新颖细胞穿透肽、其与肉毒杆菌毒素的缀合物以及其用途的制作方法

本发明涉及新颖的细胞穿透肽，细胞穿透肽缀合到肉毒杆菌毒素的轻链的一个末端的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白，及其用途。

背景技术：

肉毒杆菌毒素是由革兰氏阳性厌氧菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素，其生长于变质罐装食品或变质肉类中。肉毒杆菌毒素分类成8种类型的神经毒素，其中七种类型(A,B,C,D,E,F,G)可诱发神经麻痹。肉毒杆菌毒素的大小为约150kDa，且形成肉毒杆菌毒素蛋白质和非毒素蛋白质的复合物。所述大小的每一种复合物被形成，以根据神经毒素的类型，具有多达900kDa的大小。作用类型和靶点以及活性持续期间可根据肉毒杆菌毒素类型的不同而有所不同，且所述肉毒杆菌毒素类型A被认为是致命的生物制剂。

肉毒杆菌毒素通过阻断诱导肌肉痉挛或收缩的信号而引起麻痹，且由于这项功能，其自从在1989年被FDA批准以来被用于医学治疗或美容目的。对于医学治疗，肉毒杆菌毒素被用作为用于医疗目的的注射剂，以治疗神经肌肉障碍，例如斜视、斜颈或眼睑痉挛；用于美容目的的注射剂，用以减少皱纹、皱眉或眉间线(glabellar lines)和方颌；以及用于其它目的的注射剂，用以治疗多汗症或偏头痛。由于尚未见有关死亡直接是由肉毒杆菌毒素所引起的报导，尽管已报导了肉毒杆菌毒素具有副作用，包括吞咽困难、变声、口干症和视力模糊，但是在适当使用的情况下，肉毒杆菌毒素被评价为非常安全的药物。然而，在对药物产生超敏反应的人或患有肌骨病的人或者孕妇或哺乳期女性的情况下，肉毒杆菌毒素的使用受到限制。

在肉毒杆菌毒素的目前应用中，注射入皮肤组织的肉毒杆菌毒素的持续时间持续大约3-6个月，且在神经和肌肉之间的信号转导受到肉毒杆菌毒素阻断时，产生新的树状突起以减少由肉毒杆菌毒素引起的神经麻痹作用，因而需要定期治疗(regular treatment)。而且，在重复施用肉毒杆菌毒素时，在体内产生针对所述肉毒杆菌毒素的抗体，因此其效果被减少。

而且，由于主要是由注射诱发通过这样的肉毒杆菌毒素引起的肌肉麻痹，因此已进行多种研究以寻找能为使用者提供便利的不同的有效递送方式，然而其仍是不适宜的。

同时，经常接触外部环境的身体结构，即皮肤，起着作为保护屏障的重要作用，防止体液释放和预防感染，以及水分丢失，且其是由表皮、真皮和皮下组织组成。表皮的角质层存在于皮肤的最外部，并通过抑制水分和电解质从皮肤流失预防皮肤干燥，以及提供促进皮肤正常生物化学代谢的环境。而且，所述皮肤角质层起着保护身体免受外部物理损害和化学品损害，以及防止细菌、霉菌或病毒侵入皮肤。

有三种通过皮肤的吸收途径，包括通过角质层的吸收，通过毛囊和皮脂腺的吸收，以及通过汗腺的吸收，并且，在皮肤的结构和物理特征方面，通过皮肤递送活性物质具有许多局限性。特别是，由于角化细胞(皮肤的主要组成细胞)的自然死亡，皮肤角质层在皮肤的最外层具有致密结构，并且由于汗液和多种脂质成分而显示出大约pH 5的酸性。为了通过这样的角质层屏障，已报导活性物质应通常具有小至1000或以下的分子量，并具有亲脂特性。

尽管常常被用作为美容成分或医药成分的低分子量合成化合物或天然物质已知容易被递送入细胞，但是由于诸如蛋白质、肽和核酸之类的大分子由于分子量的大小和亲水性而难以穿透具有双层脂质膜结构的细胞膜，因此已知的是，由于基本上构成皮肤屏障的所述角质层的内在特性，低分子量物质具有极低的穿透效率，且高分子量物质具有甚至更低的穿透效率。

因此，对于肉毒杆菌毒素的透皮递送，需要一种可递送肉毒杆菌毒素通过皮肤屏障的载体。作为增强将小分子和大分子传送通过细胞质膜的效率的方法，可应用蛋白转导结构域(PTD)。首先，众所周知的PTD是例如HIV-Tat、触角足突变(antennapedia)等的PTD，其已知是正电荷短肽，递送DNA、RNA、脂质、碳水化合物、化合物或病毒以及蛋白质进入细胞。已报导PTD是非受体依赖性的，并根据例如内吞作用或吞噬作用之类的机制穿透细胞膜。在PTD的漫长历史中，已经尝试过多种采用PTD的应用，但是已知的是至今为止未有成功的开发案例。在HIV-Tat-来源的PTD中，肽来源于病毒，在安全性方面存在问题，并且尤其是在独立使用这样的PTD家族转导结构域时，已知根据转导结构域的种类，胞内转导率快速降低至2至5μM或更低的低浓度。并且，也已经报导了在具有30,000Da或更大的分子量的蛋白缀合至待转导入细胞的PTD时，大部分的PTD-蛋白缀合物容易以内体的形式通过内吞作用被转导入所述细胞，并且已经报导内体结合细胞质中的溶酶体，因此，大部分PTD-蛋白缀合物通过存在于所述溶酶体的水解酶降解，且仅一些未受损的PTD-蛋白缀合物被释放入所述细胞质。因此，对于采用PTD的功能蛋白的皮肤转导，需要大量的PTD-蛋白缀合物以表现预期的功效，这将在经济可行性方面带来不期望的结果。

为了解决这样的PTD问题并增加药理价值，开发了来源于传统PTD的具有不同特性的疏水性或两亲性肽，一种大分子转导结构域(MTD；韩国专利号KR10-1258279)。MTD是一种新颖的细胞穿透肽，具有增强的将物质递送入细胞的效率，并相比于PTD，具有不同的结构和不同的静电性质。与PTD不同的是，在MTD的细胞内转导过程中，不需要内吞作用和能量，细胞膜的刚性和完整性作为重要因素。因此，已建议与细胞膜的直接相互作用对于MTD的细胞内转导过程是至关重要的。这样的肽的细胞膜穿透现象可提升开发价值为通过细胞内转导治疗蛋白或诸如DNA或siRNA之类的核酸物质的新颖治疗药物，所述治疗蛋白或诸如DNA或siRNA之类的核酸物质由于短的体内半衰期或难以细胞膜穿透而难以被用作为药物。而且，相比于传统的细胞穿透肽(其是HIV-Tat-来源的肽)，确定了MTD由于高效率递送诸如化合物、肽或蛋白质之类的负荷物质，因而在开发肉毒杆菌毒素作为外用剂方面具有高度可利用性。

而且，由于在本发明中寻求的皮肤穿透的和神经末端细胞穿透肉毒杆菌毒素的轻链或轻链衍生物的数量应被限制至1-10ppm的浓度，以通过甚至毒性降低方法确保安全性，因此，似乎PTD不适合用作为皮肤穿透工具和神经细胞穿透工具。为了解决该问题，需要利用一种具有皮肤屏障穿透和神经细胞穿透潜能并且甚至在低浓度时浓度依赖性地透过所述皮肤屏障的MTD，或者需要开发一种具有上述特性的新颖MTD。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明涉及提供来源于肉毒杆菌毒素的重链转位结构域的新颖细胞穿透肽，其能介导生物活性分子的细胞内递送，其中所述细胞穿透肽被设计成有效地输送由于分子量和如上所述的皮肤角质层的内在特性而难以被递送通过所述皮肤的肉毒杆菌毒素蛋白，以及被设计成递送所述输送的肉毒杆菌毒素蛋白至存在于皮肤组织中的神经细胞。

本发明还涉及提供细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白，其中所述细胞穿透肽缀合肉毒杆菌毒素的一个或两个末端。

本发明还涉及提供包含作为活性成分的所述肉毒杆菌毒素重组蛋白的组合物，更特别的是，提供一种促进透皮递送所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的组合物，且其能局部应用于多种皮肤治疗和美容目的。

然而，本发明解决的技术问题不局限于上述问题，且本领域技术人员通过参考以下的说明将更清楚理解未提及的其它问题。

[技术方案]

本发明提供用于介导生物活性分子的细胞内递送的肽，其是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透肽。

本发明提供编码所述的肽的多核苷酸。

在本发明的一示例性实施方式中，所述多核苷酸可由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。

本发明提供细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白，其中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透肽缀合肉毒杆菌毒素轻链的一或两个末端。

在本发明的一示例性实施方式中，所述肉毒杆菌毒素重组蛋白可由选自SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成。

在本发明的另一示例性实施方式中，所述肉毒杆菌毒素的轻链可由选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。

还在本发明的另一示例性实施方式中，所述肉毒杆菌毒素的轻链可进一步在一个末端包括六聚组氨酸标签。

仍在本发明的另一示例性实施方式中，所述肉毒杆菌毒素的轻链可选自肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。

仍在本发明的另一示例性实施方式中，所述缀合可以是将所述细胞穿透肽缀合至所述肉毒杆菌毒素的轻链的羧基末端或氨基末端或其两个末端。

仍在本发明的另一示例性实施方式中，可通过肽键或共价键构建所述缀合。

本发明提供编码所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的多核苷酸。

在本发明的一示例性实施方式中，所述多核苷酸可由选自SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:86的核苷酸序列组成。

本发明提供包含所述的多核苷酸的重组表达载体。

在本发明的一示例性实施方式中，所述重组表达载体可包括亲和标签，所述亲和标签选自：His，HAT，FLAG，c-myc，SBP，几丁质缀合结构域，谷胱甘肽-S转移酶和麦芽糖缀合蛋白质。

本发明提供用所述的重组表达载体转化的细菌。

本发明提供药物组合物，其包括所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白和药学上可接受的载体，以治疗选自以下的疾病：面肌痉挛，眼皮痉挛，斜颈，眼睑痉挛，颈部肌张力障碍，口咽部肌张力障碍，痉挛性发音障碍，偏头痛，肛门瘙痒症和多汗症。

在本发明的一示例性实施方式中，所述药物组合物用于透皮给药。

本发明提供皮肤外用剂组合物，其包括作为活性成分的所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白。

本发明提供美容组合物，其包括作为活性成分的所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白。

在本发明的一示例性实施方式中，所述组合物可被应用以改善皱纹、方颌和尖下颌、损伤、皮肤软化、疤痕、痤疮、毛孔、弹性或瘢痕瘤。

本发明提供治疗选自面肌痉挛、眼皮痉挛、斜颈、眼睑痉挛、颈部肌张力障碍、口咽部肌张力障碍、痉挛性发音障碍、偏头痛、肛门瘙痒症和多汗症的疾病的方法，所述方法包括将所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白透皮施用入受试者。

本发明提供用于改善皱纹、方颌和尖下颌、损伤、皮肤软化、疤痕、痤疮、毛孔、弹性或瘢痕瘤的方法，所述方法包括将所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白透皮施用入受试者。

本发明提供所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白用于治疗选自面肌痉挛、眼皮痉挛、斜颈、眼睑痉挛、颈部肌张力障碍、口咽部肌张力障碍、痉挛性发音障碍、偏头痛、肛门瘙痒症和多汗症的疾病的用途。

本发明提供所述的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白用于改善皱纹、方颌和尖下颌、损伤、皮肤软化、疤痕、痤疮、毛孔、弹性或瘢痕瘤的用途。

本发明提供用于生产细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的方法，其包括培养所述的转化细菌。

[有益效果]

肉毒杆菌毒素通过阻断诱导肌肉痉挛或收缩的信号而引起麻痹。现如今，由于这样的由肉毒杆菌毒素引起的肌肉麻痹，肉毒杆菌毒素应用于医学治疗眼睑痉挛、痉挛、偏头痛、颞下颌关节紊乱症、多汗症等，以及应用于美学和美容领域，用于皱纹改善、毛孔缩小、痤疮、弹性增强和方颌缩小。然而，由于至今为止没有有效的透皮递送方式，通常想要获得这样的效果的人们只能依靠注射。为此，肉毒杆菌毒素的非注射局部应用将是更安全且优选的治疗替代。因此，本发明的细胞穿透肽-肉毒杆菌毒素重组蛋白可通过皮肤细胞和神经细胞的多个层，并切割神经细胞的SNARE蛋白，从而显示其活性，且由于所述重组蛋白显著小于通常的肉毒杆菌毒素，可显著降低产生抗体的可能性，因此根据中和抗体的形成而使功效下降可被减少。

而且，由于本发明的所述细胞穿透肽-肉毒杆菌毒素重组蛋白可被透皮递送，因此所述细胞穿透肽-肉毒杆菌毒素重组蛋白具有肉毒杆菌毒素的内在功效以及扩展的易接近性，因而可有效地用作为用于治疗多种疾病、美学和/或美容目的局部激动剂。

另外，尽管甚至若干皮克(pg)的肉毒杆菌毒素类型A表现严重的毒性，但是对本发明的细胞穿透肉毒杆菌毒素进行减毒，以表现在微克(μg)水平的毒性，从而可确保足够的安全性，免受肉毒杆菌毒素的毒性作用。

附图说明

图1是显示细胞穿透肽TD1的特性的表格。

图2举例说明了所述细胞穿透肽TD1的结构。

图3a和3b显示通过流式细胞分析评价的针对角化细胞(HaCaT细胞)的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图3c显示了通过流式细胞分析评价的针对成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图3d显示了通过流式细胞分析评价的针对神经细胞(U-87MG细胞)的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图3e显示了通过流式细胞分析评价的针对HeLa细胞的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图4a显示了通过共聚焦显微镜评价的针对角化细胞(HaCaT细胞)的所述细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图4b显示了通过共聚焦显微镜评价的针对成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图4c显示了通过共聚焦显微镜评价的针对神经细胞(U-87MG细胞)的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图4d显示了通过共聚焦显微镜评价的针对HeLa细胞的细胞穿透肽TD1的体外穿透潜能。

图5是举例说明纯化与细胞穿透肽TD1缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的方法的示意图。

图6显示了通过SDS-PAGE评价的经纯化的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的纯度和分子量。

图7a显示了通过流式细胞分析评价的针对成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外穿透潜能。

图7b显示了通过共聚焦显微镜评价的针对成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外穿透潜能。

图7c显示了通过共聚焦显微镜评价的针对角化细胞(HaCaT细胞)的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外穿透潜能。

图8显示了针对合成皮肤替代品的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的穿透潜能。

图9显示了通过SDS-PAGE评价的经纯化的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外SNAP25切割活性。

图10a显示了针对角化细胞(HaCaT细胞)的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外SNAP25切割活性。

图10b显示了针对成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外SNAP25切割活性。

图11a显示了在角化细胞(HaCaT细胞)中所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的细胞毒性。

图11b显示了在成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的细胞毒性。

图12显示了通过SDS-PAGE评价的随着储存期所述经纯化的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的稳定性。

图13显示了由委托研究机构评价的被配制成美容剂的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的安全性和皮肤刺激性实验结果。

图14a、14b和14c显示了由委托研究机构评价的被配制成美容剂的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的临床功效。

图15显示了由委托研究机构评价的针对鼻唇褶的被配制成美容剂的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的临床功效。

具体实施方式

本发明提供一种新颖的细胞穿透肽，和使用其进行透皮递送肉毒杆菌毒素轻链的组合物和方法。根据本发明，确定了开发的新颖的细胞穿透肽TD1适合作为能通过局部应用合适的药剂透皮施用肉毒杆菌毒素的轻链的转导系统。

尽管表达为一个多肽，但是肉毒杆菌毒素通过在表达后重构被分成约100kDa的重链(H)和约50kDa的轻链(L)，其通过二硫键连接。所述H链连接至神经细胞受体，以允许肉毒杆菌毒素通过内吞作用进入细胞。已进入所述细胞的肉毒杆菌毒素的轻链从内体释放，然后输送入细胞质。肉毒杆菌毒素切割所述细胞质中的SNARE蛋白，以抑制乙酰胆碱释放，导致肌肉麻痹。因此，可仅由L链抑制乙酰胆碱从所述神经细胞的释放，且所述H链和L链可彼此独立地发挥作用。基于此，尝试开发一种透皮递送系统，其仅使用具有肌肉麻痹效果的L链。

然而，具有50kDa的分子量的肉毒杆菌毒素的单独轻链不能通过所述细胞膜，因此，不能独自地适当发挥作用。通常，为了通过将所述肉毒杆菌毒素的轻链递送入所述神经细胞的细胞质来显示特定的肉毒杆菌毒素活性，明确需要大约100kDa的肉毒杆菌毒素的重链的辅助。肉毒杆菌毒素的重链由两个结构域组成，例如神经细胞膜的受体结合结构域以及结合进入所述细胞膜的转位结构域，以促进所述轻链的转位。

在本发明中，作为研究用于有效递送肉毒杆菌毒素(更特别的是，肉毒杆菌毒素的轻链)进入所述皮肤并到达神经细胞的方法的结果，一种促进细胞内转导的新颖的细胞穿透肽已通过对所述肉毒杆菌毒素的重链的结构分析被开发获得。

首先，通过对肉毒杆菌毒素的重链的转位结构域的三维结构进行in silico分析，提取和选择有机会被开发为细胞穿透肽的蛋白结合位点的序列。随后，进行若干次包括移除或替代氨基酸的模拟方法，所述移除或替代氨基酸是为了将穿透潜能赋予通过将来源于若干蛋白质释放所涉及的信号蛋白或病毒蛋白的肽的序列与传统的穿过所述细胞膜以介导输送诸如蛋白质之类的大分子进入所述细胞的大分子转导结构域(MTD；韩国专利号KR10-1258279)进行比较而选择的序列。所述肽通过设置两亲性极性氨基酸提高细胞膜易接近性，改善物理性质和溶解性，通过添加非极性氨基酸获得用于穿透进入所述细胞膜的合适的疏水性，从而开发新颖的细胞穿透肽，并且证实了所述新颖的细胞穿透肽具有针对人角化细胞和神经细胞二者的穿透潜能，因此，实现本发明。

因此，本发明提供一种新颖的细胞穿透肽，且更特别地，能介导细胞内递送生物活性分子的肽，其是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成的细胞穿透肽。

在本发明中，所述新颖的细胞穿透肽是能介导细胞内递送生物学活性分子的肽，命名为“TD1”。

本发明的所述细胞穿透肽TD1：

1)由13个氨基酸组成；

2)具有约1537Da的分子量；

3)具有的理论pI是9.31；且

4)是在60％或以上的片段中具有疏水性氨基酸组成的两亲性肽；

5)具有为评价序列稳定性而使用ProtParam程序(参见http://web.expacy.org/protparam)分析的不稳定指数为49.65；

6)具有的脂肪族氨基酸指数(aliphatic index)为97.69，以评价分子的总体积；

7)在所述肽的聚集方面得到改善，这是因为总平均亲水性(GRAVY)被评价为0；且

8)具有的序列具有根据基于支持向量机(SVM)分类算法的用于预测所述细胞穿透肽的分析的SVM值，为-0.15。

在本发明中，所述细胞穿透肽本身可能不具有限定的酶活生物治疗活性，但是起到促进通过所述细胞膜的细胞内转导的载体的作用。所述肽可连接至被转位进入细胞的负载物的N-末端或C-末端或两个末端，并可连接至在正向或反向方向上每一个末端。而且，根据本发明的所述肽优选是单体，但是本发明不局限于此，也可以是二聚体或多聚体。而且，本发明的所述肽可以是包含作为最小单元的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。通过添加一或多个氨基酸至根据本发明的所述肽序列TD1的一个或两个末端，可改变细胞膜易接近性、穿透潜能和物理性质。优选地，选择氨基酸，以具有25％至75％的疏水性，且在纯化所述重组蛋白的过程中发生团聚时可进一步添加具有亲水性的序列。

在本发明的另一方面，本发明提供编码所述肽的多核苷酸。也就是说，所述多核苷酸可编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透肽，以及可由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成，但是本发明不局限于此。

根据本发明的所述多核苷酸可以是RNA或DNA，并且所述DNA包括cDNA和合成DNA。所述DNA可以是单链或双链。单链DNA可以是编码链或非编码(反义)链。所述编码序列可以与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相同或不同。通过遗传密码简并或冗余获得所述编码序列，并可编码相同的多肽。

在本发明的一示例性实施方式中，证实了所有的角化细胞(HaCaT细胞)、成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞和U-87MG细胞)以及HeLa细胞均显示了根据本发明的所述细胞穿透肽TD1的相当优越的细胞穿透潜能(参见实施例2和3)。

在本发明的另一方面，本发明提供细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白，其中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透肽缀合肉毒杆菌毒素的轻链的一个或两个末端。

在本发明中，术语“细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白”是指包含新颖的细胞穿透肽TD1和肉毒杆菌毒素的轻链的缀合物，其通过肽键或共价键化学连接。也就是说，通过将特定细胞穿透肽与肉毒杆菌毒素的轻链(其是大分子，难以被引入细胞)缀合以提供细胞穿透潜能，所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白以高效率将肉毒杆菌毒素的轻链递送入所述细胞。在这一点上，可在所述细胞穿透肽与肉毒杆菌毒素的轻链的羧基末端、氨基末端或这两个末端之间制备所述缀合物。

在本发明中，术语“肉毒杆菌毒素”是指已知种类的肉毒杆菌毒素，而不管随后发现其通过细菌或重组技术被制备或包含操作的变体或缀合的蛋白。

在本发明中，肉毒杆菌毒素的轻链可以选自肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。在这一点上，肉毒杆菌毒素的轻链可由选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。并且，可进一步在一个末端上包括六聚组氨酸标签。

在本发明中，肉毒杆菌毒素的轻链可替代地为肉毒杆菌毒素衍生物，即，具有肉毒杆菌毒素活性但在任意部分或序列中具有一或多个变体的化合物。例如，相比于肉毒杆菌毒素的七种血清型的轻链蛋白，可通过在氨基酸序列中缺失、修饰、替代或嵌合融合来改变肉毒杆菌毒素的轻链，以保持所述轻链的肽链内切酶活性、增强特性或减少副作用。而且，可使用通过重组或化学合成制备的肉毒杆菌毒素的轻链或其一部分。

在本发明中，所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白可由选自SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成，且编码所述重组蛋白的多核苷酸可由选自SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:86的核苷酸序列组成，但是本发明不局限于此。

在本发明的另一示例性实施方式中，证实了根据本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白显示了针对角化细胞(HaCaT细胞)、成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞和U-87MG细胞)以及合成皮肤替代品(Strat-M^TM)的显著优越的细胞穿透潜能(参见实施例6和7)。

还在本发明的另一方面，本发明提供重组表达载体，其包括编码细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的多核苷酸。

在本发明中，术语“重组表达载体”是指能在合适宿主细胞中表达靶蛋白或靶DNA的载体，其是包含可操作连接以表达基因插入片段的必要调控因子的基因构建物。

在本发明中，术语“可操作连接”是指核酸表达调控序列与编码靶蛋白或RNA的核酸序列的功能性连接，以实施通常功能。例如，启动子可操作地连接至编码蛋白或RNA的核酸序列，以影响所述编码核酸序列的表达。可使用本领域熟知的基因重组技术实现与所述重组表达载体的可操作连接，且位点特异性DNA切割和连接使用本领域通常已知的酶。

可在本发明中使用的表达载体包括血浆载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体，但是本发明不局限于此。根据目的，可制备多种合适的表达载体以包含用于膜靶向或释放的信号序列或前导序列以及表达调控序列，例如启动子、操作子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号或增强子。所述表达载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。而且，所述表达载体可包含用于选择包含载体的宿主细胞的选择性标记，并在可复制表达载体的情况下包含复制起始点。并且，所述表达载体还可包含亲和标签，所述亲和标签选自：His，HAT，FLAG，c-myc，SBP，几丁质缀合结构域，谷胱甘肽-S转移酶和麦芽糖缀合蛋白质。

仍在本发明的另一方面，本发明提供通过所述重组表达载体转化的经转化细菌。

仍在本发明的另一方面，本发明提供用于生产细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的方法，其包括培养所述经转化的细菌。

所述生产方法通过以下实施：在合适条件下在合适培养基中培养所述经转化的细菌，以表达在被引入本发明的所述经转化细胞中的所述重组表达载体中的编码本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的多核苷酸。通过培养所述经转化的细菌表达重组蛋白的方法是本领域已知的，且例如，所述方法可包括通过以下诱导蛋白表达：将经转化的细菌接种于用于生长经转化细菌的合适的培养基以培养接种菌，以及在合适的条件下(例如在基因表达诱导物(例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))的存在下)在培养基中培养所述接种菌。在培养后，可从培养产物收集到基本上纯的重组蛋白。在本发明中，术语“基本上纯”是指本发明的所述重组蛋白的序列和编码所述重组蛋白的多核苷酸基本上不包含来源于宿主细胞的另一种蛋白。

从所述经转化的细菌表达的所述重组蛋白的采集可通过本领域中已知的各种分离和纯化方法来实施，并且在对细胞裂解物离心以常规移除细胞碎片、培养基杂质等之后，可进行沉淀，例如盐析(硫酸铵沉淀和硫酸钠沉淀)、溶剂沉淀(采用丙酮、乙醇或异丙醇的蛋白部分沉淀)；透析；电泳；或多种柱色谱法。作为所述色谱法，离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、HPLC、反相-HPLC、吸附色谱法、亲和柱层析法和超滤可单独使用或组合使用。

同时，根据蛋白被分离时所述蛋白的特性，在通过所述重组表达载体转化的细菌中表达的所述重组蛋白可被分成可溶部分和不可溶部分。当大部分所述表达的蛋白是在可溶部分中时，可容易地通过上述方法分离和纯化所述蛋白，但是当大部分所述表达的蛋白存在于不可溶部分时，即包涵体，可采用包含尽可能多的蛋白变性剂(例如尿素或表面活性剂)的溶液溶解所述蛋白，离心，然后通过透析、电泳和用多种类型树脂填充的柱色谱法纯化。在本文中，由于所述蛋白结构被包含蛋白变性剂的所述溶液改变并丧失其活性，因此在从所述不可溶部分纯化所述蛋白的方法中需要脱盐和再折叠步骤。也就是说，在脱盐和再折叠步骤中，可实施采用不含蛋白变性剂的溶液的透析和稀释步骤或者采用过滤器的离心步骤。而且，甚至在从所述溶液部分纯化所述蛋白的方法中，当在所述纯化方法中使用的所述溶液的盐浓度是高浓度时，可实施这样的脱盐和再折叠步骤。

同时，还在本发明的另一示例性实施方式中，作为评价根据本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的功效的结果，已证实了甚至根据本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)具有肉毒杆菌毒素的活性，以及具有与肉毒杆菌毒素相同的功能(参见图8和9)。而且，已证实了人角化细胞(HaCaT细胞)和成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)不显示细胞毒性(参见实施例10)，但是也显示高的稳定性(参见实施例11)。因此，根据本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)可以更有效地用作为用于治疗多种疾病和美学和/或美容目的的局部激动剂。

因此，还在本发明的另一方面，本发明提供用于治疗选自以下的疾病的药物组合物：面肌痉挛，眼皮痉挛，斜颈，眼睑痉挛，颈部肌张力障碍，口咽部肌张力障碍，痉挛性发音障碍，偏头痛，肛门瘙痒症和多汗症，其包括作为活性成分的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白。本发明的所述药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体，以及作为活性成分的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白。在本文中，在本发明的所述药物组合物中包含的所述药学上可接受的载体可以是盐水(saline)、缓冲盐水、水、甘油或乙醇，但是本发明不局限于此，并且也可以采用本领域已知的所有合适的剂。

还在本发明的另一方面中，本发明提供用于皮肤外用剂组合物或美容组合物，其包括肉毒杆菌毒素重组蛋白作为活性成分。所述组合物可应用于减少皱纹，缩小方颌和尖下颌，用于治疗损伤，软化皮肤，治疗疤痕、痤疮和毛孔，提升弹性或治疗瘢痕瘤症状，但是本发明不局限于此。有效量的根据本发明的所述组合物可被递送以诱导皮肤下面的肌肉或前结构麻痹，以减少或减轻收缩，或者提供不同的期望的美容效果。

在本发明的另一示例性实施方式中，作为评价根据本发明的所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白的皱纹改善功效的结果，已证实了所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白在持续使用4周时有助于改善鼻唇褶和皮肤弹性(参见实施例13)。

本发明的美容组合物可以被制备成本领域常规制备的任意剂型，例如溶液剂，混悬液，乳剂，糊剂，凝胶剂，霜剂，洗剂，粉剂，皂剂，含表面活性剂的清洁剂，油，粉体型粉底，乳液型粉底，或蜡型粉底(wax foundation)，但是本发明不局限于此。更具体地，所述美容组合物可被制备成以下剂型：软化剂，滋养化妆水，营养霜，按摩霜，精华液，眼霜，清洁霜，清洁泡沫，卸妆水，面膜(pack)或粉末。

在本发明所述美容组合物中包含的美容上有效的载体可以是在本领域中通常使用的载体。当本发明的所述制剂是糊剂、霜剂或凝胶剂时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌作为载体成分。

当本发明的所述制剂是溶液剂或乳剂时，溶剂、增溶剂或乳化剂被用作为载体成分，以及，例如使用了水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

当本发明的所述制剂是混悬液时，可使用液体稀释剂(例如水，乙醇或丙二醇)，助悬剂(例如羟乙基化的异硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)，微晶纤维素，氢氧化铝氧化物(aluminum methahydroxide)，膨润土，琼脂或西黄蓍胶作为载体成分。

当本发明的所述制剂是含表面活性剂的清洁产品时，可使用脂肪醇硫酸盐，脂肪醇醚硫酸盐，磺基琥珀酸单酯，羟乙基磺酸盐，咪唑啉衍生物，甲基牛磺酸盐，肌氨酸盐，脂肪酰胺醚硫酸盐，烷基酰氨基甜菜碱，脂肪醇，脂肪族甘油酯，脂肪族二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基脂肪酸甘油酯作为载体成分。

本发明的美容组合物除了所述活性成分和所述载体成分之外还可包括在美容组合物中通常使用的成分，且所述成分可以是，例如保湿剂，抗氧化剂，芳香剂，填充剂，增稠剂，染料，着色剂，表面活性剂，天然油或合成油，防腐剂，渗透剂，可湿性粉剂，抗真菌剂，乳化剂溶剂，软化剂，除臭剂和蜡。本发明的美容组合物可选择性地包括在所述产品本身中通常使用的其它成分，包括植物提取物，调节剂，色素或增白剂，紫外线防护剂，润湿剂，维生素及其衍生物。

还在本发明的另一方面，本发明提供用于治疗选自以下的疾病的方法：面肌痉挛、眼皮痉挛、斜颈、眼睑痉挛、颈部肌张力障碍、口咽部肌张力障碍、痉挛性发音障碍、偏头痛、肛门瘙痒症和多汗症，或者提供一种用于改善皱纹、缩小方颌和尖下颌、损伤、皮肤软化、疤痕、痤疮、毛孔、弹性或瘢痕瘤症状的方法，其包括局部施用所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白至受试者。在本发明中，术语“受试者”是指需要治疗疾病或皮肤改善的靶对象，且更具体地，是哺乳动物，例如人类或非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马或牛。

在本发明中使用的术语“局部施用”是指将药物直接施用在动物躯体上或进入需要所述药物的生物学效应的所述躯体内，或所述区域的周围。所述局部施用不包括诸如静脉施用或口服施用的全身性施用。所述“外用施用”被包括作为用于将药剂应用至人类皮肤的一种局部施用。本发明的所述组合物可以透皮施用以皮肤学和美容学上期望的效果。

在本发明的所述组合物中，总有效量的本发明的所述重组蛋白可以按一次给药剂量(single dose)向患者给药，也可以根据分次治疗方法(fractionated treatment protocol)以多次给药剂量(multiple dose)向患者给药，且所述活性成分的含量可根据症状的严重程度而有所不同。这足以带来期望的肌肉麻痹或生物学或美学效果，但是参考固有的安全用量。然而，可通过考虑诸如患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率以及给药途径和治疗数量之类的多种因素来确定所述重组蛋白的有效给药量。

在下文中，将提供示例性实施例，以帮助理解本发明。然而，以下实施例仅被提供用于更容易理解本发明，且本发明的范围不受限于以下实施例。

[实施例]

实施例1.构建新颖的细胞穿透肽

开发新颖的皮肤穿透和细胞穿透肽，其能透皮递送肉毒杆菌毒素的轻链。首先，分析肉毒杆菌毒素的重链和轻链的结构和功能，并基于重链在肉毒杆菌毒素类型A穿透进入神经细胞时起着重要作用的事实选择序列。而且，相比于常规的MTD序列，通过增加细胞膜易接近性的方法设计由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的新颖的细胞穿透肽，所述方法通过设置两亲性极性氨基酸、改善物理性质和溶解性以及通过添加非极性氨基酸提供用于所述细胞膜穿透的合适的疏水性来实施。根据上面所描述的设计的细胞穿透肽命名为TD1，并采用ProtParam程序(http://web.expacy.org/protparam)分析其特性和结构，结果显示于图1和图2。

实施例2.采用流式细胞分析证实细胞穿透肽TD1的体外细胞穿透潜能

采用流式细胞分析进行实验，以证实根据实施例1构建的新颖的细胞穿透肽TD1针对皮肤细胞和神经细胞的穿透潜能。为了比较所述细胞穿透肽TD1的细胞穿透性质，使用先前开发的细胞穿透肽，kFGF4，以及代表性蛋白转位结构域(PTD)，HIV-Tat，作为对照MTD，且每种肽样本用FITC进行荧光标记并通过肽合成的专业组织(GL Biochem Ltd.(上海,中国))合成。

2.1定量分析在角化细胞(HaCaT细胞)中的细胞穿透潜能

为了证实在角化细胞HaCaT细胞中的细胞穿透潜能，使用DMEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养HaCaT细胞。为了流式细胞分析，所述细胞被转移至12-孔板，并进一步培养16至24小时。每一种样本被添加至在未添加FBS的无血清培养基(在本文中是指无FBS培养基)中的细胞中，持续1小时(处理浓度：5μM,10μM)以及3小时(处理浓度：2.5μM,5μM,10μM)。反应之后，用DPBS洗涤所述细胞两次，以除去样本残留物，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理，以及在遮蔽光源下反应10分钟，接着用完全培养基灭活胰蛋白酶-EDTA。随后，将所述细胞收集在制备管中，用3mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理，然后以2000rpm离心3分钟。在除去上清液之后，将200μL的PBS添加至每一个FACS管，充分再悬浮所述细胞，以进行流式细胞分析。使用仅细胞和仅FITC，错配的肽(Scramble peptide)和HIV-Tat以及kFGF4-衍生的肽作为实验组，并且相比于被认为不具有细胞穿透潜能的打乱的肽，确定HIV-Tat、kFGF4-衍生的肽和所述细胞穿透肽TD1的转导潜能。结果显示于图3a和图3b中，已证实相比于所述对照组，所述细胞穿透肽TD1在角化细胞中显示了显著优越的细胞穿透潜能。

2.2定量分析在成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中的细胞穿透潜能

证实了针对SiMa细胞(其为成神经细胞瘤细胞)的细胞穿透潜能。由于对培养皿细胞粘附低，所述SiMa细胞使用了用明胶(Sigma-Aldrich,G2500)包被的培养皿，所述用明胶包被的培养皿通过向其施加0.1％明胶溶液，1小时后在室温除去所述溶液，以及干燥所述皿来制备。在作为完全培养基的RPMI1640(10％FBS,1％青霉素/链霉素)中传代培养所述SiMa细胞至80％或更高的汇合。通过重复传代培养稳定化所述细胞，并以5×10⁵/孔/100mm培养皿接种，在培养器中在5％CO₂气氛中在37℃培养过夜，然后进行实验。

将每一种样本(参考物质：仅细胞，仅FITC，比较物质：HIV-Tat&kFGF4-衍生肽，实验物质：TD1)以5μM添加至在无FBS-培养基中的细胞，将所述细胞孵育1小时和6小时。反应后，用DPBS洗涤所述细胞两次，以除去样本残留物，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理，以及在遮蔽光源下孵育10分钟，接着用完全培养基灭活胰蛋白酶-EDTA。随后，将所述细胞收集在制备管中，用3mL的PBS处理，然后以2000rpm离心3分钟。在除去上清液之后，将200μL的PBS添加至每一个FACS管，充分再悬浮所述细胞，以进行流式细胞分析。基于测定的几何平均值(geo.mean)Fl-1，相比于所述kFGF4-衍生的肽，确定所述HIV-Tat、kFGF4-衍生的肽和所述细胞穿透肽TD1的转导潜能。结果显示于图3c中，以证实相比于所述对照，所述细胞穿透肽TD1在神经细胞中也显示了优异的细胞穿透潜能。

2.3定量分析在神经细胞(U-87MG细胞)中的细胞穿透潜能

为证实在神经细胞(U-87MG细胞)中的细胞穿透潜能，使用MEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养所述细胞。为了流式细胞分析，所述细胞被转移至12-孔板并培养16至24小时，且每一种样本(参考物：仅细胞，仅FITC，错配的肽(Scramble peptide)，比较物：kFGF4-衍生的肽，实验物：TD1)分别以5μM和10μM被添加至在无FBS的培养基中的所述细胞中，然后分别孵育所述细胞1小时和6小时(处理浓度：2.5μM,5μM,10μM)。反应之后，用DPBS洗涤所述细胞两次，以除去样本残留物，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理，以及在遮蔽光源下孵育10分钟，接着用完全培养基灭活胰蛋白酶-EDTA。随后，将所述细胞收集在制备管中，用3mL的PBS处理，然后以2000rpm离心3分钟。在除去上清液之后，将200μL的PBS添加至每一个FACS管，充分再悬浮所述细胞，以进行流式细胞分析。使用FL-1波长测定穿透入所述细胞的FITC的水平，以及基于所述错配的肽的值确定转导潜能，以从测定的几何平均值Fl-1抵消所述样本的荧光值。结果显示于图3d中，已证实了相比于所述kFGF4-衍生的肽(其是常规已知的细胞穿透肽)，所述细胞穿透肽TD1在神经细胞(U-87MG细胞)中显示了优越的细胞穿透。

2.4定量分析在HeLa细胞中的细胞穿透潜能

为证实在人宫颈腺癌细胞(HeLa细胞)中的细胞穿透潜能，使用MEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养所述细胞。为了流式细胞分析，所述细胞被转移至12-孔板并进一步培养16至24小时，然后用每一种在无FBS培养基中的样本处理，根据时间和样本的处理浓度进行孵育。反应之后，用DPBS洗涤所述细胞两次，以除去样本残留物，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理，以及在遮蔽光源下孵育10分钟，接着用完全培养基灭活胰蛋白酶-EDTA。随后，将所述细胞收集在制备管中，用3mL的PBS处理，然后以2000rpm离心3分钟。在除去上清液之后，将200μL的PBS添加至每一个FACS管，充分再悬浮所述细胞，以进行流式细胞分析。使用TD1、HIV-Tat以及kFGF4-衍生的肽作为实验组，并且从测定的几何平均值Fl-1，通过时间和浓度确定转导潜能。结果显示于图3e中，可以看出在所述HeLa细胞中在12小时内以浓度依赖方式发生TD1摄取，且在HIV-Tat以及kFGF4-衍生的肽的浓度为5μM或更高时，在所述HeLa细胞中发生的HIV-Tat以及kFGF4-衍生的肽的摄取值得注目，但是所述HIV-Tat以及kFGF4-衍生的肽的穿透量显著小于TD1的穿透量。同样地，相比于所述对照，可以证实所述TD1在HeLa细胞中显示了非常优异的细胞穿透。

实施例3.使用共聚焦显微镜证实细胞穿透肽TD1的体外细胞穿透潜能

3-1.定量分析在角化细胞(HaCaT细胞)中的细胞穿透潜能

为证实在HaCaT细胞(其是角化细胞系)中的细胞穿透潜能，使用DMEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养所述细胞。为了显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔，以及将所述HaCaT细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(参考物：溶媒(Vehicle)，比较物：HIV-Tat&kFGF4-衍生肽，实验物：TD1)分别以3μM和5μM添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，将所述细胞分别孵育1小时和3小时。反应后，采用抽吸完全除去所述培养基，重复将PBS加入至所述板并轻轻摇晃所述板的步骤以洗涤所述细胞，然后向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液以及在遮光的状态下轻轻搅拌10分钟，以固定所述细胞。细胞固定后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟。随后，在遮蔽光源下使用Hoechst和DAPI染料溶液在室温进行复染色10分钟，反应之后，除去染料溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。之后，回收盖玻片，然后慢慢放到逐滴滴加了封固溶液的载玻片上，并在没有气泡的情况下进行封固。在遮光的状态下，充分干燥所述载玻片，以使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图4a中，可以证实，相比于HIV-Tat和kFGF4-衍生的肽，所述TD1在角化细胞中显示了优异的细胞穿透。

3-2.定量分析在成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中的细胞穿透潜能

为了证实针对成神经细胞瘤细胞系(SiMa细胞)的细胞穿透潜能，使用RPMI1640(10％FBS,1％青霉素/链霉素)作为完全培养基将所述细胞培养至80％或更高的汇合。通过重复传代培养稳定化所述细胞，以及为了进行显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔，以及将所述SiMa细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(HIV-Tat，kFGF4-衍生肽，TD1)以5μM添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，然后孵育6小时。反应后，采用抽吸完全除去所述培养基，轻轻搅拌所述细胞并用PBS洗涤两次，向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液以在遮光的状态下固定所述细胞10分钟。细胞固定后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟。随后，在遮蔽光源的状态下在室温进行复染色10分钟。反应之后，除去染料溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。之后，回收盖玻片，然后慢慢放到逐滴滴加了封固溶液的载玻片上，并在没有气泡的情况下进行封固。在遮光的状态下充分干燥所述载玻片时，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图4b中，可以证实，相比于kFGF4-衍生的肽，所述TD1在神经细胞中也显示了优异的细胞穿透。

3-3.定量分析在神经细胞(U-87MG细胞)中的细胞穿透潜能

为证实在神经细胞系(U-87MG细胞)中的细胞穿透潜能，使用DMEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养U-87MG细胞。为了荧光显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔，以及将所述U-87MG细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(kFGF4-衍生肽，TD1)以5μM添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，并孵育6小时。反应后，除去所述经处理的样本，用PBS洗涤所述细胞两次，向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液以及在遮光的状态下固定所述细胞10分钟。随后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟，然后在遮蔽光源的状态下使用Hoechst和DAPI染料溶液在室温进行染色10分钟。染色后，除去溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。然后回收盖玻片，接着在逐滴滴加了封固溶液并且没有气泡的的载玻片上进行封固。在遮光的状态下，充分干燥所述载玻片，以使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图4c中，可以看出，相比于kFGF4-衍生的肽，所述TD1在U-87MG细胞中显示了优异的细胞穿透。

3-4.定量分析在HeLa细胞中的细胞穿透潜能

为证实在人宫颈腺癌细胞(HeLa细胞)中的细胞穿透潜能，使用MEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养所述细胞。为了荧光显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔，以及将所述细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(HIV-Tat，kFGF4-衍生肽，TD1)以5μM添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，持续6至24小时。反应后，除去所述经处理的样本，用PBS洗涤所述细胞两次，向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液以在遮光的状态下固定所述细胞10分钟。随后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟，然后在遮蔽光源的状态下使用Hoechst和DAPI染料溶液在室温进行染色10分钟。染色后，除去溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。随后回收盖玻片，接着在逐滴滴加了封固溶液并且没有气泡的的载玻片上进行封固。在遮光的状态下，充分干燥所述载玻片，以使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图4d中，可以看出，相比于所述对照，所述TD1在HeLa MG细胞中显示了优异的细胞穿透。

实施例4.用于肉毒杆菌毒素轻链蛋白(BoNT/A轻链(Lc))和其中MTD(TD1)和肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)缀合的重组蛋白(TD1-Lc)的表达构建体的构建

构建用于肉毒杆菌毒素类型A轻链蛋白(Lc)和其中MTD(TD1)和肉毒杆菌毒素蛋白轻链蛋白(Lc)缀合的重组蛋白的表达构建体。首先，通过Bioneer合成的肉毒杆菌毒素类型A的密码子优化的轻链(Lc)序列用作为模板，以进行采用针对所述模板特别设计的引物对的聚合酶链反应(PCR)。在本文中，所述引物序列的信息显示于表1中。

[表1]

使用包含以下的反应混合物进行PCR：作为模板的100ng的密码子优化Lc、终浓度为0.4mM的dNTP混合物、1μM的每一种引物、5μl的10x EX taq缓冲溶液以及0.25μl的EX taq聚合酶(Takara)，混合物最终体积为50μl。首先，PCR反应条件包括：在95℃热变性5分钟，按在95℃持续30秒、在58℃持续1分钟、以及在72℃持续1分钟进行30个循环的反应，以及最后在72℃扩增8分钟。反应后，使用1％琼脂糖凝胶(Agarose gel)进行电泳，以证实扩增的产物，然后从所述琼脂糖凝胶收集所述扩增的重组片段，并使用商购的凝胶提取试剂盒(Intron,韩国)进行提取和纯化。每一种纯化的PCR产物使用NdeI和XhoI酶在37℃处理2小时，接着再次使用琼脂糖凝胶进行电泳。然后，每一种由此消化的重组片段使用凝胶提取试剂盒(Intron,韩国)进行纯化。同时，具有组氨酸标签和T7启动子的表达载体pET-21b(+)载体(Novagen,USA)用限制性酶NdeI和XhoI在与上面描述相同的条件下进行消化，将纯化的重组片段与消化的pET-21b(+)载体混合在一起，然后添加T4DNA连接酶(Intron,韩国)在16℃进行连接，持续16小时。得到的产物转染入大肠杆菌DH5α-敏感性细胞，从而获得重组蛋白表达载体。通过使用如上所述的表达酶NdeI和XhoI进行消化以及1％的琼脂糖凝胶电泳，证实了每一种重组片段被适当地插入所述pET-21b(+)载体。得到的重组蛋白表达载体命名为pET21b(+)-Lc和pET21b(+)-TD1-Lc。

实施例5.培养和纯化用于表达肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)和其中MTD(TD1)缀合肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)的重组蛋白(TD1-Lc)的菌株

根据以下进行培养和纯化用于表达根据本发明的重组蛋白的菌株的方法，且该方法的示意图显示于图5中。

5-1.培养细菌菌株

通过热休克法用每一种重组表达载体pET21b(+)-Lc和pET21b(+)-TD1-Lc转化大肠杆菌BL21(DE3)RIL-CodonPlus，并在包含50μg/ml的氨苄西林的LB培养基中培养。随后，引入了所述重组蛋白基因的所述大肠杆菌被接种入25ml的LB培养基，在37℃培养过夜，从而制备第一培养溶液。所述第一培养溶液被再次添加至的LB培养基进行接种，在37℃培养至达到在600nm的光密度(OD₆₀₀)为0.4至0.8。之后，1mM的蛋白表达诱导剂IPTG被添加至所述培养溶液，然后细胞在18℃进一步培养过夜，并在4℃以8000rpm离心10分钟。然后，除去上清液，从而回收细胞团块。收集的细胞团块在PBS中悬浮，用溶菌酶处理，然后用细胞用超声波仪破碎，在13000rpm离心30分钟，从而获得可溶部分。

5-2.蛋白纯化和纯化鉴定(SDS-PAGE)

在实施例5-1中获得的所述可溶部分使用快速蛋白液相色谱法(FPLC；Bio-Rad)进行纯化。所述可溶部分被添加至FPLC，以结合亲和色谱柱，然后用洗涤缓冲液洗涤。之后，咪唑浓度逐渐增加，以获得纯化样本，然后所述样本在4℃在搅拌下使用PBS或者在PBS中使用透析膜进行透析16至20小时。

纯化的样本在12％SDS-PAGE凝胶中进行电泳，以检测纯度。在轻轻搅拌下，所述凝胶用考马斯亮蓝R染色，然后使用脱色缓冲液脱色，直至期望的蛋白的带变得清晰。结果显示于图6，采用SDS-PAGE可以看出纯化的蛋白具有的纯度为95％或更高。

实施例6.评价细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)的细胞穿透潜能

6-1构建荧光标记的蛋白

为评价细胞穿透肉毒杆菌毒素(TD1-Lc)的体外细胞穿透潜能，制备FITC-标记的蛋白。通过在遮光状态下将50mM硼酸和具有0.5μg/mL的所述蛋白的0.1ng/mL FITC进行混合，并在4℃反应8小时，制备10mL的蛋白悬浮液。反应后，通过添加所述蛋白悬浮液至透析管进行透析，然后以4小时-4小时-16小时的间隔在4℃在遮光下更换为DPBS，进行透析。完成透析之后，使用0.2μm的针头式过滤器过滤FITC-标记的蛋白，由此得到的蛋白通过Bradford分析进行定量并根据要求的浓度选择性地进行浓缩。蛋白被稀释以达到测定浓度中的最低浓度，以测定荧光强度(RFU)。基于测定的RFU，比较在检验中使用的FITC-缀合的蛋白的荧光强度。

6-2.使用流式细胞分析证实神经细胞穿透潜能

评价所述细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)的针对成神经细胞瘤细胞系(SiMa细胞)的细胞穿透潜能。由于所述SiMa细胞对所述培养皿具有低的细胞粘附，使用用明胶(Sigma-Aldrich,G2500)包被的培养皿，然后用0.1％的明胶溶液包被所述皿。1小时后在室温下，除去所述溶液，干燥所述皿。使用RPMI1640(10％FBS,1％青霉素/链霉素)作为完全培养基传代培养细胞至80％或更高的汇合。通过重复传代培养稳定化所述细胞，并以5×10⁵/孔接种入100mm培养皿，在37℃、5％CO₂的培养器中培养16至20小时，以用于所述实验。

将每一种样本(溶媒，仅FITC，Lc-FITC，TD1-Lc-FITC)以1.5μg/ml和7.5μg/ml的浓度添加至无FBS-培养基。反应后，用DPBS洗涤所述细胞两次，以除去样本残留物，在遮光下用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理10分钟，接着用完全培养基灭活所述胰蛋白酶-EDTA。随后，将所述细胞收集在制备管中，用3mL的PBS处理，然后以2000rpm离心3分钟。在除去上清液之后，将200μL的PBS处理每一个FACS管以充分再悬浮所述细胞，以进行流式细胞分析。

基于测定的几何平均值(geo.mean)Fl-1，相比于所述kFGF4-衍生的肽，确定所述HIV-Tat、kFGF4-衍生的肽和所述细胞穿透肽TD1的转导潜能。为了从测定的几何平均值Fl-1抵消荧光值，基于所述溶媒数值确定所述肉毒杆菌毒素类型A轻链(LC)和细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)的转导潜能。结果显示于图7a，经定量证实，相比于不缀合细胞穿透肽的Lc蛋白，所述细胞穿透肽缀合的TD1-Lc重组蛋白在神经细胞中显示了相当优异的细胞穿透。这是通过在细胞水平上证实TD1作为诸如蛋白质之类的大分子的载体的可能性而获得的结果。

6-3.使用共聚焦显微镜证实神经细胞穿透潜能

为证实细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)的针对成神经细胞瘤细胞系(SiMa细胞)的细胞穿透潜能，在作为完全培养基的RPMI1640(10％FBS,1％青霉素/链霉素)中传代培养所述SiMa细胞至80％或更高的汇合。通过重复传代培养稳定化所述细胞，以及为了进行显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔。将所述SiMa细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(溶媒，Lc，TD1-Lc)以5μg/ml的浓度添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，然后孵育3小时。反应后，采用抽吸完全除去所述培养基，用PBS洗涤所述细胞两次，向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液，在遮光的状态下固定所述细胞10分钟。细胞固定后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟。随后，在遮蔽光源的状态下在室温进行复染色10分钟，除去染料溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。为观察所述细胞，回收盖玻片，然后慢慢放到逐滴滴加了封固溶液的载玻片上，并在没有气泡的情况下进行封固。在遮光的状态下充分干燥所述盖玻片时，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图7b中，可以看出，相比于所述Lc蛋白，所述细胞穿透肽缀合的TD1-Lc重组蛋白在神经细胞中显示了相当优异的细胞穿透。

6-4.使用共聚焦显微镜证实角化细胞穿透潜能

为证实细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)的针对角化细胞系(HaCaT细胞)的细胞穿透潜能，使用DMEM完全培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养所述细胞。为了进行显微镜检查，12mm盖玻片经火焰灭菌，添加至24-孔板的每个孔，以及将所述HaCaT细胞接种入所述板，并培养16至24小时。每一种样本(溶媒，Lc，TD1-Lc)以5μM的浓度添加至在无FBS-培养基中的所述细胞，然后孵育1小时、3小时和6小时。反应后，从每个孔除去所述培养基，所述板用PBS洗涤两次，然后向每个孔添加200μL的10％的福尔马林溶液以在遮光的状态下固定所述细胞10分钟。细胞固定后，除去固定溶液，用PBS洗涤所述细胞两次，持续10分钟，在遮蔽光源的状态下在室温用Hoechst和DAPI染料溶液进行复染色10分钟。染色后，除去染料溶液，用PBS洗涤所述细胞两次。为观察所述细胞，回收盖玻片，然后慢慢放到逐滴滴加了封固溶液的载玻片上，并在没有气泡的情况下进行封固。在遮光的状态下充分干燥所述载玻片时，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察所述细胞。结果显示于图7c中，可以看出，相比于所述Lc蛋白，所述细胞穿透肽缀合的TD1-Lc重组蛋白在角化细胞中显示了相当优异的细胞穿透。

实施例7.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc针对合成的皮肤替代品的穿透功效

为评价其中细胞穿透肽(TD1)缀合肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)的重组蛋白(TD1-Lc)的皮肤屏障穿透功效，采用自动透皮扩散池系统(MicroettePlus)证明合成的皮肤替代品(Strat-M^TM)的皮肤穿透功效。所述合成的皮肤替代品是由用于抑制吸收的聚醚砜(PES)上层和可由于孔结构而赋予吸收差别的聚烯烃下层组成，容易储存，能无需预处理而被应用于所述系统。而且，其已被广泛应用，因为难以在真实皮肤上测量的穿透量可在皮肤类似条件下被定量化。为评价在所述制备的合成皮肤替代品中的所述穿透功效，将PBS添加到垂直池下面，以允许所述缓冲溶液接合所述合成的皮肤替代品，而不留有空隙，然后将样本添加到所述垂直池的上面。提取存在于所述垂直池下面的10％的缓冲溶液，然后用相同量的缓冲溶液填充空隙，在反应期间重复操作。反应后，通过ELISA评价所述样本的量。结果显示于图8中，可以看出新颖的细胞穿透肽MTD-缀合的TD1-Lc在所述合成的皮肤替代品中具有比所述肉毒杆菌毒素轻链蛋白Lc高约20％或更高的穿透潜能。可以看出，所述合成皮肤替代品的穿透程度随着时间推移直至反应后6小时似乎是相似的，但是在反应后12至24小时，所述TD1-Lc蛋白的穿透潜能较高。

实施例8.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的功效(体外SNAP25裂解试验)

SNAP25蛋白是一种SNARE蛋白，其通过肉毒杆菌毒素类型A的轻链而被裂解。通常，为了观察肉毒杆菌毒素的活性，可采用体外SNAP25裂解试验。在一示例性实施方式中，为了证明肉毒杆菌毒素的轻链(BoNT/A轻链(Lc))的活性，采用裂解试验。将2μl的裂解试验缓冲剂(10mM DTT,10mM HEPES,10mM NaCl&20uM ZnCl₂)添加至2μg的GST-SNAP25-EGFP-缀合蛋白，以10、30、90、270和810ng的不同浓度添加重组蛋白TD1-Lc，然后在37℃反应4小时。添加270ng的肉毒杆菌毒素复合物(BoNT/A复合物)作为阳性对照，然后添加三重蒸馏水至总体积为20μl，接着在如上所述的相同条件下反应。其中完成了反应的所述混合物用5X还原型缓冲液处理，在100℃加热10分钟，采用12％SDS-PAGE凝胶在80V电泳20分钟以及在120V电泳1小时。所述SDS-PAGE凝胶用染色缓冲液(0.25％考马斯亮蓝，45％甲醇，10％乙酸)染色，然后用脱色缓冲液(30％甲醇，10％乙酸)脱色，以确定蛋白图谱。结果显示于图8中，可以证实甚至是在重组蛋白TD1-Lc中仍保持肉毒杆菌毒素的活性。从该结果，可以预见所述重组蛋白TD1-Lc将具有与肉毒杆菌毒素相同的功能。

实施例9.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的体外功效

9-1.SNAP25在人角化细胞(HaCaT细胞)中的裂解的证实

为了评价所述重组蛋白TD1-Lc在角化细胞(HaCaT细胞)中的皮肤穿透和功效，通过蛋白免疫印迹法进行能根据所述SNAP25蛋白的裂解证明所述功效的SNAP25裂解实验。所述角化细胞(HaCaT细胞)在24孔板中培养直至细胞密度为1X10⁴/孔，持续24小时，用pcDNA3.1-SNAP25质粒转染，并使用pcDNA3.1-Lc质粒共转染作为阳性对照。在通过15小时培养SNAP25过表达之后，用无-FBS培养基转移培养基，并在TD1-Lc蛋白处理的48小时之后除去，然后用PBS洗涤细胞。之后，200μl的RIPA缓冲液(Intron)添加至每一个孔以裂解所述细胞，然后所述细胞在4℃和8000rpm离心10分钟，从而获得上清液。得到的上清液与5X还原型样本缓冲液混合，在100℃加热10分钟，采用15％SDS-PAGE凝胶在80V电泳20分钟以及在120V电泳1小时。电泳后，所述凝胶在90V被转移至PVDF膜(Millipore,IPVH00010)，持续1小时10分钟，用5％BSA封闭所述转移的膜2小时。之后，用5％BSA以1:1000的比例稀释初级抗体(Covance,SMI-81)，并在4℃反应16小时。反应后，用PBST以10分钟间隔洗涤所述膜三次或更多次，用5％BSA以1:2500的比例稀释第二抗体(Millipore,AP192P)，然后在室温进一步反应1小时。在第二反应之后，用PBST以10分钟间隔洗涤所述膜三次或更多次，用ECL溶液处理用于进一步反应，转移至盒(cassette)，并在暗室中暴露在X-射线胶片上。结果显示于图10a，当Lc在质粒中表达或者质粒外部用所述蛋白处理时，在任何情况下，所述SNAP25裂解得到证实。这意味着外部处理的TD1-Lc蛋白穿透皮肤细胞，以裂解在其中表达的SNAP25。因此，证实了所述重组蛋白TD1-Lc具有优异的皮肤穿透和活性。

9-2.证实SANP25在人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中的裂解

为了评价所述重组蛋白TD1-Lc在人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中的皮肤穿透和功效，通过蛋白免疫印迹法进行能通过SNAP25蛋白的裂解证明所述功效的SNAP25裂解实验。

首先，使用包含10％FBS和1％P/S的RPMI培养基以5X10⁵/孔的细胞密度将所述SiMa细胞接种在24孔板中。所述细胞在37℃、5％CO₂培养器中培养过夜，培养基更换为1ml的分化培养基(10％FBS,RPMI,Glutamax,1X NEAA,1X B27,1X N2,5uM RA,2.5uM PUR)，然后细胞培养24小时。以25μg/mL的浓度将GT1b添加至分化培养基(10％FBS,RPMI,Glutamax,1X NEAA,1X B27,1X N2,5uM RA,2.5uM PUR)，然后所述培养基更换为1ml的所述分化培养基。在24-孔板中以5X10⁵/孔的细胞密度培养所述人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)，根据神经元分化的方法进行分化，然后培养基更换为最终分化培养基，4小时后，细胞用重组蛋白TD1-Lc处理。所述蛋白处理48小时后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，通过添加200μl的RIPA缓冲液(Intron)至每个孔进行裂解，在4℃和8000rpm离心10分钟，从而获得上清液。得到的上清液与5X还原型样本缓冲液混合，在100℃加热10分钟，采用15％SDS-PAGE凝胶在80V电泳20分钟以及在120V电泳1小时。电泳后，所述凝胶在90V被转移至PVDF膜(Millipore,IPVH00010)，持续1小时10分钟，用5％BSA封闭2小时。之后，用5％BSA以1:1000的比例稀释初级抗体(Covance,SMI-81)，并在4℃反应16小时。反应后，用PBST以10分钟间隔洗涤所述膜三次或更多次，用5％BSA以1:2500的比例稀释第二抗体(Millipore,AP192P)，然后在室温进一步反应1小时。在第二反应之后，用PBST以10分钟间隔洗涤所述膜三次或更多次，用ECL溶液处理用于进一步反应，转移至盒(cassette)，并在暗室中暴露在X-射线胶片上。结果显示于图10b，证实了仅所述TD1-Lc蛋白能有效穿透所述人成神经细胞瘤细胞。因此，证实了所述TD1-Lc蛋白也能有效地通过神经细胞和皮肤细胞。

实施例10.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的皮肤细胞细胞毒性

10-1.评价在人角化细胞(HaCaT细胞)中的细胞毒性

为了评价所述重组蛋白TD1-Lc针对人皮肤细胞的细胞毒性，进行用于测量细胞活力的MTT实验。首先，以1X10⁴/孔的细胞密度在24-孔板中培养角化细胞(HaCaT细胞)，然后培养基更换为无FBS培养基，4小时后用重组蛋白TD1-Lc处理。用所述蛋白以0.625μg/ml至40μg/ml的浓度处理所述细胞，反应48小时，并通过添加10μl的5mg/ml MTT(Sigma-Aldrich)进行进一步反应，持续4小时。在所述反应之后，抛弃所述培养基，添加100μl的DMSO至每一个样本，在室温反应10分钟，然后测量吸光度(OD₅₇₀)。使用未缀合TD1的肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)作为该实验的对照。结果显示于图11a中，可以证实所述重组蛋白TD1-Lc在所述角化细胞(HaCaT细胞)中甚至在高浓度40μg/ml时仍具有细胞活力，因此不具有细胞毒性。

10-2.评价在人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)中的细胞毒性

为了评价所述重组蛋白TD1-Lc针对人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)的细胞毒性，进行用于测量细胞活力的MTT实验。以5X10⁵/孔的细胞密度在24-孔板中培养人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)，根据神经元分化的方法进行分化。更换为最终分化培养基之后4小时，处理所述重组蛋白TD1-Lc。用所述蛋白以0.625μg/ml至40μg/ml的浓度处理所述细胞，反应48小时，然后通过添加10μl的5mg/ml MTT(Sigma-Aldrich)进行进一步反应，持续4小时。在所述反应之后，抛弃所述培养基，添加100μl的DMSO至每一个样本，在室温反应10分钟，然后测量吸光度(OD₅₇₀)。使用未缀合TD1的肉毒杆菌毒素轻链蛋白(Lc)作为该实验的对照。结果显示于图11b中，可以证实由所述重组蛋白TD1-Lc-处理的人成神经细胞瘤细胞(SiMa细胞)保持细胞活力，因此，甚至在高浓度的所述重组蛋白TD1-Lc时亦未显示出细胞毒性。

实施例11.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的稳定性

在肉毒杆菌毒素轻链的情况下，在纯化之后两种轻链蛋白形成二聚体，形成的轻链二聚体具有自我裂解活性，并显示了根据储存条件自我裂解活性存在差别。因此，为了证明所述重组蛋白TD1-Lc的根据储存期的稳定性，通过SDS-PAGE电泳确定所述蛋白的按时期的图谱变化。定量化所述重组蛋白TD1-Lc，并以10μg分配入每一个管中，然后在-80℃超低温冰箱中储存。储存1、3和6个月之后，根据每一个时期阶段，将每一种重组蛋白TD1-Lc放置在12％SDS-PAGE凝胶中，以进行电泳，从而确定在所述蛋白的纯度和图谱中的变化。结果显示于图12中，可以证实甚至在6个月之后，所述重组蛋白被稳定地保持，在所述蛋白图谱中没有发生变化。

实施例12.制备细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的美容组合物以及评价对皮肤刺激的稳定性

通过由H&A Pharmachem实施脂质体技术加工所述重组蛋白TD1-Lc，然后将所述脂质体蛋白与美容成分一起加工来制备美容组合物，用于所述重组蛋白TD1-Lc的临床实验。

而且，为了评价对于人的皮肤刺激安全性，由I.E.C.Korea(韩国)进行实验，I.E.C.Korea是邀请的合同研究组织(CRO)。所述实验通过以下实施：将从31位健康男性和女性获得的样本添加至IQ室，并将所述样本的斑片(patch)贴附至受试者背部的皮肤，48小时后，通过皮肤科医生确定针对人类皮肤的安全性，以评价和分析刺激程度。实施的所述斑贴方法是单闭塞性斑贴试验，并且通过根据通常在皮肤刺激评价中使用的CTFA指南的由Frosch&Kligman设计的评价方法评价和分析刺激程度。通过作为实验管理者和研究员的皮肤科医生的医疗历史选择32名符合选择和淘汰标准的健康成年男性和女性作为实验自愿者，访问和目视检查，和必要时触诊，但是其中一位退出。年龄分布为20至36岁，平均年龄为25.7±5.4，且男性：女性比例为13:18。在用于完成所述实验的31位受试者的单斑贴试验之后，确定根据评价标准的皮肤刺激程度，结果显示于图13中。当通过皮肤刺激反应的结果评价所述刺激程度时，在人类皮肤刺激反应中可适用的全球通用的标准仍未被确定，通常，在50或更多位自愿者的实验中，通过在单斑贴试验中数据读取，显示了以大于20％的总自愿者的频率(7或更多，其是实验中31位自愿者的20％)反应的样本或者显示了在大于10％的总自愿者中在每次数据读取中刺激反应为+2或更高的样本被认为是能显著引起刺激的物质。在该实验中，由于在斑贴施加至所述31位受试者背部皮肤48小时后观察到皮肤反应，因此确定了所请求的样本可安全应用于皮肤，而不会发生刺激。

实施例13.评价细胞穿透肽TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的皱纹改善功效

为了评价所述重组蛋白TD1-Lc的皱纹改善功效，由I.E.C.Korea(韩国)进行临床实验，I.E.C.Korea是合同研究组织(CRO)。对年龄范围在30至59之间且具有鼻唇褶的22名韩国成年女性受试者进行所述实验，所述实验通过以下进行：由受试者自己在家每天使用一种类型样本两次，持续4周，通过临床影像学和通过皮肤科医生对鼻唇褶的目测评估的组合来测定鼻唇褶的粗糙度和皮肤弹性，以及评价所述重组蛋白TD1-Lc的皮肤皱襞减少功效。使用PRIMOS系统测定鼻唇褶的粗糙度，以及使用Cutometer MPA580测定所述皮肤弹性。

所述施加于人的实验是优先保护受试者的权利、安全和福利并基于赫尔辛基宣言和GCP指南的精神内容实施的。研究者如实地执行以下要求以确保受试者的安全。

-在实验期间，实验管理者和实验人员应尽一切努力最大化受试者的安全，对皮肤的所有异常症状采取及时和适当的措施以减少对所述症状的反应。

-在实验期间，当受试者报告由样本引起的皮肤刺激或异常症状时，立即除去使用的样本，以及在所述症状并未改善时，实验管理者提供皮肤科评价和适当处理。

-当尽管采用常规实验操作但是在所述皮肤上出现异常症状时，提供适当皮肤科评价和处理。

-当发生其它异常皮肤反应时，实验管理者和实验人员采取适当措施以及皮肤科评价，并详细记录病例和情形。

-为测定所述结果，受试者访问实验室，在恒温恒湿房间(22±2℃50±5％)中休息15分钟或更长时间，以稳定皮肤，然后对皮肤进行测量和评价。

在该实验中，在使用所述样本之前和使用所述样本之后4周，扫描鼻唇褶区域，使用PRIMOS系统分析皮肤粗糙度参数。表达皮肤粗糙度的参数如下：

-Ra：算术平均值(平均粗糙度)

-Rmax：最大峰至谷粗糙度(最大粗糙度)

-R3z：算术平均第三高度

-Rt：最高点和最低点之间的距离

-Rz：平均最大高度(10点高度)

通过使用Cutometer测定在脸颊的毛孔区域中的弹性(弹性恢复力)来评价皮肤弹性。重复包括以400mb的压强抽吸2秒并释放2秒的方法3次，为提高所述测量结果的可重现性，预拉伸时间设置为0.1秒。当皮肤被抽吸和释放时，从通过抽吸和释放所述皮肤的测量值得到的参数将被解释如下：

-R5：皮肤的净弹性，没有粘性形变

-R7：相比于完整曲线，所述弹性的部分

通过在使用所述样本之前(D+0)和之后4周(D+28)，由皮肤科医生根据照片比例通过目测观察每一位受试者的左边或右边鼻唇褶的状态，来进行鼻唇褶的目测评价。

在使用所述样本之前和之后，鼻唇褶粗糙度、皮肤弹性和目测评价的统计学显著性由皮肤科医生审查，当在使用所述样本之前和之后由皮肤科医生对鼻唇褶的目测评价、鼻唇褶粗糙度和皮肤弹性参数中存在显著变化时，可以得出的结论是所述鼻唇褶或弹性得到改善。

SPSS 14.0使用作为统计分析程序，且作为机器测量的结果，进行用于数据的正态性的Shapiro-Wilk检验。所有22名受试者被确定为合适的受试者，并且在所述最终访问之前完成对所有受试者的实验，从而获得来自所述最终22名受试者(平均年龄：46.1)的有效数据。

结果显示于图14a中，在使用所述样本之后4周，表示在所述鼻唇褶区域处的皮肤粗糙度的Ra、Rmax、R3z、Rz和Rt参数显著下降，这意味着所述鼻唇褶得到改善。而且，如图14b中显示的，在使用所述样本之后4周，显示了表示皮肤弹性的R5和R7参数显著升高，这意味着皮肤弹性得到改善。对所述鼻唇褶的目测评价也显示了在使用所述样本之后4周所述鼻唇褶被显著减少，如图14c中所示，并且如图15中所示，可直观确定所述皱纹减少功效。

因此，根据通过临床试验的TD1-缀合的肉毒杆菌毒素重组蛋白TD1-Lc的皮肤改善功效的评价，证实了当所述样本被连续使用4周，其有效改善鼻唇褶和皮肤弹性。这表明了，由于局部施用的细胞穿透肉毒杆菌毒素重组蛋白(TD1-Lc)被有效地透皮递送，因此，其提供在减少皮肤中的细皱纹和深皱纹方面的显著功效。

本领域技术人员会理解的是，本发明的上述描述是示例性的，且在不改变本发明的技术精神或必要特征的前提下，可容易地将本文公开的示例实施方式修改成其它特定形式。因此，其应解释为上面描述的所述示例实施方式是在所有方面的示例，且并非限制。

[工业实用性]

由于本发明的细胞穿透肽-肉毒杆菌毒素重组蛋白可被透皮递送，因此其可具有肉毒杆菌毒素的固有作用和最大限度的易用性，因此可用作为更安全且优选的治疗替代品。因此，本发明的所述细胞穿透肽-肉毒杆菌毒素重组蛋白可有效地用作为用于治疗多种疾病和美学和/或美容目的局部激动剂。