基于乙型肝炎核心抗原的疫苗的制作方法
本发明涉及包含具有连接至e1环的糖的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白、生产连接有糖的蛋白的方法、含有所述蛋白的药物组合物和所述蛋白在对象中诱导免疫响应的用途。
背景技术：
乙型肝炎（Hepatitis B）病毒核心（HBc）蛋白具有某种程度上的独特结构，它由两个反平行的α螺旋组成，其形成特有的“穗（spike）”结构。然后两个HBc分子自发地二聚化形成双穗束。该双穗束是病毒样颗粒（VLP）的构成部件。VLP是具有吸引力的疫苗系统，因为它们的高度重复序列递送抗原的多个拷贝。进一步地，病毒核酸的缺乏使得它们成为特别安全的载体。HBc作为疫苗载体是特别有趣的，因为它具有几个可能让抗原序列插入的位点。然后HBc的极端免疫原性也赋予被插入的序列，因此使得其也具有过度的免疫原性。最佳的插入位点是主要插入区域（MIR）。然而，先前表明，当较大的或疏水性的序列被插入MIR时，则单体的HBc不能二聚化且VLP没有形成。这导致免疫原性的大量损失。
目前没有可用于细菌生物威胁因子类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）和鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）的许可疫苗，它们分别为类鼻疽和鼻疽的致病因子。
发明概述
本发明涉及一种基于乙型肝炎（HBV）核心蛋白的疫苗递送系统。在递送之前，糖被连接至HBV核心蛋白，使得能够引起对糖类的免疫响应。
因此本发明提供一种包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白，其具有被连接至e1环（e1 loop）的糖。所述蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的一个或两个拷贝具有被连接至e1环的糖。
本发明还提供：
- 一种包含本发明的蛋白的多个拷贝的颗粒；
- 一种生产本发明的蛋白的方法，所述方法包括将一个或多个糖连接至e1环；
- 一种药物组合物，其包含本发明的蛋白或本发明的颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂；
- 用于在人体或动物体的疫苗接种方法中使用的本发明的蛋白或本发明的颗粒；
- 本发明的蛋白或本发明的颗粒用于制备用于人体或动物体的疫苗接种的药物的应用；以及
- 一种在对象中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述对象施用本发明的蛋白或本发明的颗粒。
附图说明
图1：SDS-PAGE证实了串联核心在酵母裂解物的可溶性级分中被发现。提取粗裂解物（泳道3），在20,000xg下旋降（spun），提取上清液（泳道4）。颗粒（泳道5）中的任何物质都不可用。上清液被稀释（泳道6），然后通过0.8 µm、0.45 µm和0.2 µm的三个过滤器（泳道7-9）。材料通过横流过滤器并保留滞留物（泳道10）。将其过滤，然后置于CL4B柱（泳道11）上。然后将空隙体积通过S1000柱（12泳道）。
图2：从CL4B柱的空隙体积中分离VLP（（B）的左侧面板上的较大的峰）。泳道上方的数字是从CL4B柱收集的级分编号。
图3：然后将CL4B空隙通过S1000柱，从级分12-15分离VLP。通过SDS-PAGE和免疫印迹（western blot）确认纯度。数字是从第二S1000柱收集的串联核心阳性级分。
图4：（A）使用银染色的SDS-PAGE证实，存在串联核心（标有*），但纯度低于同等的酵母制剂。（B）电子显微镜将主要污染物识别为杆状病毒病毒粒子本身。
图5：泳道A：分子量标记物，泳道B：未修饰的VLP，泳道C：修饰的VLP。
图6：（A）蔗糖垫的示意图（未按比例）、（B）未结合的FITC和（C）FITC-VLP结合物。
图7：泳道A：分子量标记物，泳道B：BSA（2 mg/ml），泳道C：BSA（0.5 mg/ml），泳道D：糖结合物（2 mg/ml）和泳道E：糖结合物（0.5 mg/ml）。
图8：携带LolC插入物的VLP在ELISA中被测试，其使用感染了野生型伯克霍尔德氏菌的小鼠中产生的抗体。对应于VLP LolC的线对30 ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之间。对应于空载VLP的线对30 ug/ml的值位于0.4平均OD附近。
序列简述
SEQ ID NO: 1是ayw亚型的183个氨基酸的蛋白加上HBcAg的29个氨基酸的前序列以及相应的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是ayw亚型的183个氨基酸的蛋白加上HBcAg的29个氨基酸的前序列。
SEQ ID NO: 3是HBcAg可以包含来平衡α-螺旋的序列。
SEQ ID NO: 4是构建体CoHo7e的序列。
SEQ ID NO: 5是构建体H3Ho的序列。
SEQ ID NO: 6是空LolC构建体的序列。
SEQ ID NO: 7是LolC-K6构建体的序列。
SEQ ID NO: 8是LolC-K1构建体的序列。
SEQ ID NO: 9是LolC的序列。
发明详述
此外，如在本说明书和在附属的权利要求书中使用的，除非另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用。因此，例如，对“一个糖”的引用包括两个或更多个这样的糖，或者对“一个蛋白表位”的引用包括两个或更多个这样的蛋白表位。
本文所引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是在上文或下文中引用的，在此通过引用以其整体合并入本文中。
乙型肝炎核心抗原（HBcAg）
根据HBV的亚型，HBcAg具有183或185个氨基酸（aa）。ayw亚型的183个氨基酸的蛋白的序列加上29个氨基酸的前序列显示于SEQ ID NO:2中。成熟的HBcAg为第30位的Met残基至最C末端的Cys残基，第1至29位的序列是前序列。
所述蛋白可以包括形成二聚体的HBcAg的两个拷贝。HBcAg的二聚体形成VLP的结构性构成部件。该HBcAg单元通常以头至尾的形式连接在一起，即一个单元的C末端连接至相邻单元的N末端。这些单元可通过共价键（例如肽键）直接连接，但优选地它们通过接头连接，所述接头将相邻的单元隔开，从而避免破坏相邻单元的包装的问题。接头的性质在下文讨论。
所述蛋白中的HBcAg可以是天然的全长HBcAg。所述HBcAg具有连接至e1环的糖。在所述蛋白包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝的的情况中，HBcAg的一个拷贝具有连接至e1环的糖。HBcAg的另一个烤贝可以是天然的HBcAg、可以是如本文所述的HBcAg的经修饰的版本、可以具有连接至e1环的糖或可以包含e1环中的蛋白表位。可能的糖和蛋白表位的例子在下文讨论。
作为总的原则，任何修饰都被选择得不干扰HBcAg的构象及其组装成颗粒的能力。这些修饰在蛋白中对于维持其构象不重要的位点进行，例如在e1环中、C末端和/或N末端。HBcAg的e1环可耐受例如1至500个氨基酸的插入而不会破坏蛋白的颗粒形成能力。
HBcAg序列可通过取代、插入、缺失或延伸而被修饰。插入、缺失或延伸的尺寸可以是例如1至500个aa、1至400个aa、1至300个aa、1至200个aa、3至100个aa或6至100个aa。取代可以涉及HBcAg序列的长度上的多个氨基酸，多达例如1、2、5、10、20或50个氨基酸。延伸可以在HBcAg的N末端或C末端。缺失可以在蛋白的N末端、C末端或内部位点。取代可以在蛋白序列的任何位置进行。插入也可以在蛋白序列的任何位点进行，但通常在蛋白的表面暴露区域（例如e1环）进行。被插入的序列可以携带蛋白表位。一个或多个氨基酸可以被插入，使得随后可以连接一个或多个糖。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸可以被插入。氨基酸可以被连续地插入。用于连接糖而被插入的任何氨基酸必须能够连接至糖。这些氨基酸的例子包括赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个赖氨酸可以被插入。一个或多个丙氨酸可以被插入一个或多个氨基酸的任一侧，这些氨基酸已经被插入用于连接糖。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个丙氨酸可以被插入。所述丙氨酸可以被连续地插入。可以对每个HBcAg单元进行多于一个的修饰。因此，可以进行末端延伸或缺失并进行内部插入。例如，可以在C末端进行截平并在e1环中进行插入。
本发明的蛋白中的HBcAg序列的每个部分优选具有与天然的HBcAg蛋白的相应序列的至少70%序列一致性，例如具有如SEQ ID NO:2所示的序列的蛋白。更优选地，所述一致性为至少80%、至少90%、至少97%、至少98%或至少99%。测定蛋白同源性的方法在本领域中是熟知的，本领域技术人员将会理解的是，在本说明书中，同源性是基于氨基酸一致性计算的（有时称为“硬同源性（hard homology）”）。
例如UWGCG软件包（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12: 387-395）提供BESTFIT程序，它可以被用来计算同源性（例如使用其默认设置）。PILEUP和BLAST算法可以被用来计算同源性或对齐序列（通常使用它们的默认设置），例如在Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10中描述的。
进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到。该算法涉及首先识别出高分值序列对（HSP），其通过识别查询序列中的长度为W的短字段而进行，所述短字段在与数据库序列中相同长度的字段对齐时匹配或满足某些正值的阈值分值T。T是指相邻字段分值阈值（Altschul et al, 同上）。这些初始的相邻字段匹配用作启动查找包含它们的HSP的检索的种子。字段匹配沿各个序列在两个方向上延伸，只要累积的对齐分值可以被升高。当出现以下情况时字段匹配在每个方向上的延伸停止：累积的对齐分值从其最大达到值下降数量X；由于累积一个或多个负分值的残基对齐，累积分值达到零或以下；或达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了对齐的灵敏度和速度。BLAST程序的默认值如下：字段长度（W）为11；BLOSUM62分值矩阵（参见Heikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）对齐（B）为50；期望值（E）为10；M=5；N=4；并且比较双链。
BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如，Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(P(N))，它表示两个核苷酸序列或氨基酸序列偶然匹配的概率。例如，当第一序列与第二序列比较时，如果最小和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则认为一个序列与另一个序列相似。
HBcAg的e1环位于成熟序列的第68至90位，蛋白表位可以被插入这些位置之间的任何位置。如上文所述的用于连接糖的氨基酸可以被插入这些位置之间的任何位置。优选地，用于连接糖的表位或氨基酸被插入到第69至90位、第71至90位或第75至85位的区域中。最优选的是将用于连接糖的表位或氨基酸插入到第79和第80个氨基酸残基之间或第80和第81个残基之间。当插入用于连接糖的表位或氨基酸时，HBcAg的整个序列可以被维持，或者替代地e1环序列的整个或其一部分可以被缺失并被蛋白序列取代。因此，第69至90个、第71至90个或第75至85个氨基酸残基可以被用于连接糖的表位或氨基酸取代。当用于连接糖的表位或氨基酸取代e1环序列时，取代序列通常不短于被其取代的序列。
HBcAg的C末端截平通常不超出aa 144，因为如果进行任何进一步的截平，就可能不形成颗粒。因此，被删除的氨基酸可以包括例如aa 144至C末端aa（aa 183或185）、aa 150至C末端aa、aa 164至C末端aa或aa 172至C末端aa。HBcAg的C末端结合DNA，因此C末端的截平降低或完全从HBcAg和HBcAg杂合蛋白的制剂中移除DNA。
本发明的蛋白形成颗粒，其优选类似于由天然HBcAg形成的颗粒。本发明的颗粒包含本发明的蛋白的多个拷贝。所述颗粒可以是VLP的形式。本发明的颗粒通常直径为至少10 nm，例如直径为10至50 nm或20至40 nm，但优选地，它们的直径为约27 nm（这是天然HBcAg颗粒的尺寸）。它们包括多个HBcAg单元，例如150至300个单元，但通常它们被固定至约180或约240个单元（这是天然HBcAg颗粒中单元的数量）。因为本发明的蛋白可以是二聚体，这意味着颗粒中的蛋白单体的数量可以是75至150个，但通常是约90或约120个。
相邻的HBcAg拷贝之间的接头通常为长度至少为1.5 nm（15 Å）的氨基酸的链，例如1.5至10 nm、1.5至5 nm或1.5至3 nm。它可以例如包含4至40 aa或10至30 aa，优选15至21 aa。接头通常是柔性的。接头中的氨基酸可以例如包括甘氨酸、丝氨酸和/或脯氨酸或完全由它们组成。优选的接头包括序列GlynSer (GnS)的一个或多个重复，其中n为2、3、4、5、6、7或8。替代地，接头可以包括一个或多个GlyPro (GP)二肽重复。重复的次数可以例如是1至18次，优选3至12次。在G2S重复的情况中，已经发现使用5、6或7次重复允许颗粒的形成。接头可以对应于抗体的铰链区域；该铰链区域被认为提供抗体的抗原结合结构域和尾部结构域之间的柔性连接。
组成HBc穗区域的两个α螺旋不是对称的，因此所得到的MIR不会从VLP完全竖直地指向，而是略微偏移。因此分子模型表明已插入的任何抗原可以平行于VLP，而不是成直角。这有可能导致空间位阻和免疫原性的降低。HBcAg可以包含这样的插入序列，它通过将一个或多个额外的转向增加至第一螺旋（其位于成熟序列的第50至73位）从而“平衡”α螺旋。这导致出现垂直定向至VLP的被插入的蛋白表位。这可以通过将3至12个氨基酸（例如3、5或7个氨基酸）插入至HBcAg来实现。这些氨基酸优选是不带电荷的氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸。被插入的序列优选是AAALAAA（SEQ ID NO: 3）。插入可以在成熟序列的第50和75个氨基酸之间的位点，例如在第60和75个残基或第70和73个残基之间的位点。
糖
术语“糖”是指多糖、寡糖和单糖。所述蛋白包含具有连接到e1环的糖的HBcAg。所述蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝。在存在串联的HBcAg的两个拷贝的情况中，HBcAg的一个或两个拷贝具有连接到e1环的糖。
连接到e1环的糖可以多于一个。所述e1环可以连接有可以多于一种的糖。e1环可以连接有不同的糖。在存在串联的HBcAg的两个拷贝的情况中，可以有一个或多个不同的糖连接到每个HBcAg中的e1环。如果所述糖衍生自一个以上的病原体或过敏原，则可能可用于同时诱导对一个以上的病原体或过敏原的免疫响应。所述糖可以是糖蛋白的一部分，使得糖蛋白被连接至e1环。
糖被连接到e1环中的一个或多个氨基酸。用于连接糖的一个或多个氨基酸可以被插入进如本文所描述的e1环。所述用于连接糖的一个或多个氨基酸可以是在HBcAg中自然发生的氨基酸。这些氨基酸的例子包括赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。糖可以被连接至一个以上的自然发生的氨基酸。糖可以被连接至自然发生的氨基酸和被插入的氨基酸。
所述糖可以衍生自任何病原体或过敏原。所述糖可以包括T细胞表位或B细胞表位。如果它是T细胞表位，则它可以是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位或T辅助（Th）细胞表位（例如，Th1或Th2表位）。可以存在一个以上的表位。如果存在一个以上的表位，则表位中的一个可以是T辅助细胞表位，而另一个可以是B细胞或CTL表位。T辅助细胞表位的存在增强了对B细胞或CTL表位的免疫响应。
糖的选择取决于期望引起的免疫响应或疫苗接种所针对的疾病。糖可以例如是来自病原性生物、癌症相关的抗原或过敏原。所述病原性生物可以例如是病毒、细菌或原生动物。所述糖可以来自本文描述的任何来源（例如病原性生物和癌症），其中蛋白表位可以衍生自该来源，并且该来源包含糖。
优选地，病原性生物衍生自细菌。所述细菌可以是伯克霍尔德氏菌（Burkholderia），例如，类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. mallei）。所述病原性生物可以包含常见的/共同的（common）荚膜多糖（capsule polysaccharide，CPS）。所述糖可以包括来自CPS的抗原。所述糖可以包括来自CPS的一个或多个表位。 CPS可衍生自伯克霍尔德氏菌（Burkholderia），例如，类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. mallei）。CPS包括1-3个连接的2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露-庚吡喃糖（2-O acetyl-6-deoxy-β-D-manno-heptopyranose）的无支链的均聚物。因此，所述糖可以包括1-3个连接的2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露-庚吡喃糖的无支链的均聚物。CPS已经被鉴别为类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）和鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. mallei）中的主要毒力决定因素，其中类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）中CPS表达的损失使小鼠中的MLD从70 cfu增加至大于106 cfu。类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）的CPS已经被证明会提供针对小鼠模型中的后续挑战的部分保护，同时针对CPS而引起的抗体的被动转移也能够提供了保护。
蛋白表位
本发明的蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中第一拷贝具有连接到e1环的糖，第二拷贝包含在e1环中的蛋白表位。所述“第一拷贝”可以是N末端拷贝或C末端拷贝。
所述蛋白表位包含引起免疫响应的氨基酸的序列。所述表位可以是构象性的或线性的。它可以例如在6至500个aa、20至500个aa、50至500个aa、100至500个aa、200至500个aa、300至500个aa或300至400个aa的序列中。
较大的和/或疏水性的插入可以被容纳而不破坏VLP。被用作插入物的蛋白表位可以是不破坏VLP形成的任何适当的尺寸。其优选小于100kDa，例如小于80 kDa、小于60 kDa、小于40 kDa、小于20 kDa、小于10 kDa或小于5 kDa。其可以多于5 kDa、10 kDa、20 kDa或30 kDa。
本发明的蛋白可以含有多于一个蛋白表位，例如多达2、3、5或8个蛋白表位。表位多于一个的拷贝可以被插入到HBcAg的拷贝中，例如，可以插入2至8个拷贝。当本发明的蛋白中有两个或更多个蛋白表位时，它们可以来自于相同或不同的生物体以及来自相同或不同的蛋白。
所述表位可以是T细胞表位或B细胞表位。如果它是T细胞表位，则它可以是细胞毒性T-淋巴细胞（CTL）表位或T辅助细胞（Th）表位（例如Th1或Th2表位）。在本发明的一个优选实施方式中，表位中的一个是T辅助细胞表位，另一个是B细胞表位或CTL表位。T辅助细胞表位的存在增强了对B细胞表位或CTL表位的免疫响应。
表位的选择取决于疫苗接种期望对抗的疾病。例如，所述表位可以来自病原性生物、癌症相关的抗原或过敏原。所述病原性生物可以是例如病毒、细菌或原生动物。
所述表位可以衍生自任何病原体，所述病原体例如但不限于病毒，包括正粘病毒科（orthomyxoviridae）（包括例如流行性感冒A、B和C病毒）、腺病毒科（adenoviridae）（包括例如人腺病毒）、杯状病毒科（Caliciviridae）（例如诺沃克病毒群（Norwalk virus group））、疱疹病毒科（herpesviridae）（包括例如HSV-1、HSV-2、EBV、CMV和VZV）、乳多空病毒科（papovaviridae）（包括例如人类乳头状瘤病毒（HPV））、痘病毒科（poxviridae）（包括例如天花病毒和牛痘病毒）、小DNA病毒科（parvoviridae）（包括例如细小病毒B19）、呼肠孤病毒科（reoviridae）（包括例如轮状病毒）、冠状病毒科（coronaviridae）（包括例如SARS）、黄病毒科（flaviviridae）（包括例如黄热病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒和森林脑炎病毒）、小RNA病毒科（picornaviridae）（包括肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲型肝炎病毒）、披膜病毒科（togaviridae）（包括例如风疹病毒）、丝状病毒科（filoviridae）（包括例如马尔堡病毒和埃博拉病毒）、副粘液病毒科（paramyxoviridae）（包括副流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒） 、弹状病毒科（rhabdoviridae）（包括例如狂犬病病毒）、尼亚病毒科（bunyaviridae）（包括例如汉坦病毒）、逆转录病毒（retroviridae ）（包括例如HIV和人类T细胞淋巴瘤病毒（HTLV））和肝病毒科（hepadnaviridae）（包括例如乙型肝炎病毒）的成员。
所述表位可以衍生自细菌，所述细菌包括伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、衣原体（Chlamydia）、淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）、志贺氏杆菌（Shigella）、沙门氏菌（Salmonella）、霍乱弧菌（Vibrio Cholera）、梅毒螺旋体（Treponema pallidua）、假单胞菌属（Pseudomonas）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、布鲁氏菌（Brucella）、土拉弗朗西斯菌（Franciscella tulorensis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、钩端螺旋体菌（Leptospria interrogaus）、嗜肺军团菌（Legionella pnumophila）、鼠疫杆菌（Yersinia pestis）、链球菌（Streptococcus，A型和B型）、肺炎球菌（Pneumococcus）、脑膜炎球菌（Meningococcus）、流感嗜血杆菌（Hemophilus influenza，b型）、弯曲杆菌病（Complybacteriosis）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、杜诺凡病（Donovanosis）和放线菌（Actinomycosis）、真菌病原体（包括念珠菌（Candidiasis）和曲霉病（Aspergillosis））、以及寄生虫病原体（包括弓形虫（Toxoplasma gondii）、绦虫（Taenia）、吸虫（Flukes）、蛔虫（Roundworms）、扁虫（Flatworms）、阿米巴病（Amebiasis）、贾第虫病（Giardiasis）、隐孢子虫（Cryptosporidium）、血吸虫（Schitosoma）、卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii）、滴虫病（Trichomoniasis）和旋毛虫病（Trichinosis））。
所述表位可以衍生自通过a）呼吸道、b）泌尿生殖系统或c）胃肠道进行感染的病原体。此类病原体的例子包括a）腺病毒（adenoviridae）、副粘液病毒科（paramyxoviridae）和痘病毒科（poxviridae）、鼻病毒、流行性感冒、和汉坦病毒的成员；b）解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）、淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）、阴道加德菌（Gardnerella vaginalis）、阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、HPV、HIV、白色念珠菌（Candida albicans）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）、以及肉芽肿荚膜杆菌（Calmatobacterium）；以及c）志贺氏菌（Shigella）、沙门氏菌（Salmonella）、霍乱弧菌（Vibrio Cholera）、大肠杆菌（E.coli）、溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、梭菌属（Clostridium）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒、蛔虫、扁虫、贾第鞭毛虫病（Giardiasis）、以及隐孢子虫（Cryptosporidium）。
本发明使用的表位可以衍生自癌症，所述癌症例如但不限于肺癌、胰腺癌、肠癌、结肠癌、乳房癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、淋巴瘤（例如EBV诱导的B细胞淋巴瘤）和白血病。肿瘤相关的抗原的具体例子包括但不限于：癌症睾丸抗原（例如MAGE家族（MAGE 1、2、3等）的成员、NY-ESO-1和SSX-2）、分化抗原（例如酪氨酸酶、gp100、PSA、Her-2和CEA）、突变的自身抗原和病毒性肿瘤抗原（例如来自致癌性HPV类型的E6和/或E7）。特定的肿瘤抗原的进一步的例子包括MART-1、Melan-A、P97、β-HCG、GaINAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黑色素瘤抗原gp75、Hker 8、高分子量的黑色素瘤抗原、K19、Tyrl、Tyr2、pMel 17基因家族的成员、c-Met、PSM（前列腺粘蛋白抗原）、PSMA（前列腺特异膜抗原）、前列腺分泌蛋白、甲胎蛋白、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1和BRCA-2抗原。
本发明使用的其它候选表位的例子包括来自以下抗原的表位：流感抗原HA（血凝素）、NA（神经氨酸酶）、NP（核蛋白/核壳蛋白）、M1、M2、PB1、PB2、PA、NS1和NS2；HIV抗原gp 120、gp 160、gag、pol、Nef、Tat和Ref；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；疱疹病毒抗原EBV gp 340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物、巨细胞病毒gB、巨细胞病毒gH和IE蛋白gP72；人类乳头状瘤病毒抗原E4、E6和E7；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白和N蛋白；百日咳杆菌（B.pertussis）的百日咳杆菌粘附素抗原、肿瘤抗原癌CEA、癌相关的粘蛋白、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤P97、MAGE抗原、癌Neu的癌基因产物、前列腺特异性抗原（PSA）、前列腺相关的抗原、ras蛋白和myc；以及屋尘螨过敏原。
优选地，所述蛋白表位衍生自伯克霍尔德氏菌（Burkholderia），例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）。所述蛋白表位可以衍生自表1中列出的蛋白的任一种。所述蛋白表位可以包含表1中列出的蛋白的任一种或由其组成。所述蛋白表位可以是表1中列出的蛋白的任一种的片段。
表1-蛋白
优选地，所述蛋白表位衍生自LolC蛋白。以下段落讨论LolC蛋白，但该讨论同样适用于在表1中列出的蛋白的任一种。LolC蛋白可以是天然存在的LolC蛋白或者可以是天然存在的LolC蛋白的变体。所述蛋白质表位可以包括LolC蛋白或由LolC蛋白组成。因此全长LolC或其片段可以被插入进e1环。
本文所述的LolC蛋白序列为：
ALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGS (SEQ ID NO: 9)。
所述LolC蛋白的序列可以具有与SEQ ID NO: 9或任何天然存在的LolC蛋白的同源性，例如在整个序列或在至少20、例如至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、或至少350或更多个连续的氨基酸的区域上，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。测定蛋白同源性的方法在本领域中是公知的，并且如上关于HBV核心蛋白进行了描述。
同源蛋白通常通过取代、插入或缺失而不同于天然存在的LolC序列，例如1、2、3、4、5至8个或更多个的取代、缺失或插入。取代优选是“保守的”，并且例如可以根据表2进行。在第二列的同一区块的氨基酸和优选在第三列的同一行的氨基酸可以相互取代。
表 2
被用作插入物的LolC蛋白的片段是全长LolC蛋白的缩短版本，其保留了诱导免疫响应的能力。在一些情况下，片段可以是天然存在的LolC序列或SEQ ID NO:9的序列的长度的至少10％、例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％和更优选至少95％。例如片段的长度可以是6至354个aa、6至300个aa、6至200个aa、6至100个aa、6至50个aa或6至25个aa。
将糖连接至蛋白的方法
本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法。所述方法包括将一个或多个糖连接至e1环。如本文所述，糖被连接至e1环中的一个或多个氨基酸。糖可以通过氧化糖的还原胺化连接到e1环中的氨基酸。所述氨基酸可以是赖氨酸。高碘酸钠可以被用来氧化糖。糖的氧化产生末端醛残基。使用pH 7.5的PBS中的氰基硼氢化钠，可以将糖的末端醛残基还原胺化为伯胺。在连接糖之前，所述蛋白可以被纯化。
所述方法可以进一步包含在连接糖之前制备蛋白。在连接糖之前的蛋白的生产将在下文更加详细描述。
在连接糖之前制备蛋白
在连接糖之前，可以通过重组DNA技术制备蛋白。可以利用已知的操纵核酸的技术制备核酸分子。在蛋白包含HBcAg的两个拷贝的情况中，通常，制备编码这两个HBcAg拷贝的两个独立的DNA构建体，然后通过重叠PCR连接在一起。
在连接糖之前，可以通过在表达蛋白的条件下，培养包含编码该蛋白的核酸分子的宿主细胞，以及回收该蛋白来生产蛋白。合适的宿主细胞包括细菌（例如E. coli）、酵母菌、哺乳动物细胞和其他的真核细胞（例如昆虫Sf9细胞）。
构建根据本发明的核酸分子的载体可以是例如质粒载体或病毒载体。它们可含有复制的起点、用于表达编码蛋白的序列的启动子、启动子的调节子（例如增强子）、转录终止信号、翻译起始信号和/或翻译终止信号。所述载体也可以包含一个或多个选择性的标记物基因，例如在细菌质粒的情况中的氨苄青霉素抗性基因或在哺乳动物载体的情况中的新霉素抗性基因。载体可以在体外用于例如生产RNA或用来转化或转染宿主细胞。所述载体也可以适于在体内被用在例如基因治疗或DNA疫苗接种的方法中。
启动子、增强子和其他表达调节信号可以被选择来与表达载体所设计的宿主细胞兼容。例如，可以使用原核启动子，特别是适用于E.coli菌株（例如E. coli HB101）中的启动子。可以使用其活性响应于周围环境（例如厌氧条件）中的变化而被诱导的启动子。优选地，可以使用htrA或nirB启动子。这些启动子可以特别是被用来在减毒细菌中表达蛋白，例如被用作疫苗。当所述蛋白的表达在哺乳动物细胞中进行时，无论是在体外还是在体内进行，都可以使用哺乳动物启动子。也可以使用组织特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复序列（MMLV LTR）、劳斯氏肉瘤病毒（RSV）LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒（CMV）IE启动子、单纯疱疹病毒启动子和腺病毒启动子。所有这些启动子都可从现有技术中容易得到。
本发明的蛋白可以使用用于纯化蛋白的常规技术来纯化。所述蛋白例如可以以纯化的、纯的或分离的形式提供。对于在疫苗中使用，所述蛋白通常必须以高水平的纯度提供，例如以在制剂中包含多于80%、多于90%、多于95%或多于98%的蛋白的水平。但是，在最终疫苗制剂中将所述蛋白与其他蛋白混合也是可取的。
诱导免疫响应
本发明的蛋白或颗粒可以被用来诱导免疫响应。所述蛋白或颗粒可以被用作疫苗。所述蛋白或颗粒可以被用来引起对所有组分（HBcAg和糖）的多个同时的免疫响应。在所述蛋白包含HBcAg的两个拷贝的情况中，所述多个免疫响应还可以包括进一步的针对额外的糖的免疫响应和/或针对蛋白表位的免疫响应。如果所有的糖、以及任选的蛋白表位都衍生自相同的来源，那么这可以针对该来源（例如病原体）诱导增强的免疫响应。如果所有的糖、以及任选的蛋白表位衍生自一个以上的来源，那么这可以针对不同的来源（例如一种以上的病原体）诱导同时的免疫响应。
所述蛋白或颗粒可以单独使用或用作组合物的一部分，所述组合物包括但不限于药物组合物、疫苗组合物或免疫治疗组合物。因此本发明提供了一种药物组合物（例如疫苗组合物），其包括本发明的蛋白或包含本发明蛋白的多个拷贝的颗粒、以及药学上可接受的载体或稀释剂。所述组合物可以进一步包括佐剂。所述组合物可以被用于人体或动物体的疫苗接种。所述组合物可以被用来针对本文描述的任何病原体进行疫苗接种。特别地，所述组合物可以被用来针对伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）（例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei））进行疫苗接种。
本发明的蛋白或本发明的颗粒可以被用在人体或动物体的疫苗接种的方法中。本发明提供了本发明的蛋白或本发明的颗粒用于制备用于人体或动物体的免疫接种的药物的应用。所述蛋白或颗粒可以被用来针对本文描述的病原体的任一种进行疫苗接种。特别地，所述组合物可以被用来针对伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）（例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei））进行疫苗接种。
疫苗接种背后的原理是在宿主中诱导免疫应答，从而在宿主中产生免疫记忆。这意味着，当宿主被暴露至有毒病原体时，它引发有效的（保护性的）免疫响应，即使病原体失活和/或杀死病原体的免疫响应。本发明形成了针对本文描述的任何病原体（例如伯克霍尔德氏菌（Burkholderia））的疫苗的基础。所述蛋白可以同时对个体针对多种疾病和病症进行疫苗接种，所述疾病取决于所述蛋白包含的糖和任选的蛋白表位。这样的疾病和病症包括本文描述的任何一种以及HBV、HAV、HCV、口蹄病、脊髓灰质炎、疱疹、狂犬病、AIDS、登革热、黄热病、疟疾、肺结核、百日咳、伤寒、食物中毒、腹泻、脑膜炎和淋病。对糖和蛋白表位进行选择，以使其适于该疫苗旨在提供的保护所针对的疾病。
本发明提供了在对象中诱导免疫响应的方法，所述方法包含向对象施用本发明的蛋白或颗粒。优选地，所述免疫响应是针对伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）（例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei））的。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用，是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其他猿类和猴类物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠以及猪；鸟类，包括家养的、野生的和竞技的鸟类，例如鸡、火鸡和其他鸡形鸟类、鸭、鹅等。所述术语不指示特定的年龄。因此，成体和新生个体都旨在被包括在内。本发明所述的方法旨在用于以上脊椎动物物种的任何一种，因为所有这些脊椎动物的免疫系统都以类似方式运作。
在一些情况下，本发明可以被施用至任何合适的对象，特别是给定物种的任何合适对象，优选是合适的人类对象。因此，尽可能多的对象可以例如接受施用，而不强调对象的任何特定的群体。例如，作为整体的或尽可能多的对象的群体可以接受施用。
本发明的蛋白或颗粒用于施用至对象。它可以与佐剂一起同时施用或按顺序施用。因此，包含蛋白或颗粒的本发明的组合物还可以包含佐剂。本发明的组合物可以通过注射（例如皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内和腹膜内）、经皮颗粒递送、吸入、局部地、口服地或经黏膜（例如鼻腔、舌下、阴道或直肠）的方式而递送。
所述组合物可以被配制为常规的药物制剂。这可以使用标准的药物制剂化学和方法学来实现，这对于本领域技术人员都是可获得的。例如，包含蛋白或颗粒的组合物（含有或不含有佐剂）可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体组合以提供液体制剂。因此，本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述蛋白或颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂。所述组合物任选地包含佐剂。
可以存在辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。这些载体、稀释剂和辅助性物质通常是这样的药物试剂，它可以被施用而不引起不适当的毒性，并且在抗原性组合物的情况下在其本身不会诱导在接收该组合物的个体中的免疫响应。药学上可接受的载体包括但不限于液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以被包括在其中，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。虽然不是必需的，但优选地，制剂将含有用作稳定剂的药学上可接受的载体，特别是用于肽、蛋白或其他类似的分子（如果它们被包括在组合物中的话）。也用作肽的稳定剂的合适的载体的例子包括但不限于药品级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌糖、葡聚糖等。其他合适的载体包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇（PEG）及其组合。药学上可接受的赋形剂、载体和辅助性物质的深入讨论在REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)中可获得，其通过引用合并至本文中。
替代地，所述蛋白或颗粒和/或佐剂可以被包封、吸附至颗粒载体，或与颗粒载体连接。合适的颗粒载体包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒载体、以及来源于聚乳酸和聚乳酸共乙交酯的PLG微颗粒。参见例如Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368。也可以使用其他颗粒系统和聚合物，例如聚合物，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的轭合物。
一旦配制完成，所述组合物可以使用多种已知的途径和技术在体内递送至对象。例如，液体制剂可以作为注射溶液、悬浮液或乳剂而提供，并使用常规的针头和注射器或使用液体喷射注射系统，经过肠胃外、皮下、皮内、肌内、静脉内、骨内和腹膜内注射而施用。液体制剂也可以被局部地施用至皮肤或粘膜组织（例如鼻腔、舌下、阴道或直肠），或作为适于吸入施用或肺部施用的细分散喷雾而提供。其他施用方式包括口服施用、栓剂和主动或被动的经皮递送技术。
通常，本发明的蛋白或颗粒以将有效地调节免疫响应的量而被施用至对象。合适的有效量将会落入相对较大的范围，但可以由本领域技术人员通过常规的试验而容易地确定。“医生桌面参考（Physicians Desk Reference）”和“古德曼和吉尔曼的治疗药理基础（Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics）”可以用于确定所需的量。预防性有效量是防止疾病或病症的一种或多种症状发作的量。
通常，所述蛋白或颗粒以0.1至200 mg、优选1至100 mg、更优选10至50 mg体重的剂量施用。疫苗可以以单剂量方案或多剂量方案（例如2至32个剂量或4至16个剂量）给出。上述施用的途径和剂量仅旨在作为指导，途径和剂量最终由医生决定。
在某些情况下，在初始施用之后，可以进行本发明的组合物的后续施用。特别地，在初始施用之后，对象可被给予“加强剂”。所述加强剂可以是例如选自任何以上所述剂量的剂量。所述加强剂施用可以在初始施用之后例如至少一周、两周、四周、六周、一个月、两个月或六个月进行。
本发明的蛋白或颗粒及佐剂可以按顺序或同时施用，优选同时施用。两种实体可以在相同或不同的组合物中施用，优选相同的组合物。施用所述佐剂，使得观察到佐剂效应，即，观察到的免疫响应不同于佐剂没有与抗原一起施用时的响应。两种实体可以被施用在相同或不同的位点，优选相同的位点。优选地，两种实体在相同的时间在相同的位点被施用在相同的组合物中，并且优选经注射施用。
可以使用任何合适的佐剂。当前使用的疫苗佐剂包括：
-无机化合物，例如铵盐（如氢氧化铵和磷酸铝）或磷酸钙。铝盐也被称为矾。
-基于油乳剂和表面活性剂的制剂，例如MF59（微流化的洗涤剂稳定化的水包油乳剂）、QS21（纯化的皂素）、AS02 [SBAS2]（水包油乳剂+ MPL + QS-21）、Montanide ISA-51和ISA-720（稳定化的油包水乳剂）。
-颗粒佐剂，例如病毒颗粒（结合了例如流感血凝素的单层脂质体载体）、AS04（[SBAS4]具有MPL的Al盐）、ISCOMS（皂素和脂质的结构化复合物）、以及聚乳酸乙交酯共聚物(PLG)。
-微生物衍生物（天然的和合成的），例如单磷酰脂A (MPL)、Detox（MPL + M. Phlei细胞壁骨架）、AGP [RC-529]（合成的酰化单糖）、DC_Chol（能够自身组织成脂质体的类脂免疫刺激剂）、OM-174（脂质A衍生物）、CpG模体（含有免疫刺激CpG模体的合成寡核苷酸）、以及经修饰的LT和CT（经遗传修饰的细菌毒素以提供无毒佐剂效应）。
-内源性人免疫调节剂，例如hGM-CSF或hIL-12（能够以蛋白或编码的质粒的形式施用的细胞因子）、以及Immudaptin（C3d串联阵列）。
-惰性载体，例如金颗粒。
优选的佐剂是矾。最优选地，所述佐剂是氢氧化铝和氢氧化镁的混合物，例如注射用矾（Pierce Laboratories）。
本发明通过以下实施例来阐释。
实施例
材料与方法
构建体的设计
所有串联核心克隆衍生自亲本构建体CoHo7e。在串联核心的该版本中，α螺旋如上所述地被“平衡”，并且HBc的两个拷贝都移除了核酸结合区域。因此，因为核心的两个版本是基本上相同的，所述构建体被指定为同型串联，唯一的差异是沉默的突变，以允许改变的限制位点。使用的串联核心CoHo7e的序列为：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEGSAGGGRDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEFAGASDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVL (SEQ ID NO: 4)。
所述H3Ho构建体基于串联核心的原始CoHo版本，如在国际申请WO2001/077158中所述的。设计了六赖氨酸插入体，它会产生反应的“热点”，可以使用标准的胺化学将CPS结合至所述热点上。它们是被综合地设计的，并且包括含有序列AAALAAA（SEQ ID NO: 3）的重新设计的MIR，以“平衡”如上所述的α螺旋。合成的插入物被连接以产生H3Ho。最终的序列被核实且结果如下：
MSDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 5)。
另一种方法是，插入分离自伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）的蛋白抗原。所述LolC蛋白先前已显示是免疫原性的，因此被选择作为潜在的插入物。然而，为了确保VLP的组装不被阻碍，同时在N末端和C末端发现α螺旋折叠的区域。因此，抗原的插入将是从α螺旋状的二级结构进入HBc尖峰的α螺旋。目前，不存在LolC的晶体学数据，因此其结构可以使用PSIPRED算法（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测。预测的插入区和侧翼区被化学地合成，并使用标准的连接技术被插入进H3Ho的核心1。最终的测序证实，这是成功的。空LolC序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 6)。
然后使用PstI和XhoI，通过切割H3Ho空LolC构建体的核心2，制成LolC插入物的两种变体。然后连接进合成的插入物，其包括六赖氨酸或侧翼有重复的丙氨酸残基的单个赖氨酸。测序再次确认了它们的特征。LolC-K6序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSKKKKKKGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 7)。
LolC-K1序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSGGGKGGGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 8)。
质粒的设计
使用两个系统进行蛋白表达；毕赤酵母（Pichia pastoris）和杆状病毒（baculovirus）载体。这需要使用两种不同的质粒，具体地，pPICz（Invitrogen）用于酵母和pOET1（Oxford Expression Technologies）用于杆状病毒。使用MfeI和pspOMI将H3Ho序列插入进 pPICz的多克隆位点，而使用pspOMI和BclI插入pOET1。
酵母中串联核心的蛋白表达
使用300 ng的线性化的质粒DNA通过电穿孔转化酵母。然后将该酵母划线到含有100µg/ml博来霉素（Zeocin）的YPD平板上，并选择最大的克隆。这些克隆然后单独地接受浓度增加的博来霉素，选择最耐抗的克隆来通过电穿孔进行第二次转化。使用含有更高水平的博来霉素的选择平板来重复该过程，以进行克隆选择。通过这种方式，产生了高拷贝数的克隆，其具有大大改善了的VLP表达水平。将大规模酵母培养物设置在200 ml的YPD中。大约4天之后，将培养基替换为诱导培养基，并使用甲醇（0.8％，72小时）诱导酵母。在该时间段之后，通过1500g的离心收取酵母细胞，并在纯化前将颗粒保存于-80℃。
杆状病毒中串联核心的蛋白表达
通过在Sf9昆虫细胞中的共转染产生重组病毒。将重复的反应混合物（每个都含有flashBACPRIME病毒DNA（100ng）和转移载体DNA（500ng; pOET1-K6-lolc））、以及形成Lipofectin脂质体的试剂（baculoFECTIN），一起加入至35mm2的培养皿中，以1×106个细胞/皿的密度接种Sf9昆虫细胞。然后将培养皿在28℃培养5天，然后将含有每种病毒的培养基收获到无菌管中。从50毫升的Sf9细胞中产生大量病毒，其密度为2×106个细胞/ ml，感染有0.5ml的共转染混合物。被感染的摇床培养物在28℃培养5天，然后通过在4℃在500xg离心20分钟进行收集。对于蛋白的表达，以1×106个细胞/皿的密度将Sf9细胞接种到35mm2的培养皿，而Tni细胞以0.5×106细胞个/皿的密度接种。每个培养皿在moi 5感染病毒。在28℃温育72小时之后，从每个培养皿中收获细胞颗粒和上清液。
蛋白的纯化
不管使用的表达载体、或插入的性质如何，纯化都以类似的方式进行。收获被诱导的细胞并进行旋降（300xg），随后以2.5g湿重/10ml裂解液的比例将其重悬在裂解液（20mM Tris pH 8.4，5mM EDTA，5mM MDTT，2mM AEBSF）中。然后将所得溶液穿过设定在500psi的微粉机（AVP Gaulin LAB 40）三次。加入洗涤剂（Triton X100），以形成0.5％溶液并将裂解物离心30分钟（25,000xg），然后收获上清液。将澄清的上清液穿过0.8um的死端过滤器（Nalgene），随后穿过0.45um并最后穿过0.2um过滤器。该物质被稀释10倍（20mM Tris pH8.4，5mM EDTA），然后穿过具有1MDa分子量截止（Pellicon）的切向流装置。这一步既除去低分子量的污染物又将体积减少至25ml。
然后将浓缩的溶胞产物施加到由Akta Pure FPLC系统驱动的填充有琼脂糖CL4B树脂的XK26/ 92柱中。缓冲液是20mM Tris pH 8.4，5mM EDTA。在260、280和350nm处监测级分。收集空隙体积，因为这含有包括VLP的大蛋白。丢弃在柱上分离的蛋白的其余部分。汇集空隙体积级分，并使用切向流装置（Pellicon）将其浓缩回落到10ml。然后将该物质通过填充有Sephacryl S1000树脂的XK26/ 55柱。该树脂具有大得多的孔径，并能够从其它大的蛋白中解析VLP。此前，我们已经使用重组单体HBc（Biospacific Inc）校准了所述柱，因此知道装配的VLP何时会流出。收集这些级分并在切向流装置上浓缩最后一次。
蛋白的识别与定性
在纯化过程的每一个步骤都常规地存储样品，因此允许在过程中监控。已知的是，虽然每个表达系统都毫无疑问地会形成VLP，但并不是所有串联核心蛋白都形成该最终构型。因此，需要被除去的最重要的污染物实际上是处于单体或错误折叠的状态的串联核心蛋白本身。然而，SDS-PAGE和免疫印迹按照定义是变性技术，因此这些技术必须与蛋白尺寸的了解相结合，蛋白尺寸可以使用在FPLC柱上的保留时间来估计。
通过在所述过程的所有阶段在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Laemmli，1970）上进行电泳，并随后进行考马斯蓝染色，来表征包含串联核心的样品。如所述地进行免疫印迹分析（Konig，et al.，1998），其使用针对HBc蛋白的单克隆初级抗体（10E11[Abcam]），以及随后的被结合至辣根过氧化物酶和化学发光底物ECLplus（Amersham Pharmacia）的小鼠次级抗体。通过Bradford方法（BioRad）测定蛋白浓度。
电子显微镜
所有样品都在20mM Tris HCl pH 8中被稀释至0.1mg/ml，并且在水浴超声波仪中超声处理45秒，随后立即吸附至网格。将涂覆有聚醋酸甲基乙烯脂/碳的铜网格（400目）含碳一侧朝下地放置在石蜡膜上的稀释样品的液滴上。材料被允许吸附10分钟。然后将网格在更换4次的1％乙酸双氧铀中洗涤。使用最后一次更换的乙酸双氧铀温育网格20秒，然后进行印迹和空气干燥。在FEI Tecnai G2 TEM上观察网格并数字成像。在87,000x、 43,000x和26,000x的放大倍率下获得图像。
LolC的抗原性的ELISA方法
将96孔微量滴定板在4℃涂覆24小时，其中100微升/孔的纯化LolC（标准，2-0.03 µg/mL）、VLP（阴性对照，30-0.2 µg/mL）和VLP-LolC（测试样品，30-0.2 µg/mL）。所有样品都在磷酸盐缓冲盐水（1x Dulbecco’s PBS，Invitrogen）中连续稀释两倍。每孔用PBS-0.05% Tween 20洗涤三次，并用200µL的含有5％（w/v）脱脂奶粉的PBS在37℃封闭1小时。然后每孔用PBS-0.05% Tween 20洗涤三次，添加疫苗接种有不含内毒素的LolC蛋白的来自小鼠的血清的1:1000稀释液（100微升/孔），并在37℃温育1小时。在用PBS-Tween 20洗涤3次之后，将IgG山羊抗小鼠辣根过氧化物酶结合物的1:2000稀释液加入到每孔（100µL），并在37℃温育1小时。每孔在PBS-Tween 20中再洗涤6次，使用ABTS/过氧化氢底物（100µL/孔）检测结合的结合物并室温下温育20分钟，随后在414nm进行光密度测量。
CPS至VLP的化学结合
将高碘酸钠（6 mg, 0.3 mmol）和CPS（5 mg）溶解于PBS（1 ml）中，并将反应混合物置于室温下1小时。使用利用PBS来平衡的PD-10脱盐柱（GE Healthcare）除去过量的偏高碘酸钠。氧化的CPS被加入到在PBS中的5mg/ml（1 ml）的蛋白的溶液中。将20 µl的NaBH3CN（在10 mM NaOH中有1M）加入到该溶液，并在黑暗中室温放置四天。将20µl的NaBH4（在10 mM NaOH中有1M NaBH4）加入到该溶液，搅拌后反应物静置40分钟。该溶液被稀释在MQ-H2O中，并针对碳酸氢铵缓冲液（20mM, pH7.8）充分透析并在vacuousing speed-vac（Thermo Scientific）中浓缩。
被浓缩的蛋白样品在ÄKTA Xpress FPLC纯化系统上进行纯化。将该结合物溶液注射到S500琼脂糖SEC柱XK 26/60（GE Healthcare）上，并以1 ml /分钟使用碳酸氢铵缓冲液（20mM, pH7.8）稀释。收集所有的级分（2.5ml）并使用苯酚：硫酸分析法和通过TEM和点印迹分析法来分析碳水化合物。收集的级分在真空中浓缩（Speed-Vac, Thermo Scientific）并透析到PBS中。
结果
从酵母样品中分离蛋白
在整个过程中收集样品，因此有可能随着过程进行跟踪纯度富集。最重要的是，不管存在的插入物如何，大多数的串联核心都被发现于在最初的离心后裂解之后的可溶性级分中。只有少数的核心蛋白被发现于来自该旋降的颗粒中，这表明尽管它们含有复杂的组分，但嵌合的VLP仍保持可溶。
从酵母或杆状病毒裂解物分离VLP不怎么常见，因为已经发现亲和层析不易与串联核心兼容。因此，进步的方法是基于样品中尺寸分类的逐步细化。最初，通过过滤除去非常大的碎片，留下小于200nm及其以下的颗粒。然后将样品通过具有1MDa分子量截止的切向流过滤器。这作用来保留大的VLP，但除去一些低分子量的污染物。
然后使用CL4B尺寸排阻层析（SEC）分离样品。该矩阵具有相对小的孔径，并且非常大的材料（包括VLP）将不会进入树脂。因此，较大的材料直接穿过柱并在空隙体积中找到。然而，相当数量的小分子蛋白确实进入树脂并且被延迟。因此，通过仅保留空隙体积，所述样品被有效地富集。SDS-PAGE和免疫印迹再次表明，大多数的串联核心的确是在CL4B空隙体积中被发现。
然后将CL4B空白样品穿过S1000 SEC柱。这通常用于分离大分子（例如核酸），但也能够从其他大的碎片中解析VLP。所述柱先前已使用重组HBc校准，该HBc已知是具有与串联核心VLP相似大小（34.6nm）的VLP。因此，有可能确定串联核心VLP应该在柱洗脱的最后1/3中被发现。当然是这样的，并且纯的VLP从这些组分中分离。这已通过电子显微镜证实。
图1至图3含有从酵母样品中分离的蛋白的数据。SDS-PAGE证实了串联核心在酵母溶胞产物的可溶级分中被发现（图1）。图2示出了VLP从CL4B柱的空隙体积中被分离（图2B的左侧面板上的较大的峰）。然后CL4B空隙通过S1000柱，并从12-15级分中分离VLP。通过SDS-PAGE和免疫印迹（图3）证实了纯度。
从杆状病毒样品中分离蛋白
串联核心蛋白也被发现来自最初的25,000xg旋降的上清液中，这再次表明VLP是可溶的。SDS-PAGE和免疫印迹证实非常少的蛋白被丢失至不溶性颗粒。在大多数方面，从杆状病毒中分离VLP与从酵母中分离 VLP非常相似。然而，有一个主要的区别，因为通常发现杆状病毒与串联核心共纯化。这不仅在SDS-PAGE中作为50kDa的条带（图4A）被检测到，也在电子显微图中作为长管（图4B）清晰可见。
尽管反复多次纯化，但是将在杆状病毒中产生的VLP纯化到同质性是不可能的。因此，对于VLP优选的表达系统是酵母系统。
结合至CPS
为了证明结合方法的可行性，使用先前概述的技术将异硫氰酸荧光素（FITC）结合到VLC。
应当注意，因为SDS-PAGE按照定义是一种变性技术，这些数据表明，串联核心构成部件已经被有效地修饰，因为其分子量已经增加（图5）。然而，当这些结合颗粒在蔗糖垫上跑动时，荧光带被见于VLP区域，从而支持了已经实现结合而没有破坏VLP的事实（图6）。
类似地，我们进一步证明，通过将其结合至牛血清白蛋白（图7），CPS自身的结合也是可能的。因此，我们已经表明，使用我们所定义的化学方法，CPS的结合是可能的，也存在结合到VLP。因此，CPS直接连接至VLP也应该是可行的。
抗原性和免疫原性
CPS至VLP的结合应该不会从根本上改变糖蛋白的三级结构。该结合物的体内测试正在进行。
然而，另一种方法是将抗原直接插入进串联核心分子。虽然有可能引导至VLP，其高度地装饰有被插入的抗原，但是它潜在地对插入物的折叠施加严重的空间限制，因为它被栓系在两端。为了检验这一点，在ELISA中测试携带LolC插入物的VLP，其使用感染了野生型伯克霍尔德氏菌的小鼠中产生的抗体。值得注意的是，携带LolC的VLP被识别为具有几乎与野生型Lolc蛋白本身一样高的亲和力。对空载VLP存在较小的响应，但该响应对于插入物明显是主要的（图8）。对于图8，对应于VLP LolC的线对30 ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之间。对应于空载VLP的线对30ug/ml的值位于0.4平均OD附近。
讨论
单体核心蛋白的免疫原性被良好地确立，其接受抗原插入物进入其MIR的能力也一样。然而，同样被记载的是，该技术具有主要的弱点，因为当加入较大的或疏水性的插入物时，核心二聚体不再形成，导致VLP的形成失败。串联核心构建体的发展克服了这一主要限制。
虽然串联核心作为被插入的蛋白抗原的递送系统的效用已在别处被证明，在化学结合模式中使用该系统也是可能的。在这种情况中，非特异性的接头氨基酸被插入进MIR，并且疾病特异性来源于抗原与上述这些靶标氨基酸的化学结合。此技术进一步扩大了串联核心可携带的抗原，因为可以结合糖蛋白，这使用常规的克隆方法是不可能加入的。VLP的多聚性质意味着目标结合物的多个拷贝被加入到每个VLP。鉴于在每个VLP中存在90-120个HBc二聚体，可以达到非常高的抗原递送密度。当然，将化学结合物与特定性抗原插入物进行组合是可能的，因此使得嵌合的分子同时具有特异性的蛋白和特异性的糖蛋白。
对于VLP优选的表达系统是毕赤酵母（Pichia pastoris）。然而，可以使用多个系统，其包括细菌、杆状病毒和甚至是基于植物的表达。这些数据证明，该系统的特异性完全来自于初级蛋白序列，并且和可能存在于特定的表达系统中的翻译后修饰是不相关的。进一步地，我们已经证明，所使用的纯化策略适用于任何表达系统，因此很可能可扩展至工业方法。
序列表
<110> IQUR有限公司
<120> 基于乙型肝炎核心抗原的疫苗
<130> N402200WO
<150> GB1402890.6
<151> 2014-02-18
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(639)
<400> 1
atg caa ctt ttt cac ctc tgc cta atc atc tct tgt tca tgt cct act 48
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
gtt caa gcc tcc aag ctg tgc ctt ggg tgg ctt tgg ggc atg gac atc 96
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg 144
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat acc gcc tca 192
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt tca cct cac 240
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa cta atg act 288
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga gac 336
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
cta gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggc cta aag ttc agg caa 384
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc act ttt gga aga gaa aca gtt 432
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gct 480
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
tat aga cca cca aat gcc cct atc cta tca aca ctt ccg gag act act 528
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
gtt gtt aga cga cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct 576
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
cgc aga cga agg tct caa tcg ccg cgt cgc aga aga tct caa tct cgg 624
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
gaa tct caa tgt tag 639
Glu Ser Gln Cys
210
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 2
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
Glu Ser Gln Cys
210
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcAg可以包含的序列
<400> 3
Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala
1 5
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CoHo7e构建体
<400> 4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Gly Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gly Gly Arg Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
85 90 95
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
100 105 110
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
115 120 125
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
130 135 140
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Ser
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val
180 185 190
Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp
195 200 205
Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro
210 215 220
Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys
225 230 235 240
Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu
245 250 255
Phe Ala Gly Ala Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr
260 265 270
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
275 280 285
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
290 295 300
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
305 310 315 320
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Leu
325 330
<210> 5
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3Ho构建体
<400> 5
Met Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu
20 25 30
Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His
35 40 45
Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly
50 55 60
Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Glu Gly Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn
85 90 95
Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser
100 105 110
Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe
115 120 125
Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
130 135 140
Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp
165 170 175
Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro
180 185 190
Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala
195 200 205
Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His
210 215 220
Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu
225 230 235 240
Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Ser Gly Asp Pro
245 250 255
Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu
260 265 270
Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly
275 280 285
Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg
290 295 300
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu
305 310 315 320
Pro Glu Thr Thr Val Val Leu Glu
325
<210> 6
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空LolC构建体
<400> 6
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu
65 70 75 80
Gly Ser Ala Leu Gly Val Ala Ala Leu Ile Val Val Leu Ser Val Met
85 90 95
Asn Gly Phe Gln Lys Glu Val Arg Asp Arg Met Leu Ser Val Leu Ala
100 105 110
His Val Glu Ile Phe Ser Pro Thr Gly Ser Met Pro Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Thr Ala Lys Glu Ala Arg Leu Asn Arg Ser Val Ile Gly Ala Ala Pro
130 135 140
Tyr Val Asp Ala Gln Ala Leu Leu Thr Arg Gln Asp Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Val Met Leu Arg Gly Val Glu Pro Ser Leu Glu Pro Gln Val Ser Asp
165 170 175
Ile Gly Lys Asp Met Lys Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Pro Gly
180 185 190
Gln Phe Gly Ile Val Leu Gly Asn Ala Leu Ala Gly Asn Leu Gly Val
195 200 205
Gly Val Gly Asp Lys Val Thr Leu Val Ala Pro Glu Gly Thr Ile Thr
210 215 220
Pro Ala Gly Met Met Pro Arg Leu Lys Gln Phe Thr Val Val Gly Ile
225 230 235 240
Phe Glu Ser Gly His Tyr Glu Tyr Asp Ser Thr Leu Ala Met Ile Asp
245 250 255
Ile Gln Asp Ala Gln Ala Leu Phe Arg Leu Pro Ala Pro Thr Gly Val
260 265 270
Arg Leu Arg Leu Thr Asp Met Gln Lys Ala Pro Gln Val Ala Arg Glu
275 280 285
Leu Ala His Thr Leu Ser Gly Asp Leu Tyr Ile Arg Asp Trp Thr Gln
290 295 300
Gln Asn Lys Thr Trp Phe Ser Ala Val Gln Ile Glu Lys Arg Met Met
305 310 315 320
Phe Ile Ile Leu Thr Leu Ile Ile Ala Val Ala Ala Phe Asn Leu Val
325 330 335
Ser Ser Leu Val Met Thr Val Thr Asn Lys Gln Ala Asp Ile Ala Ile
340 345 350
Leu Arg Thr Leu Gly Ala Gln Pro Gly Ser Ile Met Lys Ile Phe Val
355 360 365
Val Gln Gly Val Thr Ile Gly Phe Val Gly Thr Ala Thr Gly Val Ala
370 375 380
Leu Gly Cys Leu Ile Ala Trp Ser Ile Pro Trp Leu Ile Pro Met Ile
385 390 395 400
Glu His Ala Phe Gly Val Gln Phe Leu Pro Pro Ser Val Tyr Phe Ile
405 410 415
Ser Glu Leu Pro Ser Glu Leu Val Ala Gly Asp Val Ile Lys Ile Gly
420 425 430
Val Ile Ala Gly Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr
435 440 445
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
450 455 460
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
465 470 475 480
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
485 490 495
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser
500 505 510
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Met Asp
515 520 525
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe
530 535 540
Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala
545 550 555 560
Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro
565 570 575
His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met
580 585 590
Thr Leu Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Ser Gly
595 600 605
Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met
610 615 620
Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
625 630 635 640
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
645 650 655
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
660 665 670
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Leu Glu
675 680
<210> 7
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LolC-K6构建体
<400> 7
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu
65 70 75 80
Gly Ser Ala Leu Gly Val Ala Ala Leu Ile Val Val Leu Ser Val Met
85 90 95
Asn Gly Phe Gln Lys Glu Val Arg Asp Arg Met Leu Ser Val Leu Ala
100 105 110
His Val Glu Ile Phe Ser Pro Thr Gly Ser Met Pro Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Thr Ala Lys Glu Ala Arg Leu Asn Arg Ser Val Ile Gly Ala Ala Pro
130 135 140
Tyr Val Asp Ala Gln Ala Leu Leu Thr Arg Gln Asp Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Val Met Leu Arg Gly Val Glu Pro Ser Leu Glu Pro Gln Val Ser Asp
165 170 175
Ile Gly Lys Asp Met Lys Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Pro Gly
180 185 190
Gln Phe Gly Ile Val Leu Gly Asn Ala Leu Ala Gly Asn Leu Gly Val
195 200 205
Gly Val Gly Asp Lys Val Thr Leu Val Ala Pro Glu Gly Thr Ile Thr
210 215 220
Pro Ala Gly Met Met Pro Arg Leu Lys Gln Phe Thr Val Val Gly Ile
225 230 235 240
Phe Glu Ser Gly His Tyr Glu Tyr Asp Ser Thr Leu Ala Met Ile Asp
245 250 255
Ile Gln Asp Ala Gln Ala Leu Phe Arg Leu Pro Ala Pro Thr Gly Val
260 265 270
Arg Leu Arg Leu Thr Asp Met Gln Lys Ala Pro Gln Val Ala Arg Glu
275 280 285
Leu Ala His Thr Leu Ser Gly Asp Leu Tyr Ile Arg Asp Trp Thr Gln
290 295 300
Gln Asn Lys Thr Trp Phe Ser Ala Val Gln Ile Glu Lys Arg Met Met
305 310 315 320
Phe Ile Ile Leu Thr Leu Ile Ile Ala Val Ala Ala Phe Asn Leu Val
325 330 335
Ser Ser Leu Val Met Thr Val Thr Asn Lys Gln Ala Asp Ile Ala Ile
340 345 350
Leu Arg Thr Leu Gly Ala Gln Pro Gly Ser Ile Met Lys Ile Phe Val
355 360 365
Val Gln Gly Val Thr Ile Gly Phe Val Gly Thr Ala Thr Gly Val Ala
370 375 380
Leu Gly Cys Leu Ile Ala Trp Ser Ile Pro Trp Leu Ile Pro Met Ile
385 390 395 400
Glu His Ala Phe Gly Val Gln Phe Leu Pro Pro Ser Val Tyr Phe Ile
405 410 415
Ser Glu Leu Pro Ser Glu Leu Val Ala Gly Asp Val Ile Lys Ile Gly
420 425 430
Val Ile Ala Gly Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr
435 440 445
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
450 455 460
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
465 470 475 480
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
485 490 495
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser
500 505 510
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Met Asp
515 520 525
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe
530 535 540
Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala
545 550 555 560
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