制得斜面菌种。
3)种子液制备
将粪肠球菌的斜面菌种接种至种子培养基，经过扩大培养获得种子液。
其中，种子培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖8.0g/l，蛋白胨8.0g/l，酵母浸出物15.0g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸锰0.1g/l，余量为水。于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，冷却待用。
4)配制固体培养基
固体培养基包括如下质量比的组分：麸皮50份，水40份，葡萄糖0.5份、磷酸二氢钾0.2份，磷酸氢二钾0.1份，生石灰0.1份。于121℃、0.1mpa条件下灭菌1h，冷却待用。
5)大料固体发酵
称取固体培养基投料量1.0％的硫酸铵、0.5％的尿素、0.5％的复合酶制剂，硫酸铵、尿素溶于水后煮沸，冷却待用；称取的复合酶制剂先置于35℃的无菌水中活化2h，与种子液混合后接种至固体培养基，种子液的接种量为8％(v/m)，搅拌均匀得到大料固体，浅盘装样厚度为3cm，疏松均匀；发酵过程中需要对浅盘中的大料固体进行翻料2次，30℃发酵培养30h。结束发酵，出料烘干粉碎制得成品，杂菌率低于0.5％，有效活菌数可达350亿/克。
实施例2
1)菌种活化及复壮
将保存的粪肠球菌冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-7时，在装有固体的活化培养基的平板中进行划线分离进行培养挑取单菌落，再次进行划线分离培养，得到单菌落。
其中，活化培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖8.0g/l，蛋白胨10.0g/l，酵母浸出物9.0g/l，磷酸二氢钾0.6g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸锰0.2g/l，琼脂粉15g/l，余量为水。加热融化后分装于平板或试管，于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，取出冷却待用。
2)斜面菌种制备
将单菌落接种至装有固体的活化培养基的试管斜面中，35℃培养至少20h，制得斜面菌种。
3)种子液制备
将粪肠球菌的斜面菌种接种至种子培养基，经过扩大培养获得种子液。
其中，种子培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖10.0g/l，蛋白胨12.0g/l，酵母浸出物10.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，磷酸氢二钾0.8g/l，硫酸 锰0.3g/l，余量为水。于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，冷却待用。
4)配制固体培养基
固体培养基包括如下质量比的组分：麸皮60份，水50份，葡萄糖1份、磷酸二氢钾0.5份，磷酸氢二钾0.2份，生石灰0.2份。于121℃、0.1mpa条件下灭菌1.5h，冷却待用。
5)大料固体发酵
称取固体培养基投料量2.0％的硫酸铵、1.0％的尿素、1.5％的复合酶制剂，硫酸铵、尿素溶于水后煮沸，冷却待用；称取的复合酶制剂先置于40℃的无菌水中活化1h，与种子液混合后接种至固体培养基，种子液的接种量为12％(v/m)，搅拌均匀得到大料固体，浅盘装样厚度为2cm，疏松均匀；发酵过程中需要对浅盘中的大料固体进行翻料3次，35℃发酵培养20h。结束发酵，出料烘干粉碎制得成品，杂菌率低于0.5％，有效活菌数可达400亿/克。
实施例3
1)菌种活化及复壮
将保存的粪肠球菌冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-7时，在装有固体的活化培养基的平板中进行划线分离进行培养挑取单菌落，再次进行划线分离培养，得到单菌落。
其中，活化培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖7.0g/l，蛋白胨8.0g/l，酵母浸出物10.0g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.25g/l，硫酸锰0.15g/l，琼脂粉13g/l，余量为水。加热融化后分装于平板或试管，于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，取出冷却待用。
2)斜面菌种制备
将单菌落接种至装有固体的活化培养基的试管斜面中，33℃培养至少20h，制得斜面菌种。
3)种子液制备
将粪肠球菌的斜面菌种接种至种子培养基，经过扩大培养获得种子液。
其中，种子培养基包括如下质量分数的组分：葡萄糖9.0g/l，蛋白胨 10.0g/l，酵母浸出物12.0g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，磷酸氢二钾0.4g/l，硫酸锰0.2g/l，余量为水。于121℃、0.1mpa条件下灭菌20min，冷却待用。
4)配制固体培养基
固体培养基包括如下质量比的组分：麸皮55份，水45份，葡萄糖0.8份、磷酸二氢钾0.4份，磷酸氢二钾0.2份，生石灰0.15份。于121℃、0.1mpa条件下灭菌1.5h，冷却待用。
5)大料固体发酵
称取固体培养基投料量1.5％的硫酸铵、0.8％的尿素、1.0％的复合酶制剂，硫酸铵、尿素溶于水后煮沸，冷却待用；称取的复合酶制剂先置于37℃的无菌水中活化1h，与种子液混合后接种至固体培养基，种子液的接种量为10％(v/m)，搅拌均匀得到大料固体，浅盘装样厚度为2cm，疏松均匀；发酵过程中需要对浅盘中的大料固体进行翻料3次，33℃发酵培养24h。结束发酵，出料烘干粉碎制得成品，杂菌率低于0.5％，有效活菌数可达500亿/克。
显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。