CD73阻断的制作方法

本申请要求于2014年10月10日提交的美国临时申请号US62/062,323；于2015年2月20日提交的US62/118,549；于2015年3月16日提交的US62/133,597；和于2015年7月6日提交的US62/188,881；将所有这些申请通过引用以其全文(包括任何附图)结合在此。序列表的引用本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“CD73-1_ST25”的文件，创建于2015年10月8日，大小是24KB。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文结合在此。
技术领域：
本发明涉及抑制CD73的结合抗原的化合物(例如抗体)。本发明还涉及产生此类化合物的细胞；制造此类化合物、以及其抗体、片段、变体和衍生物的方法；包含以上物质的药物组合物；使用这些化合物以诊断、治疗或预防疾病(例如癌症)的方法。
背景技术：
：CD73(胞外-5'-核苷酸酶)是通常在内皮细胞和造血细胞的亚群上表达的70-kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。CD73与CD39一起调节腺苷三磷酸(ATP)代谢。CD39(NTPDase-1)将ATP转化为AMP，仅释放痕量的ADP，然而CD73催化AMP转化为腺苷。腺苷三磷酸(ATP)及其代谢物AMP和腺苷在细胞代谢、信号传导和免疫稳态中具有重要作用。响应于细胞死亡或细胞应激的细胞外腺苷三磷酸(ATP)的释放起到激活免疫应答的作用。然而，其代谢物腺苷具有免疫抑制活性。细胞外腺苷在癌性组织中积累并且构成肿瘤免疫逃逸的重要机制。在其他作用中，肿瘤起源的腺苷通过腺苷酸环化酶激活的A2A受体深度抑制浸润性效应T细胞。已经在一系列肿瘤细胞中报道了CD73表达，这些肿瘤细胞包括白血病、膀胱癌、胶质瘤、成胶质细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌和乳腺癌。CD73表达也已经与黑色素瘤和乳腺癌中的促转移表型相关联。已经显示，用结合鼠CD73的抗体进行治疗可以抑制小鼠中的乳腺肿瘤生长和转移(斯塔格(Stagg)等人(2010)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)104:1547-1552)。然而，抗体通常不与人和小鼠CD73交叉反应，使抗体的研究和CD73的生物学功能复杂化。已经显示，A2A受体的遗传缺失可以诱导T细胞依赖性肿瘤排斥(奥塔(Ohta)等人，(2006)美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)103:13132-13137)。使用siRNA的敲低或CD73在肿瘤细胞上的过量表达可以调节肿瘤生长和转移(比维斯(Beavis)等人(2013)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)110:14711-716；斯塔格(Stagg)等人，(2010)，同上；金(Jin)等人(2010)癌症研究(CancerRes.)70:2245-55)。CD73-/-小鼠被保护免患移植性肿瘤和自发性肿瘤(斯塔格(Stagg)等人(2010)癌症研究(CancerRes.)71:2892-2900)。在人类中，高CD73表达已被证明是对三阴性乳腺癌的阴性预后(洛伊(Loi)等人(2013)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)110:11091-11096)。尽管长期以来有意将CD73作为治疗靶标，但是试剂在体内靶向CD73所需的活性尚未完全阐明。虽然CD73在肿瘤细胞上表达，但是它也在免疫系统的不同细胞上表达，尤其是CD4和CD8T细胞以及B细胞上。尽管已经报道一些抗体结合人CD73并且增加T细胞的活性或增殖或修饰肿瘤细胞的迁移，但是仍然需要澄清此类抗体如何起作用，因为已经报道了此类T细胞调节和CD73介导的共刺激信号的传递是可能的，而不依赖于CD73的胞外-5'-核酸酶活性(戈特森(Gutensohn)等人，1995，细胞免疫学(CellImmunol.)161:213-217)。因此，通常称为CD73抑制剂的抗体可能不通过调节CD73的胞外-5'-核苷酸酶活性起作用。已经报道了一种抗体7G2(mIgG2同种型，生命技术公司(LifeTechnologies))抑制CD73，然而这种抗体在流式细胞术中不结合细胞表面CD73，或最多只以非常低的亲和力进行结合。已经报道了结合CD73的另一种抗体，克隆AD2(小鼠IgG1同种型)引起受体聚集和内化，但对酶活性具有最小的影响。而另一种试剂，1E9(小鼠IgG3同种型，圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruzBiotechnology,Inc.))被报道促进T细胞信号传导而与酶抑制无关。另一种mAb，4G4(IgG1同种型，诺伟思生物制剂公司(NovusBiologicals))被报道诱导CD73从T细胞表面脱落。只有一种试剂，虽然没有进一步表征，被报道在使用重组CD73的测定中具有阻断酶的部分能力(萨彻弥尔(Sachsenmeier)等人((2012)生物医学筛选杂志(J.Biomed.Screening)17:993-998)，并且稍后被描述为诱导细胞内内化的抗体(拉斯特(Rust)等人(2013)分子癌症(Mol.Cancer)12:11)。此外，另外一个复杂因素是文献中所描述的抗体通常是能够被Fcγ受体结合的鼠同种型，使得难以将任何潜在的阻断效应与Fc介导的效应分开。被Fcγ受体结合的抗CD73抗体可以例如介导表达CD73的肿瘤细胞(和可能表达CD73的免疫抑制细胞)的消耗(例如通过ADCC)，和/或可以引起促炎细胞因子的产生，而不引起任何真实阻断效应。因此，抗体的作用模式仍然是难以捉摸的。因此，尽管对靶向CD73有兴趣，但是最有效的抗CD73抗体的特征仍然有待确定。还没有报道结合CD73活性位点的抗体。在不同细胞类型(包括免疫细胞和肿瘤细胞)上的CD73表达，与使用实际上不阻断CD73或不是纯阻断剂的抗体一起，给评价抗体的潜在活性造成了复杂环境。需要新的测定和抗体。技术实现要素：诸位发明人已发现与存在于在细胞(包括肿瘤细胞)表面表达的CD73上的表位结合，并且抑制CD73酶的酶(胞外-5'-核苷酸酶)活性的抗体。这些抗体可以抑制在细胞表面表达的膜结合CD73蛋白的酶活性。有利地，这些抗体可以用作纯的CD73阻断抗体，例如它们抑制在细胞表面表达的膜结合CD73蛋白的酶活性，而基本上不结合Fcγ受体和/或基本上不将ADCC导向表达CD73的细胞。任选地，这些抗体保留Fc结构域并且保留与人FcRn的结合。任选地，与能够消耗表达CD73的肿瘤细胞的一些抗体(其例如可以在等于或基本上低于提供受体饱和的浓度下提供完全功效)相反，这些抗体可以有利地用作纯的阻断剂并且在希望的时间段内(例如，1周、2周、1个月)以有效中和CD73的酶活性的量给予，直到抗CD73抗体的下一次连续给予。任选地，这些抗体是纯的阻断剂并且旨在中和肿瘤环境中CD73的酶活性。任选地，这些抗体包含修饰的Fc结构域，例如以便降低蛋白酶敏感性(例如针对蛋白酶，例如肿瘤环境中的MMP)和/或减少与人Fcγ受体(例如CD16)的结合。在一个方面，本披露提供了可用于鉴定真实CD73功能阻断抗体的测定法。如本文所示，在先前的可溶性酶阻断测定中，发现作为二价抗体阻断的绝大多数抗体属于假阳性，然而单价结合抗体可能没有或具有很少的阻断活性，可能是由于不能阻断活性位点或当不结合CD73二聚体内的每个CD73多肽时作为变构抑制剂起作用。先前的细胞测定不能区分作用的机制，并且报道降低CD73活性的抗体可以组合多种作用机制，例如诱导受体内化、受体脱落和/或Fcγ受体介导的效应。因为残留的CD73酶活性可以导致足够的腺苷产生以介导免疫抑制作用，所以高水平的抗体介导的酶阻断是有利的，以便调节治疗效果。在一个方面，本披露提供了与存在于在细胞(包括但不限于肿瘤细胞)表面表达的人CD73多肽上的表位结合，并且抑制CD73酶的酶(胞外-5'-核苷酸酶)活性的抗体。在一个方面，本披露提供了可以抑制可溶性重组CD73蛋白的酶活性的抗体。本披露的抗体不引起细胞表面表达的CD73的细胞内内化或更一般地下调，和/或不随即依赖于它们的CD73抑制活性。与通过引起CD73内化来抑制CD73的抗体相比，本披露的抗体可以提供更强的抑制效力(基本上是中和CD73酶活性的能力)。与通过其他机制(例如导致CD73-抗体寡聚体形成)抑制可溶性CD73的抗体相反，本披露的抗体能够在所有浓度下(包括在更高(例如10倍)过量的抗体:酶)抑制CD73的酶活性。此外，不同于与重组CD73上的可以在细胞表面CD73(例如抗体7G2)上修饰或不存在的表位结合的抗体或具有过低亲和力以致于不能在CD73表达的细胞中转化为功效的抗体，本发明抗体以高亲和力与在细胞表面CD73上存在和/或保持完整的表位结合，从而提供具有强力中和细胞CD73的酶活性的能力的抗体。本发明抗体抑制细胞中的CD73酶活性，但也可任选地抑制可溶性重组CD73的胞外-5'-核苷酸酶活性(如在使用可溶性二聚体CD73多肽的无细胞测定中所观察到的)。此外，本文披露了示例性抗体(参见，例如，抗体11E1、6E1、3C12和8C7)，据信这些抗体能够作为由细胞表达的CD73的变构抑制剂，例如，它们抑制人CD73多肽的活性而不结合CD73多肽的酶活性位点，和/或它们是CD73的非竞争性抑制剂，例如它们抑制人CD73多肽的活性而没有可检测地降低CD73多肽与其天然底物之间的结合。示例性抗体失去与在残基A99、E129、K133、E134和A135处具有取代的CD73突变体的结合。鉴于在存在和不存在CD73活性位点抑制剂APCP的两种情况下示例性抗体与CD73的结合，其在CD73上的表位似乎存在于不仅在未结合底物时处于“开放”构象的CD73上，而且在当与底物(例如天然底物，例如AMP或结合活性位点的抑制剂或其他化合物，例如AMP类似物腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸酯(APCP))结合时处于“闭合”构象的CD73上。因此，在一个方面，本披露提供了CD73多肽的变构抑制剂。在一个方面，变构抑制剂是抗体。在一个方面，提供了结合在细胞(包括但不限于肿瘤细胞)表面表达的人CD73多肽并且抑制CD73多肽的酶(胞外-5'-核苷酸酶)活性的抗体，其中该抗体是CD73多肽的变构抑制剂。而且，本文描述了当CD73作为CD73二聚体存在时与存在于同一表面上的CD73上的表位结合的示例性抗体，例如潜在地允许抗体与一个CD73二聚体二价地结合，尤其是处于“闭合”位置，其中结合位点在空间上进一步分离。鉴于结合至与配体结合的CD73，当与AMP(例如在上游ADP和/或AMP在治疗之前以显著水平存在的肿瘤环境中)结合时，本文所描述的抗体可用于结合CD73。肿瘤微环境可以通过任何适当的参数来表征，例如高水平的ADP(例如由死亡细胞产生的)，被基质和细胞渗透物(例如TReg细胞)上的CD39摄取以产生高水平的AMP，以及更通常地通过AMP、腺苷，通过CD39表达或表达CD39的细胞的存在或水平，通过CD73表达或表达CD73的细胞的存在或水平，通过腺苷受体表达或表达腺苷受体的细胞的存在或水平。因此，肿瘤环境中的CD73分子可以处于底物结合的构型中，并且除了非底物结合的CD73之外，还结合和抑制底物结合的细胞CD73(例如，表达CD73的细胞与底物例如AMP预孵育)的能力可以在体内提供更大的抑制CD73的能力。任选地，可以在治疗之前在肿瘤环境中评估ADP或AMP(和/或ATP或腺苷)的水平。这些抗体对于在肿瘤样品中具有显著水平(例如，与参考相比的高水平)的ADP、AMP、ATP或腺苷的个体中的治疗可以具有特别的优势。因此，在一个方面，本披露提供了结合在细胞表面表达的人CD73多肽并且抑制CD73多肽的酶(胞外-5'-核苷酸酶)活性的抗体，其中该抗体能够二价地结合单个CD73多肽二聚体(由细胞表达的可溶性CD73多肽二聚体或CD73多肽二聚体)。任选地，抗体用第一抗原结合结构域结合至二聚体内的第一CD73多肽，并且用第二抗原结合结构域结合至第二CD73多肽。在一个方面，该抗体是CD73多肽的变构抑制剂。因此，在另一个方面，本披露提供了结合在细胞表面表达的人CD73多肽并且抑制CD73多肽的酶(胞外-5'-核苷酸酶)活性的抗体，其中该抗体能够结合处于底物结合构象的CD73多肽。尽管文献中筛选CD73抑制抗体的努力，现有抗体不中和细胞CD73，或者最多引起CD73下调。诸位发明人在本文中提供了为什么这些抗体不再抑制细胞中的CD73的解释：能够以二价方式结合CD73同源二聚体并且抑制在溶液中的重组CD73的抗体可以引起CD73多肽和抗CD73抗体的寡聚化成复合体(例如含有多于两种或更多种抗体和两种或更多种CD73二聚体的结构)，这呈现出区分真实抑制剂与假阳性的困难。通过设计在更高过量的抗体:酶下进行的改进的测定方法，我们在本文中提出了具有二价结合CD73的抗体，该抗体在寡聚化时没有依赖性。特别地，当抗体处于不能形成寡聚体的布置/构型时，例如当将它们以大量的摩尔过量(例如至少10倍、20倍、100倍等)提供给CD73多肽二聚体时，本文提供的抗CD73抗体能够抑制可溶性人二聚体CD73多肽的酶活性。当将抗体以大量的摩尔过量提供给CD73多肽二聚体时，通过引起寡聚化而起作用的抗体不能抑制CD73。此外，抗体结合CD73上的表位，当CD73在细胞表面表达时维持该表位。通过使用该测定，还可以鉴定与单一CD73二聚体二价地结合的抗体；此类抗体可以在表达CD73的细胞中在体外和体内具有改善的CD73结合和CD73阻断活性。然后使用纯化的抗体在细胞酶活性测定中测试通过这些方法所鉴定的抗体，并且发现该抗体中和细胞CD73的酶活性。通过诱导内化来抑制CD73或丧失与细胞CD73的显著结合具有更低的抗体效力，并且不能中和酶活性，最多只提供对细胞中CD73的酶活性的部分抑制。由这些抗体结合的CD73上的表位存在于如由一系列细胞(例如癌细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、转染的细胞)表达的CD73多肽上，并且以如通过流式细胞术所确定的高亲和力进行结合。例如，抗体的特征可以在于对在其表面表达CD73多肽的细胞的结合的不超过5μg/ml，任选地不超过2μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml、不超过0.1μg/ml或不超过0.05μg/ml的EC50，如通过流式细胞术所确定的。在一个实施例中，细胞是用来在其表面表达CD73的细胞。在一个实施例中，细胞是在其表面上内源地表达CD73的细胞，例如癌细胞、白血病细胞、膀胱癌细胞、胶质瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞、卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞、前列腺癌细胞、甲状腺癌细胞、食道癌细胞或乳腺癌细胞。在一个实施例中，CD73中和抗体的特征可以在于能够使CD73的细胞的5’-胞外核苷酸酶活性降低至少60％、75％或80％。在一个实施例中，CD73中和抗体的特征可以在于抑制由细胞表达的CD73的5'-胞外核苷酸酶活性的不超过1μg/ml，任选地不超过0.5μg/ml，任选地不超过0.2μg/ml的EC50。任选地，通过将AMP定量水解成腺苷来评估在MDA-MB-231细胞中5'-胞外核苷酸酶活性的中和，从而确定由细胞表达的CD73的5'-胞外核苷酸酶活性的抑制(参见例如实例5)。由本文披露的中和抗体结合的CD73上的表位不导致细胞上CD73表达的下调(并且，例如，不引起抗体-CD73复合体的聚集和内化)，包括当使用以二价方式结合CD73的全长抗体时。因此，抗CD73抗体与CD73一起保持结合在细胞表面。鉴于CD73的广泛的组织表达，不引发CD73下调和/或内化的抗体可以在肿瘤微环境中提供改善的药理学特性和更大量的抗体。在一个实施例中，提供了特异性结合人CD73(例如包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的多肽)并且中和溶液中同源二聚体人CD73多肽的5'-胞外核苷酸酶活性的分离抗体。在一个实施例中，提供了结合并抑制可溶性人CD73多肽的酶活性的抗体，尤其是中和CD73介导的将AMP分解代谢为腺苷的抗体。在一个实施例中，抗体以二价方式结合CD73。在一个实施例中，抗体是非消耗性抗体，例如Fc沉默抗体。在一个实施例中，抗体中和溶液中的CD73而不依赖于CD73多肽:抗CD73抗体寡聚体的诱导。在一个实施例中，提供了特异性结合在细胞表面的人CD73并且能够中和可溶性人CD73多肽的5'-胞外核苷酸酶活性的分离抗体。在一个实施例中，抗体不诱导可溶性CD73的寡聚化。在一个实施例中，提供了特异性结合在细胞表面的人CD73并且能够中和细胞CD73(由细胞表达的CD73)的5'-胞外核苷酸酶活性的分离抗体。在一个实施例中，提供了特异性结合细胞表面的人CD73并且能够中和细胞表面的人CD73的5'-胞外核苷酸酶活性并且在结合CD73后不内化到表达CD73的细胞中的分离抗体。该抗体不引起CD73的多聚化和亚序列内化。在一个实施例中，提供了结合在溶液中的重组人CD73多肽并且能够抑制在溶液中的重组人CD73多肽的酶活性的抗体，其中所述抗体不内化到表达CD73的细胞中。在一个实施例中，非内化抗体以二价方式结合CD73。在一个实施例中，抗体是非消耗性抗体，例如Fc沉默抗体。该抗体能够中和在溶液中的二聚体人CD73多肽的5'-胞外核苷酸酶活性，而且不依赖于CD73多肽:抗CD73抗体寡聚体的诱导。在一个实施例中，提供了特异性二价地结合人CD73多肽并且抑制细胞人CD73(以及任选地进一步的重组可溶性人CD73)的酶活性的抗体，其中所述抗体不内化到表达CD73的细胞中。优选地，抗体基本上缺乏Fcγ受体结合(例如经由其Fc结构域)。在一个方面，提供了特异性结合与AMP一起预孵育的细胞表面的人CD73并且能够中和其5'-胞外核苷酸酶活性的分离抗体。任选地，通过定量AMP向腺苷的水解来评估在MDA-MB-231细胞中的5'-胞外核苷酸酶活性的中和，从而确定中和的5'-胞外核苷酸酶活性(参见例如实例5)。在本文的任何实施例中，抗体的特征可以在于能够结合其活性位点被底物(例如AMP、APCP)占据的人CD73多肽。在本文的任何实施例中，抗体的特征可以在于当表达CD73的细胞已经与AMP预孵育时能够抑制此类细胞的5'-胞外核苷酸酶活性。本发明还尤其起因于人CD73上的表位的发现，其允许高度有效的靶向以中和患有癌症的细胞和个体中的CD73活性。抗体彼此竞争结合CD73(但不与参考可溶性CD73阻断抗体竞争)，表明CD73上的区域特别适合于抑制CD73的酶活性并且保持存在于CD73多肽(当在细胞表面表达时)上。有利地，表位存在于如在细胞表面上表达的人和非人灵长类动物CD73中的每一个上，以及存在于如由癌细胞表达的CD73上。在一个方面，提供了与存在于可溶性CD73和在细胞表面表达的CD73上的共同抗原决定簇结合的抗CD73抗体。在一个方面，提供了结合存在于处于“开放”构象时(当CD73活性位点不被底物例如AMP、APCP占据/结合时)的CD73和处于“闭合”构象时(当CD73活性位点被底物例如AMP、APCP占据/结合时)的“闭合”CD73上的共同抗原决定簇的抗CD73抗体。在一个方面，提供了结合CD73二聚体内每个CD73多肽链内的抗原决定簇的抗CD73抗体，例如，其中该抗原决定簇存在于CD73二聚体的共同面上。在一个方面，提供了与CD73上的表位结合的抗CD73抗体，该CD73包含一个、两个、三个、四个或五个残基，该残基选自下组，该组由以下各项组成：A99、E129、K133、E134、和A135(相对于SEQIDNO:1)。在一个方面，提供了与具有突变的CD73多肽具有降低的结合的抗CD73抗体，该突变是在选自下组的残基处，该组由以下各项组成：A99、E129、K133、E134、和A135(相对于SEQIDNO:1)；任选地，突变的CD73多肽具有突变：A99S、E129A、K133A、E134N、和A135S。在一个方面，提供了竞争结合被11E1、8C7、3C12和/或6E1结合的CD73上的表位的抗CD73抗体，(例如，与具有11E1、8C7、3C12或6E1中任何一个的重链CDR和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合CD73多肽上的表位的抗CD73抗体)。在本文任何实施例的一个方面，提供了结合相同表位和/或与单克隆抗体11E1、8C7、3C12和/或6E1竞争结合CD73多肽的结合抗原的化合物(例如，与具有11E1、8C7、3C12或6E1中任何一个的重链CDR和轻链CDR或可变区的抗体竞争结合CD73多肽的结合抗原的化合物)。在一个实施例中，提供了结合相同表位和/或与选自下组的抗体竞争结合CD73多肽的结合抗原的化合物，该组由以下各项组成：(a)分别具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的VH区和VL区的抗体(11E1)；(b)分别具有SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的VH区和VL区的抗体(6E1)(c)分别具有SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的VH区和VL区的抗体(8C7)；以及(a)分别具有SEQIDNO:36和SEQIDNO:37的VH区和VL区的抗体(3C12)。在一个实施例中，抗CD73抗体结合包含选自下组的一个、两个或三个氨基酸残基的表位，该组由以下各项组成：被11E1、6E1、3C12或8C7结合的CD73上的氨基酸残基。在一个实施例中，CD73上的氨基酸残基选自下组，该组由以下各项组成：在表1中所列出的残基。在本文任何实施例的一个方面，抗体可以具有重链和/或轻链，所述重链和/或轻链具有选自下组的抗体的相应重链和/或轻链的一个、两个或三个CDR，该组由以下各项组成：抗体11E1、6E1、3C12和8C7。在本文的任何实施例中，抗CD73抗体的特征可以在于与细胞(例如肿瘤细胞，用来表达CD73的细胞，例如MDA-MB-231肿瘤细胞系，或用来表达CD73的重组宿主细胞，如实例中所示)表面上表达的人CD73多肽结合，并且另外任选地其中该抗体以如通过流式细胞术所确定的高亲和力结合。例如，抗体的特征可以在于对在其表面表达CD73多肽的细胞(例如表达CD73的肿瘤细胞、在其表面表达CD73多肽的细胞、表达CD73的淋巴细胞等)结合的不超过5μg/ml，任选地不超过1μg/ml，不超过0.5μg/ml，不超过0.1μg/ml或不超过0.05μg/ml的EC50，如通过流式细胞术确定的。任选地，结合抗原的化合物具有与(i)在其表面表达人CD73的细胞(例如具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽)和/或(ii)在其表面表达人非人灵长类CD73(例如食蟹猴CD73)的细胞结合的不超过1μg/ml，任选地不超过0.5μg/ml，不超过0.1μg/ml或不超过0.05μg/ml的EC50。在本文任何实施例的一个方面，抗CD73抗体是包含两条重链和两条轻链的四聚抗体，这些重链包含人同种型的Fc区，并且其基本上缺乏对人Fcγ受体(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64)的结合。在一个实施例中，以足以中和肿瘤微环境中CD73活性的量和频率向患有癌症的个体给予这些抗体。在一个实施例中，以足以降低肿瘤微环境中腺苷的产生和/或浓度的量和频率给予这些抗体。在一个实施例中，以足以增加肿瘤微环境中ATP的产生和/或浓度的量和频率给予这些抗体。在一个实施例中，以足以中和由肿瘤细胞表达的CD73的活性的量和频率给予这些抗体。在一个实施例中，以足以中和由CD4T细胞、CD8T细胞和/或B细胞表达的CD73的活性的量和频率给予这些抗体。这些抗体将被用于抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷，例如降低肿瘤微环境中腺苷的浓度。因此，这些抗体将被用于逆转CD73和/或腺苷对表达腺苷受体的T细胞、B细胞和其他细胞的免疫抑制作用，例如用于治疗癌症。在一个实施例中，抗CD73抗体中和对T细胞中增殖、细胞因子产生、细胞毒性和/或NFκB活性的腺苷介导的抑制。因为CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷是不可逆的，而通过CD39将ATP分解代谢成ADP和将ADP分解代谢成AMP是可逆的(分别通过NDK激酶和腺苷酸激酶)，阻断不可逆的CD73介导的分解代谢的抗体将增加AMP的库，从而用于增加ADP和ATP的浓度，例如，在肿瘤微环境中。这些抗体可以用于增加从AMP形成ADP和从ADP形成ATP。由于ATP具有免疫激活作用，抗CD73抗体可以用于激活T细胞，例如用于治疗癌症。这些抗体将用于抑制肿瘤微环境中腺苷的产生、量和/或浓度。中和可溶性人CD73多肽二聚体的活性的抗体可以在任何其它合适的环境中进一步中和CD73，例如在用来表达CD73的报告细胞中、在T细胞中等。提供了用于治疗个体的方法，该方法包括向个体(例如患有疾病、肿瘤等的个体)给予治疗活性量的本文所述的任何抗CD73结合抗原的化合物。在一个方面，提供了用于治疗个体的方法，该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：向个体(例如患有疾病、肿瘤等的个体)给予治疗活性量的抑制CD73多肽的本披露的结合抗原的化合物。在一个实施例中，抗体在细胞的和任选地进一步的非细胞的测定中抑制CD73多肽，例如重组CD73、可溶性CD73。优选地，该化合物是非消耗性抗体(不消耗其结合的细胞的抗体，例如Fc沉默抗体)。任选地，该化合物以二价方式结合CD73。任选地，该抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。任选地，该抗体包含IgG4同种型的重链恒定区。在一个方面，提供了用于减少由表达CD73的细胞(例如个体中的免疫细胞和/或肿瘤细胞)产生的腺苷的方法，或用于中和细胞CD73的酶活性的方法，该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：使表达CD73的细胞与抑制CD73的本披露的结合抗原的化合物接触。在一个实施例中，使表达CD73的细胞与本披露的结合抗原的化合物接触的步骤包括向个体给予治疗活性量的抑制CD73的结合抗原的化合物。在一个实施例中，该个体患有癌症。在一个方面，提供了用于减少存在于肿瘤环境中(例如在个体中)的腺苷的方法，该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：向个体给予治疗活性量的抑制CD73多肽的结合抗原的化合物。在一个实施例中，该个体患有癌症。在一个实施例中，抑制CD73多肽的结合抗原的化合物的活性量是有效实现和/或维持(例如，直到随后给予结合抗原的化合物)用于抑制个体中CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷的至少EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的血液浓度的量。在一个实施例中，抑制CD73多肽的抗原结合化合物的活性量是有效实现在个体的血管外组织中抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷的EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的量。在一个实施例中，抑制CD73多肽的结合抗原的化合物的活性量是有效实现在个体中抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷的EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的量。在一个实施例中，抑制CD73多肽的结合抗原的化合物的活性量为1和20mg/kg体重之间。在一个实施例中，每周、每两周、每月或每两个月一次向个体给予活性量。任选地，个体是患有或易患癌症的人。任选地，抗体的特征在于小于(优于)10-9M，优选小于10-10M，或优选小于10-11M的对于人CD73多肽的结合亲和力(KD)，和/或特征在于以低于(更优的结合)1μg/ml的EC50结合人CD73，优选其中该抗体具有与在细胞表面表达人CD73的细胞(例如肿瘤细胞)结合的不超过0.5μg/ml、任选地不超过0.2μg/ml、任选地不超过0.1μg/ml的EC50。任选地，抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。任选地，抗体的特征在于中和在表达CD73的细胞中的CD73的酶活性的EC50小于(优于)1μg/ml，任选地小于0.5μg/ml。在一个实施例中，抗体是保留结合特异性和中和CD73的酶活性的能力的单克隆抗体或其片段。在一个实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。例如，抗体可以是包含人IgG4同种型的Fc结构域的抗体，或包含任何人IgG同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc结构域(该Fc结构域经修饰以减少Fc结构域与Fcγ受体(例如CD16)之间的结合)的抗体。优选地，结合抗原的化合物不包含能够诱导抗体介导的细胞毒性(ADCC)和/或CDC的Fc结构域；任选地，结合抗原的化合物不包含能够基本上结合FcγRIIIA(CD16)多肽的Fc结构域(例如，包含不能基本上结合FcγRIIIA(CD16)多肽的Fc结构域；缺乏Fc结构域(例如缺少CH2和/或CH3结构域；包含IgG4同种型的Fc结构域)。在一个实施例中，与野生型Fc结构域相比，该Fc结构域(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的)包含氨基酸修饰(例如取代)，其中该取代降低Fc结构域(或含有它的抗体)结合Fcγ受体(例如CD16)和/或结合补体的能力。任选地，如果存在IgG4同种型的Fc结构域，那么此类Fc结构域可以包含稳定的突变以减少半抗体的形成，例如铰链中的突变，例如S241P(S228P)突变。任选地，结合抗原的化合物由以下各项组成或包括：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体。在一个实施例中，结合抗原的化合物不与毒性部分连接。还提供了编码具有任何上述性质的人或人源化抗体或抗体片段的核酸、包含此类核酸的载体、包含此类载体的细胞、和产生人抗CD73抗体的方法，该方法包括在适合于表达抗CD73抗体的条件下培养这样的细胞。本披露还涉及组合物，例如药学上可接受的组合物和试剂盒，该组合物包含这样的蛋白质、核酸、载体和/或细胞并且典型地一种或多种另外的成分，该成分可以是促进配制、递送、稳定性或组合物(例如，各种载体)的其他特征的活性成分或非活性成分。本披露进一步涉及，例如在调节CD73介导的生物活性中，例如在治疗与其相关的疾病(尤其是癌症)中，制造和使用此类抗体、核酸、载体、细胞、生物体和/或组合物的各种新的和有用的方法。本披露还提供了产生或测试结合和中和CD73的酶活性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供结合CD73多肽的多种抗体，(b)使每种所述抗体与可溶性CD73多肽(例如在无细胞测定中，例如在AMP的存在下)接触(例如，彼此分开)，和(c)选择中和所述可溶性CD73多肽的酶活性的抗体(例如步骤(b)的那些)。在一个实施例中，抗体能够以二价方式结合CD73呈，例如这些抗体是全长IgG抗体。任选地，步骤(b)包括在无细胞测定中使每种所述抗体与可溶性CD73多肽接触，其中以摩尔过量的抗体(与CD73多肽相比)提供抗体。任选地，CD73多肽是可溶性CD73二聚体。任选地，步骤(c)包括当抗体以相对于CD73二聚体的摩尔过量的抗体(例如，至少2倍、5倍、10倍、或100倍摩尔过量)提供时，选择中和所述可溶性CD73多肽的酶活性的抗体。在一个实施例中，提供多种抗体的步骤包括用包含CD73多肽的免疫原来免疫非人哺乳动物。本披露还提供了增强对其有需要的受试者中淋巴细胞(例如，T细胞)的活性或恢复淋巴细胞(例如T细胞)的活性的方法，或提供了减轻腺苷介导的对淋巴细胞(例如，T细胞)的抑制的方法，该方法包括向受试者给予有效量的任何上述组合物。在一个实施例中，受试者是患有癌症的患者。例如，患者可能患有实体瘤，例如结肠直肠癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。可替代地，患者可能患有造血细胞癌，例如急性髓细胞白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤。本披露还提供了治疗个体中的疾病的方法，该治疗包括向个体给予中和CD73的酶活性的抗CD73抗体至少一个给予周期，其中以有效实现和/或维持在抗CD73抗体的两次连续给予之间，对应于用于中和CD73的酶活性的至少EC50(在0.01和0.5g/ml之间的EC50)、任选地EC70或任选地EC100(例如在0.05和1μg/ml之间，在0.1和1g/ml之间的EC100)的血液(血清)或血管外组织(例如肿瘤环境)中的浓度的量，给予抗CD73抗体至少一次、任选地至少两次。抗体可以例如以实现和/或维持在循环中或血管外组织(例如肿瘤环境)中至少约0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml或2μg/ml的浓度的量给予。例如，为了实现在血管外组织中在0.05和1μg/ml或在0.1和1μg/ml之间的浓度，抗CD73抗体以有效实现在0.5和10μg/ml之间或在1和10μg/ml之间的抗CD73抗体的循环中的浓度的量给予。任选地，将抗CD73抗体给予至少两次，并且在抗CD73抗体的两次连续给予之间和/或在整个给予周期中，以有效维持至少上述浓度的抗CD73抗体浓度的量给予至少1周、2周、3周、4周。本披露还提供了治疗个体中的疾病的方法，该治疗包括向个体给予中和CD73的酶活性的抗CD73抗体至少一个给予周期，其中以有效实现和/或维持在抗CD73抗体的两次连续给予之间，至少1μg/ml、任选地至少10μg/ml、任选地在1和100μg/ml之间的抗CD73抗体的血液或组织浓度的量，给予该抗CD73抗体至少一次、任选地至少两次。任选地，将抗CD73抗体给予至少两次，并且在抗CD73抗体的两次连续给予之间和/或在整个给予周期中，以有效维持至少1μg/ml、任选地至少10μg/ml、任选地在1和100μg/ml之间的抗CD73抗体的连续的血液或组织浓度的量给予至少1周、2周、3周、4周。将这些方面更详细地描述于在此提供的说明书中，并且另外的方面、特征和优点将从该说明书中显而易见。附图说明图1显示通过测量测试mAb的能力来评估抗CD73抗体阻断CD73的酶活性的能力，该测试mAb的能力将影响CD73将AMP切割成腺苷+无机磷酸盐而恢复荧光素酶活性和光发射的能力。结果表示为残余酶活性(％)。抗体11E1、8C7、6E1和3C12(未示出)引起酶活性的强烈降低，并且即使以过量的免疫复合体非依赖性布置提供时仍继续降低残余酶活性。图2显示通过ELISA对可溶性重组人CD73多肽滴定抗体的结果。图3显示了通过流式细胞术在表达人CD73、食蟹猴CD73和小鼠CD73的重组宿主细胞系上滴定抗体的结果。11E1、8C7、3C12和6E1，而不是7G2或1E9，以极好的亲和力结合表达人和食蟹猴(而不是小鼠)CD73的重组宿主细胞。图4显示了通过流式细胞术对内源性表达CD73的人MDA-MB-231乳腺癌细胞滴定抗体的结果。11E1、8C7、3C12和6E1，而不是7G2或1E9以极好的亲和力结合MDA-MB-231细胞。图5显示抗体11E1、8C7、3C12和6E1中和细胞CD73的酶活性。图6显示各种抗体引起细胞上CD73表达下调的能力。AD2、7G2和1E9中的每一个都引起CD73的下调，然而抗体11E1、8C7、3C12、或6E1中没有一个引起细胞表面CD73的减少。图7显示通过流式细胞术在表达人CD73突变体的细胞上滴定抗体。抗体3C12结合野生型CD73和突变体2，但不结合突变体3，而抗体AD2结合野生型CD73和突变体3，但不结合突变体2。图8A显示了CD73二聚体的分子结构，其中在“开放”或“闭合”两种构型中指示出突变体2(AD2的结合丧失)中突变的氨基酸(白圈)。图8B显示了CD73二聚体的分子结构，其中在“开放”或“闭合”两种构型中指示出突变体3(由11E1、8C7、3C12或6E1的结合丧失)中突变的氨基酸。活性位点由框(虚线)指示出。具体实施方式定义如在说明书中使用的，“一种/一个(a/an)”可以意指一种/一个或多种/多个。如在权利要求中使用的，当与词“包括(comprising)”结合使用时，这些词“一种/一个(a/an)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。如在此所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。当使用“包括”时，这可以任选地被“基本上由......组成”或通过“由......组成”代替。人CD73也称为胞外-5'-核苷酸酶和5-原-核糖核苷酸磷酸水解酶，EC3.1.3.5，由NT5E基因编码，展示5'-核苷酸酶(尤其是AMP-、NAD-、和NMN-核苷酸酶)活性。CD73催化嘌呤5-原单核苷酸在中性pH下向核苷酸的转化，优选的底物是AMP。该酶由通过糖基磷脂酰肌醇键连接到质膜外表面的2个相同70-kD亚基的二聚体组成。人CD73前蛋白(单体)的氨基酸序列，包括氨基酸1-26的信号序列，在基因库(Genbank)中以登录号NP_00251显示，其全部披露内容通过引用结合在此，并且如下：在本文的上下文中，“中和CD73的酶活性”是指抑制CD73的5'-核苷酸酶(5'-胞外核苷酸酶)活性的过程。这尤其包括抑制CD73介导的腺苷产生，即抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷。这可以例如在无细胞测定中进行测量，该无细胞测定测量测试化合物抑制AMP直接或间接转化为腺苷的能力。在一个实施例中，抗体制剂引起AMP向腺苷的转化降低至少50％，AMP向腺苷的转化降低至少70％，或AMP向腺苷的转化降低至少80％，参考例如本文所述的测定法。当在这整个说明书中关于抗CD73结合剂(例如抗体)提及“癌症的治疗”或类似物时，意味着：(a)治疗癌症的方法，所述方法包括向对此类治疗有需要的个体、哺乳动物、特别是人，以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)，优选以如本文说明的剂量(量)给予(对于至少一种治疗)抗CD73结合剂(优选在药学上可接受的载体材料中)的步骤；(b)抗CD73结合剂用于治疗癌症的用途，或抗CD73结合剂用于所述治疗(特别是在人类中)的用途；(c)抗CD73结合剂在制备用于治疗癌症的药物制剂中的用途，使用抗CD73结合剂在制备用于治疗癌症的药物制剂中的方法，该方法包括将抗CD73结合剂与药学上可接受的载体混合，或包含有效剂量的适合于治疗癌症的抗CD73结合剂的药物制剂；或(d)a)、b)、和c)的任何组合，依照在提交本申请的国家允许专利的主题。如在此所使用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。取决于重链中恒定区的类型，抗体可以指定为以下五个大类中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。这些中有几个被进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及类似物。一种示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对包括一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别命名为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。IgG是在此使用的示例性抗体类别，因为它们是生理状况下最常见的抗体且在实验室布置下最容易制备。任选地，抗体是单克隆抗体。抗体的具体实例是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或其他适合人的抗体。“抗体”还包括在此描述的任一抗体的任一片段或衍生物。术语“特异地结合到”意指优选地在竞争性结合测定中抗体可以结合到结合伴侣(例如CD73)上，正如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其他方法在下面进一步说明，并且在本领域内是公知的。当抗体被称为与一种具体的单克隆抗体竞争时，它意指在使用重组体CD73分子或表面表达的CD73分子的结合测定中，该抗体与该单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低参考抗体与CD73多肽或表达CD73的细胞的结合，那么该抗体被称为对应与参考抗体“竞争”。如本文使用的术语“亲和力”意指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力通过解离常数Kd(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为1/Kd。用于确定mAb的亲和力的方法可以发现于哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港实验室(ColdSpringHarbor)，纽约州(N.Y.)，1988)，科尔根(Coligan)等人，编辑，当代免疫学实验手册(CurrentProtocolsinImmunology)，格林出版联盟和威利国际科学出版公司(GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience)，纽约州，(1992，1993)，以及马勒(Muller)，酶学方法(Meth.Enzymol.)92:589-601(1983)，将这些文献通过引用完全结合在此。本领域中熟知的用于确定mAb亲和力的一种标准的方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置分析)。在本文的上下文中，“决定簇”指定多肽上相互作用或结合的位点。术语“表位”是指抗原决定簇，并且是在抗原上与抗体结合的面积或区域。一个蛋白表位可以包括直接涉及结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效地阻断的氨基酸残基(即抗体“足迹”内的氨基酸残基)。它是可以与例如一种抗体或一种受体组合的复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可以是直链的或构象性的/结构性的。术语“直链的表位”被定义为由多个氨基酸残基组成的表位，这些氨基酸残基在氨基酸的直链序列(一级结构)上是连续的。术语“构象性表位或结构性表位”被定义为由多个氨基酸残基构成的表位，这些氨基酸残基不全是连续的，并且因此表示了通过分子折叠(二级、三级和/或四级结构)而彼此邻近的氨基酸直链序列的分离的部分。构象性表位取决于三维结构。因此，术语“构象性”通常与“结构性”可互换地使用。关于表达CD73的细胞，术语“消耗(deplete或depleting)”意指导致杀死、消除、裂解或诱导此类杀死、消除或裂解的过程、方法、或化合物，以便负面影响存在于样品或受试者中的这样的表达CD73的细胞的数量。术语“内化”，与“细胞内内化”互换地使用，是指与将分子从细胞的细胞外表面转移到细胞的细胞内表面的过程相关的分子的、生物化学的和细胞的事件。负责分子的细胞内内化的过程是众所周知的，并且可以涉及(尤其)细胞外分子(例如激素、抗体和小有机分子)的内化；膜相关分子(例如细胞表面受体)；和与细胞外分子结合的膜结合分子(例如与跨膜受体结合的配体或与膜相关分子结合的抗体)的复合体。因此，“诱导和/或增加内化”包括其中开始细胞内内化和/或增加细胞内内化的速率和/或程度的事件。在此使用术语“试剂”来表示化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。术语“治疗剂”是指一种具有生物活性的试剂。处于本文的目的，“人源化”抗体或“人”抗体是指其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)相融合的抗体。此类抗体被设计成保持衍生出这些结合区的非人类抗体的结合特异性，但是却要避免对非人类抗体的免疫反应。这类抗体可以从转基因小鼠或其他动物体内得到，这些小鼠或动物已经被“工程化”从而产生响应于抗原激发的特异性人类抗体((参见，例如，格林(Green)等人(1994)自然遗传学(NatureGenet)7:13；朗伯格(Lonberg)等人(1994)自然368:856；泰勒(Taylor)等人(1994)国际免疫学(IntImmun)6:579，将其全部传授内容通过引用结合在此)。还可以通过遗传或染色体转染方法、以及噬菌体展示技术来构建完整的人抗体，其全部在本领域中是已知的(参见，例如，麦卡弗蒂(McCafferty)等人(1990)自然348:552-553)。也可以通过体外活化的B细胞产生人抗体(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，其通过引用以其全文结合)。一种“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)对恒定区或其一部分进行改变、置换或交换，从而将抗体结合位点(可变区)被连接于类别、效应器功能和/或种属不同(或已改变的)的一个恒定区，或是一种完全不同的分子，该分子对该嵌合抗体赋予新的属性，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)将该可变区或其一部分用具有不同或已经改变的抗原特异性的一个可变区进行改变、置换或交换。当在本文中使用时，术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；卡巴特(Kabat)等人(1991)和/或来自“超变环”的那些残基(例如，在轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；乔西亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol)1987；196:901-917)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。典型地，这个区域中的氨基酸残基的编号通过卡巴特(Kabat)等人，同上中所描述的方法进行。短语例如本文的“卡巴特(Kabat)位置”，“如在卡巴特中对可变域残基进行编号”和“根据卡巴特”是指用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用卡巴特编号系统，实际的直链氨基酸序列可以含有对应于可变域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变域可以包含在CDRH2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b和82c等)。可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。如本文使用的“框架”或“FR”残基意指排除定义为CDR的那些区域的抗体可变域的区域。每个抗体可变域框架可以进一步细分为由CDR(FR1、FR2、FR3和FR4)分开的连续区域。术语“Fc结构域”、“Fc部分”、“Fc区域”是指抗体重链的C端片段，例如人类γ(伽马)重链的从约氨基酸(aa)230至约aa450或它在其他类型的抗体重链中的对应序列(例如人类抗体的α、δ、ε和μ)，或其天然发生的同种异型。除非另有说明，在这整个披露中使用通常接受的免疫球蛋白的卡巴特氨基酸编号(参见卡巴特等人(1991)免疫学目的的蛋白质序列(SequencesofProteinofImmunologicalInterest)，第5版，美国公共卫生服务(UnitedStatesPublicHealthService)，国立卫生研究所(NationalInstituteofHealth)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州)。术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指基本上或基本上不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。典型地使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来确定纯度和均匀性。制剂中存在的主要种类的蛋白基本上是纯化的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”本文可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用到天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物上。当提及例如细胞或核酸、蛋白或载体时使用术语“重组”是指该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源性核酸或蛋白或通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者表示该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，这些重组体细胞表达在细胞的天然形式(非重组体)中未发现的基因或表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。在本文的上下文中，术语“结合”多肽的或表位的抗体指定结合所述具有特异性和/或亲和力的决定簇的抗体。术语“一致性”或“一致的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列关联程度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配的数目来确定的。“一致性”用通过一种特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决的间隙比对(如果存在的话)测量了两个或更多个序列中较小者之间一致性匹配的百分比。相关多肽的一致性可以通过已知方法容易地计算出。此类方法包括但不限于在以下文献中所描述的方法：计算分子生物学，莱斯克，A.M.，编辑，纽约州牛津大学出版社，1988(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988)；生物运算：信息学和基因组项目，史密斯，D.W.，编辑，纽约州学术出版社，1993(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993)；序列数据的计算机分析，第1部分，格里芬，A.M.，和格里芬，H.G.，编辑，新泽西州胡玛纳出版社，1994(ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994)；分子生物学的序列分析，vonHeinje,G.,学术出版社，1987(SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987)；序列分析引物，格里布斯考，M.，和德弗罗，J.，编辑，纽约州斯托克顿出版社，1991(SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M.StocktonPress,NewYork,1991)；以及卡里洛等人，SIAM，应用数学杂志，48，1073(1988)(Carilloetal.,SIAMJ.AppliedMath.48,1073(1988))。用于确定一致性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。确定一致性的方法描述于可公开获得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的一致性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(德弗罗(Devereux)等人，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)12，387(1984)；威斯康辛州麦迪逊市，威斯康辛大学，遗传学计算机组(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.))、BLASTP、BLASTN、和FASTA(阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215，403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST手册，阿尔丘尔(Altschul)等人，NCB/NLM/NIH，贝塞斯达，马里兰州，20894；阿尔丘尔(Altschul)等人，同上)得到。熟知的史密斯-沃特曼算法(SmithWatermanalgorithm)也可以用来确定一致性。抗体的产生可用于治疗癌症的抗CD73剂结合人CD73多肽的细胞外部分，并且中和在细胞(例如肿瘤细胞)表面上表达的CD73的酶活性。在一个实施例中，试剂抑制CD73的5'-胞外核苷酸酶活性。在一个实施例中，抗体抑制CD73介导的腺苷产生。在一个实施例中，抗体抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷。在一个实施例中，抗体抑制腺苷介导的淋巴细胞活性(例如T细胞)抑制。在一个实施例中，抗体结合和/或抑制CD73上的酶活性位点。在一个方面，试剂是一种抗体，该抗体选自全长抗体、抗体片段和合成或半合成抗体衍生的分子。在一个方面，试剂是一种抗体，该抗体选自完整人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。在一个方面，试剂是包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域的抗体片段。在一个方面，试剂是选自Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、VHH片段、单结构域FV和单链抗体片段。在一个方面，试剂是合成或半合成抗体衍生的分子，其选自scFV、dsFV、微型抗体、双抗体、三抗体、κ体、IgNAR；和多特异性抗体。因此，本披露涉及结合CD73的抗体或其他抗原结合试剂。在一个方面，抗体是至少部分纯化的形式。在一个方面，抗体是基本上分离的形式。这些抗体可以通过多种本领域中已知的技术产生。典型地，它们可以通过用包括CD73多肽(优选人CD73多肽)的免疫原来免疫非人类动物(优选小鼠)来产生。该CD73多肽可以包括人CD73多肽的全长序列、或其片段或衍生物，典型地为免疫原片段，即，包括暴露于表达CD73多肽的细胞表面上的表位的多肽的一部份。这类片段典型地包含至少约7个连续氨基酸的成熟多肽序列，甚至更优选地是至少约10个连续氨基酸的成熟多肽序列。片段典型地基本上是从受体的胞外结构域衍生的。在一个实施例中，免疫原包含在脂质膜(典型地在细胞的表面)内的野生型人CD73多肽。在一个具体实施例中，免疫原包括完整的细胞，具体是完整的人类细胞(任选地经处理或裂解的)。在另一个实施例中，多肽是重组CD73多肽。对非人类哺乳动物用抗原免疫进行免疫的步骤可以按任何本领域中熟知的方式进行，以刺激在小鼠体内产生抗体(参见，例如E.哈洛(Harlow)和D.拉内(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual.)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约州(NY)(1988)，将该文献的全部披露通过引用结合在此)。免疫原任选地用佐剂(例如完全的或不完全的弗氏佐剂)悬浮或溶解于缓冲剂中。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法对于本领域的普通技术人员来说是熟知的并且不以任何方式限制。对于不同的免疫原而言，这些参数是不同的，但是易于说明。类似地，足以刺激产生抗体的免疫的位置和频率也是本领域中熟知的。在一个典型的免疫实验方案中，在第1天用抗原腹膜内注射非人类动物并且在约1周之后再次注射。随后在第20天左右进行抗原的记忆注射(recallinjection)，任选地，与佐剂例如不完全弗氏佐剂一起注射。经静脉内进行该记忆注射，并且可重复持续连续数天。随后在第40天进行加强注射，经静脉内或腹膜内，典型地不含佐剂。这种实验方案导致在约40天后产生抗原特异的产生抗体的B细胞。还可以使用其他实验方案，只要它们导致产生表达抗体的B细胞，该抗体针对在免疫中使用的抗原。对于多克隆抗体制剂，血清获自免疫的非人类动物，并且存在于其中的抗体是通过熟知的技术分离的。血清可以使用以上列出的连接到固体载体上的免疫原中的任何一种来亲和纯化，从而得到与CD73多肽进行反应的抗体。在一个替代实施例中，将来自未经免疫的非人类哺乳动物的淋巴细胞进行分离、体外培养，并且然后暴露于在细胞培养物中的免疫原。然后收集这些淋巴细胞，并且执行下面描述的融合步骤。对于单克隆抗体，下一个步骤是将脾细胞从经免疫的非人类哺乳动物进行分离，并且随后将那些脾细胞与永生化细胞进行融合以便形成产生抗体的杂交瘤。从一种非人类哺乳动物体内分离脾细胞在本领域内史熟知的，并且典型地涉及从一种已麻醉的非人类哺乳动物体内取出脾，将它切成小块，并将脾膜中的脾细胞挤压通过细胞过滤网的尼龙网而进入一种适当的缓冲液中，从而产生一种单细胞悬浮液。将这些细胞洗涤、离心并且再悬浮于裂解任何红细胞的缓冲液中。将该溶液再次离心，将沉淀中剩余的淋巴细胞最终重悬于新鲜缓冲液中。一旦分离并且存在于单细胞悬液中，这些淋巴细胞即可以融合至永生化细胞系。这典型地为一种小鼠骨髓瘤细胞系，尽管许多其他可用于产生杂交瘤的永生化细胞系在本领域中是已知的。鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，该MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤可获自美国圣地亚哥的细胞分布中心索尔克研究所(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,U.S.A.)，X63Ag8653和SP-2细胞，该X63Ag8653和SP-2细胞可获自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MarylandU.S.A.)。融合是使用聚乙二醇或类似物产生的。然后，将所得的杂交瘤在选择性培养基中生长，这些选择性培养基包含抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或生存的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。杂交瘤典型地在巨噬细胞的饲养层上生长。这些巨噬细胞优选地是来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝动物，并且典型地在将杂交瘤涂板之前用不完全弗氏佐剂或类似物预处理数天。在Goding，“单克隆抗体：原理与实践(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)”，第59-103页(学术出版社(AcademicPress)，1986)中描述了融合方法，其披露内容通过引用结合在此。允许细胞在选择性培养基中生长足够的时间以形成菌落和产生抗体。这通常是在大约7天和大约14天之间。然后测定杂交瘤菌落以产生特异性结合CD73多肽基因产物的抗体。该测定典型地是比色ELISA型测定，但是可采用适合于杂交瘤生长的孔的任何测定。其他测定包括放射免疫测定或荧光激活细胞分选术。对所希望的抗体产生呈阳性的孔进行检查以确定是否存在一种或多种不同的克隆。如果存在多于一个菌落，可以将这些细胞再克隆并且使其生长以确保仅有单个细胞已经产生生成所希望的抗体的克隆。典型地，还将测试抗体结合至CD73多肽(例如表达CD73的细胞)的能力。确认会产生单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基(例如DMEM或RPMI-1640)中生长到更大的量。可替代地，杂交瘤细胞可以在一种动物中在体内作为腹水瘤生长。经过充分生长以产生所希望的单克隆抗体之后，将包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)分离远离这些细胞，并且对存在于其中的单克隆抗体进行纯化。典型地，纯化是通过凝胶电泳法、透析、使用蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖凝胶的色谱法，或连接到固体载体上的抗小鼠Ig(例如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠粒(全部描述于(例如)抗体纯化手册(AntibodyPurificationHandbook)，生物科学出版社(Biosciences)，公开号18-1037-46，AC版中，其披露内容通过引用结合在此)来实现的。典型地，所结合的抗体通过使用低pH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白质A/蛋白质G柱上洗脱，立即中和含抗体的馏分。根据需要将这些馏分合并、透析并且浓缩。对具有单个明显集落的阳性孔典型地重新克隆并重新测定，以确保正在检测并在产生仅一个单克隆抗体。还可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体，如披露于(例如)沃德(Ward)等人，自然(Nature)，341(1989)第544页中，其全部披露内容通过引用在此结合)。对结合至CD73(特别是与单克隆抗体11E1、8C7或6E1基本上或本质上相同的表位)的一种或多种抗体的鉴定，可以使用可以评价抗体竞争的多种免疫筛选测定中的任一种而容易地确定。许多这样的测定是常规实践的并且是本领域熟知的(参见，例如美国专利号5,660,827，发布于1997年8月26日，将其特定地通过引用结合在此)。应该理解，实际上，鉴定在此描述的抗体结合至其上的表位并不是以鉴定与跟在此描述的单克隆抗体的相同或基本上相同的表位相结合的抗体所要求的任何方式。例如，在该待检查的测试抗体获自不同来源的动物，或甚至具有不同的Ig同种型的情况下，可以采用简单的竞争测定，该测定中将对照(例如11E1、8C7或6E1)和测试抗体进行混合(或预吸收)并且应用到包含CD73多肽的样品。基于蛋白质印迹法的实验方案和使用BIACORE分析适合用于这类竞争研究。在某些实施例中，在应用到CD73抗原样品之前，技术人员将对照抗体(例如11E1、8C7、3C12或6E1)与不同量的测试抗体预混合(例如，约1:10或约1:100)持续一段时间。在其他实施例中，在暴露于CD73抗原样品期间可以将对照与不同量的测试抗体简单地混合。只要技术人员可以将结合的抗体与游离抗体区分(例如通过使用分离或洗涤技术以清除未结合的抗体)，并且将11E1、8C7、3C12或6E1与测试抗体区分(例如通过使用物种特异性或同种型特异性第二抗体或通过用可检测标签特异性地标记11E1、8C7、3C12或6E1)，技术人员即可以确定测试抗体是否降低了11E1、8C7、3C12或6E1与抗原的结合，表明测试抗体识别与11E1、8C7、3C12或6E1基本上相同的表位。在完全不相关的抗体不存在时，(标记的)对照抗体的结合可以用作对照高值。对照低值可以通过将标记的(11E1、8C7、3C12或6E1)抗体与未标记的完全相同类型的抗体(11E1、8C7、3C12或6E1)一起孵育来获得，其中竞争将出现并降低标记抗体的结合。在测试测定中，在测试抗体存在下，标记抗体反应性的显著降低暗示识别基本上相同表位的测试抗体，即，与标记的(11E1、8C7、3C12或6E1)抗体“交叉反应”或竞争的那种抗体。在11E1、8C7、3C12或6E1:测试抗体在约1:10和约1:100之间的任何比率下，使11E1、8C7、3C12或6E1与CD73抗原的结合降低了至少约50％、例如至少约60％、或更优选至少约80％或90％(例如，约65％-100％)的任何测试抗体被认为是结合至与11E1、8C7、3C12或6E1基本上相同的表位或决定簇上的抗体。优选地，这样的测试抗体将把11E1、8C7、3C12或6E1与CD73抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。竞争还可以通过例如流式细胞术测试来评价。在此类测试中，带有给定CD73多肽的细胞可以例如首先与11E1、8C7、3C12或6E1一起孵育，并且然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起孵育。如果当与饱和量的11E1、8C7、3C12或6E1预孵育时得到的结合是不用11E1、8C7、3C12或6E1预孵育的抗体所得到的结合(如用荧光测量的)的约80％、优选地约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，就说该抗体与11E1、8C7、3C12或6E1竞争。可替代地，如果在与饱和量的测试抗体一起预孵育的细胞上用标记的11E1、8C7、3C12或6E1抗体(通过荧光染料或生物素)获得的结合是在没有与测试抗体一起预孵育时获得的结合的约80％、优选地约50％、约40％、或更少(例如约30％、20％或10％)，就说该抗体与11E1、8C7、3C12或6E1竞争。还可以采用简单的竞争测定，其中测试抗体被预吸收并且在饱和浓度下应用到固定有CD73抗原的表面上。在这种简单的竞争测定中，该表面优选地是一种BIACORE芯片(或适合用于表面等离子共振分析的其他介质)。然后使对照抗体(例如，11E1、8C7、3C12或6E1)与在CD73-饱和浓度下的表面接触，并且对CD73和该对照抗体的表面结合进行测量。将对照抗体的结合与在测试抗体不存在下对照抗体与包含CD73的表面的结合进行比较。在测试测定中，在测试抗体的存在下包含的CD73表面被对照抗体结合的显著降低表明该测试抗体识别与对照抗体基本上相同的表位，这样使得该测试抗体与对照抗体进行“交叉反应”。使对照(例如11E1、8C7、3C12或6E1)抗体与CD73抗原的结合降低至少约30％或更多、优选地约40％的任何测试抗体可以被认为是结合至与对照(例如11E1、8C7、3C12或6E1)基本上相同的表位或决定簇的抗体。优选地，这样的测试抗体可以将对照抗体(例如11E1、8C7、3C12或6E1)与CD73抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、或更多)。应该理解，在竞争测定中，对照和测试抗体的次序可以颠倒，即可以先使对照抗体结合于该表面，随后使测试抗体与该表面相接触。优选地，首先将对CD73抗原具有更高亲和力的抗体结合到该表面上，正如将预期的对第二抗体(假设这些抗体是交叉反应的)观察到的结合降低将具有更大幅度。此类测定的进一步实例提供于例如索纳尔(Saunal)(1995)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)183:33-41，将其披露内容通过引用结合在此。抗体将结合来自患有以CD73阳性细胞的表达为特征的疾病的一个或多个个体的表达CD73的细胞，该个体即是用采用抗CD73抗体的本文所述方法之一治疗的候选个体。因此，一旦获得特异性识别细胞上的CD73的抗体，就可以任选地测试其结合CD73阳性细胞(例如癌症细胞)的能力。特别地，在用本发明抗体之一治疗患者之前，技术人员可以任选地测试抗体结合取自患者的恶性细胞的能力，例如在血液样品或肿瘤活组织检查中，以使治疗在患者中有益的可能性最大化。在一个实施例中，在免疫测定中验证抗体以测试其结合表达CD73的细胞(例如恶性细胞)的能力。例如，进行血液样品或肿瘤活组织检查，并且收集肿瘤细胞。然后，使用本领域技术人员熟知的标准方法来评估给定抗体结合这些细胞的能力。抗体可以结合例如很大比例(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的已知表达CD73的细胞(例如肿瘤细胞)，这些细胞来自显著百分比的个体或患者(例如10％、20％、30％、40％、50％或更多)。抗体可用于诊断目的以确定患者中恶性细胞的存在或水平，例如作为评估患者是否适合于用抗CD73剂治疗或适合用于本文所述的治疗方法的生物标志物。为了评估这些抗体与细胞的结合，可将这些抗体直接或间接进行标记。当间接标记时，典型地添加经标记的抗体。确定抗体是否结合在表位区之内可以用本领域的普通技术人员已知的方式进行。作为此类作图/表征方法的一个实例，可以使用化学修饰在CD73蛋白中暴露的胺/羧基，通过表位“足迹法”确定抗CD73抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及反向交换，其中保护参与蛋白结合的主链酰胺基团免受反向交换并且因此将保持被氘化。可以在这一点上通过胃蛋白酶水解作用、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱法来鉴别相关区域。参见，例如埃林(Ehring)H，分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)，第267卷(2)，第252-259页(1999)；恩金(Engen,J.R.)和史密斯(Smith,D.L.)，(2001)分析化学(Anal.Chem.)73，256A-265A。适当的表位鉴别技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地将游离抗原和与结合抗原肽复合的抗原的二维NMR谱图中信号的位置进行比较。典型地用15N对该抗原进行选择性核素标记，这样使得在NMR谱图中可以看到仅相应于抗原的信号以及没有来自该抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比较，在复合体谱图中从涉及与抗原结合肽相互作用的氨基酸起源的抗原信号典型地将移动位置，并且以这种方式可以鉴定涉及该结合的氨基酸。参见，例如，恩斯特先灵研究基金会研讨会(ErnstScheringResFoundWorkshop)，2004，(44):149-67；黄(Huang)等人，分子生物学杂志(JournalofMolecularBiology)，第281卷(1)第61-67页(1998)；以及萨伊托(Saito)和帕特森(Patterson)，方法(Methods)，1996年6月；9(3):516-24。表位作图/表征还可以使用质谱法进行。参见，例如，道恩瓦尔德(Downward),质谱杂志(JMassSpectrom)，2000年4月；35(4):493-503以及卡泽勒(Kiselar)和道纳尔德(Downard)，分析化学(AnalChem)，1999年5月1日；71(9):1792-1801。在表位作图以及鉴定的情况下，蛋白酶消化技术也可能是有用的。可以通过蛋白酶消化(例如通过以相对于CD73约1:50的比率使用胰蛋白酶或在pH7-8下进行o/n消化)来确定抗原决定簇相关的区域/序列，随后针对蛋白质鉴定来进行质谱(MS)分析。被抗CD73粘合剂保护而免受胰蛋白酶切割的肽可以随后通过将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体孵育过的、并且之后经历通过例如胰蛋白酶消化的样品进行比较(由此展现粘合剂的足迹)来鉴定。在类似的表位表征方法中还可以或可替代地可以使用其他酶像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。而且，酶消化可以提供一种快速方法来分析潜在的抗原决定簇序列是否在CD73多肽的区域内，该区域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能是不相关的。定点诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白质片段中每个残基都用丙氨酸残基替换，并且测量对结合亲和力的影响。如果该突变导致结合亲和力的显著降低，则它最可能参与结合。可以使用对结构性表位特异的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来证实该丙氨酸替换不影响蛋白的整体折叠。参见，例如，克拉克森(Clackson)和威尔斯(Wells)，科学(Science)1995；267:383-386；以及威尔斯(Wells)，美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)1996；93:1-6。电子显微镜也可以用于表位“足迹法”。例如王(Wang)等人，自然(Nature)1992；355:275-278使用了冷冻电子显微镜术、三维图像重建和X射线晶体法的协同应用来确定天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。其他形式的用于表位评估的“无标签”测定包括表面等离子体共振(SPR、BIACORE)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，法格斯坦等人，分子识别杂志(JournalOfMolecularRecognition)1990；3:208-14；尼斯(Nice)等人，色谱法杂志(J.Chromatogr.)1993；646:159-168；莱佩特(Leipert)等人，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)1998；37:3308-3311；克罗格(Kroger)等人，生物传感器和生物电子学(BiosensorsandBioelectronics)2002；17:937-944。还应当指出，结合与一种抗体相同或基本上相同的表位的抗体可以在此处描述的示例性竞争测定的一个或多个中鉴定。在脊椎动物或细胞中在免疫和产生抗体时，可以进行特定选择步骤以分离所要求的抗体。在此方面，在一个具体实施例中，本披露还涉及产生此类抗体的方法，包括：(a)用包含CD73多肽的免疫原来免疫非人类哺乳动物；以及(b)从所述免疫的动物体内制备抗体；以及(c)从步骤(b)中选择能够结合CD73的抗体。典型地，本文提供的抗CD73抗体对约104至约1011M-1(例如约108至约1010M-1)范围内的CD73多肽(例如作为CD73同源二聚体)具有亲和力。例如，在一个具体方面，本披露提供了关于CD73具有小于1x10-9M的平均解离常数(KD)的抗CD73抗体，如通过例如表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置来分析)确定的。在一个更具体的示例性方面，本披露提供对于CD73具有约1x10-8M至约1x10-10M、或约1x10-9M至约1x10-11M的KD的抗CD73抗体。可以例如通过不大于约(例如亲和力优于)100、60、10、5或1纳摩尔，优选地亚纳摩尔或任选地不大于约500、200、100或10皮摩尔的平均KD对抗体进行表征。可以例如通过将重组产生的人CD73蛋白固定在芯片表面上，接着使用溶液中待测试的抗体来确定KD。在一个实施例中，该方法进一步包括步骤(d)，从(b)中选择能够与抗体11E1、8C7、3C12或6E1竞争结合CD73的抗体。在任何实施例的一个方面，根据本发明方法制备的抗体是单克隆抗体。在另一个方面，根据本文方法用于产生抗体的非人类动物是哺乳动物，例如啮齿动物、牛、猪、家禽、马、兔、山羊、或绵羊。编码与存在于CD73多肽上的表位结合的抗体的DNA是分离自杂交瘤，并且将其置于适当的表达载体中以转染到适当的宿主中。然后将该宿主用于重组产生抗体或其变体，例如单克隆抗体的人源化版本、抗体的活性片段、嵌合抗体(包括抗体的抗原识别部分)、或包括可检出部分的版本。使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码鼠类抗体的重链和轻链的基因上的寡核苷酸探针)，可以很容易对编码本披露的单克隆抗体(例如抗体11E1、8C7、3C12或6E1)的DNA进行分离和测序。在一个方面，提供了编码本文任何实施例的抗CD73抗体的重链或轻链的核酸。一旦被分离，DNA被置于表达载体中，然后将这些载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。如在本说明书中其他地方所描述的，出于很多目的中任何一项(例如，为了使抗体人源化、产生片段或衍生物、或为了修饰抗体的序列)，例如在抗原结合位点中，可以对此类DNA序列进行修饰以便优化抗体的结合特异性。在一个实施例中，提供了编码抗体(例如11E1、8C7、3C12或6E1)的轻链和/或重链的分离的核酸序列，以及包含这样的核酸的重组宿主细胞(例如在其基因组中)。在细菌中重组表达编码抗体的DNA在本领域中是熟知的(参见，例如，赛可瑞(Skerra)等人,免疫学新见(Curr.OpinioninImmunol.)，5,pp.256(1993)；以及普拉克桑(Pluckthun)，免疫学(Immunol.)130,p.151(1992))。任选地，可以将本披露的抗体指定为除了抗体7G2(生命技术公司(LifeTechnologiesCorp.))；抗体4G4(艾碧康公司(Abcam)，产品编号ab81720)；抗体AD2(生物传奇公司(BiolegendCorp)，产品编号344004)；抗体1E9(圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruzBiotechnologyCorp.)，产品sc-32299)；在US2014/0235833中描述的067-213抗体；在萨彻弥尔(Sachsenmeier)等人(2012)生物医学筛选杂志(J.Biomed.Screening)17:993-998和/或在拉斯特(Rust)等人(2013)分子癌症(Mol.Cancer)12:11中引用的抗CD73抗体；或在黄(Huang)等人(2015)AACR年度会议，摘要1538中引用的抗体MEDI9447(马里兰州盖瑟斯堡米迪缪尼有限公司(MedimmuneCorp,GaithersburgMD))；或前述的衍生物中任何一种或多种之外，例如包含整个或部分抗原结合区或重链和/或轻链CDR的抗体。在其他实施例中，取决于抗体的性质，上述抗体可以被修饰以致于具有本披露的抗体的特征。一旦抗体被鉴定为能够结合CD73和/或具有其他希望的特性，典型地也将使用标准的方法(包括在此描述的那些)来评价它们结合至其他多肽(包括不相关多肽)的能力。理想地，抗体仅以很大的亲和力结合CD73，并且不以显著的水平结合到不相关的多肽或5'-核苷酸酶家族的其他多肽。然而，应当领会的是，只要对CD73的亲和力比对于其他不相关多肽的亲和力基本上更大(例如10x、100x、500x、1000x、10,000x、或更大)，则这些抗体适合用于本发明的方法中。在一个实施例中，可以制备抗CD73抗体，这样使得它们不具有与人Fcγ受体(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的任一个或多个)的实质的特异性结合。这样的抗体可以包含已知不结合Fcγ受体的各种重链的恒定区。一个这样的实例是野生型人IgG4恒定区(IgG4具有最小的Fcγ受体结合)。人IgG4恒定区可以进一步包含稳定的S228P(S241P)取代)以通过防止Fab臂交换而保留体内的二价结合能力。可替代地，不包含恒定区例如F(ab')2片段(或包含恒定区的部分)的抗体片段可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，通常可以使用任何抗体IgG同种型，其中Fc部分被修饰(例如通过引入1、2、3、4、5个或更多个氨基酸取代)以最小化或消除与Fc受体的结合(参见，例如，WO03/101485，其披露内容通过引用在此结合)。用于评估Fc受体结合的测定例如基于细胞的测定是本领域熟知的，并且描述于例如WO03/101485中。在一个实施例中，抗体可以在Fc区中包含一个或多个特异性突变，该特异性突变导致与效应细胞具有最小相互作用的“Fc沉默”抗体。沉默的效应子功能可以通过抗体的Fc区域中的突变而获得，并且已在本领域描述为：N297A突变、LALA突变(斯佐霍(Strohl，W.)，2009，生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)，第20卷(6):685-691)；和D265A(Baudino等人，2008，免疫学杂志(J.Immunol.)181:6664-69)，也参见Heusser等人，WO2012/065950，其披露内容通过引用结合在此。在一个实施例中，抗体在铰链区中包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在一个实施例中，抗体是IgG1或IgG2并且包含在残基233-236、任选地233-238(EU编号)处的一个、两个或三个取代。在一个实施例中，抗体是IgG4并且包含在残基327、330和/或331(EU编号)处的一个、两个或三个取代。沉默FcIgG1抗体的实例是在IgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体。Fc沉默突变的另一个实例是在残基D265处、或在D265和P329处的突变，例如在IgG1抗体中用作DAPA(D265A、P329A)突变(US6,737,056)。另一种沉默的IgG1抗体包含在残基N297处的突变(例如N297A、N297S突变)，其产生无糖基化/非糖基化的抗体。其他沉默突变包括：在残基L234和G237处的取代(L234A/G237A)；在残基S228、L235和R409处的取代(S228P/L235E/R409K,T,M,L)；在残基H268、V309、A330和A331处的取代(H268Q/V309L/A330S/A331S)；残基C220、C226、C229和P238处的取代(C220S/C226S/C229S/P238S)；在残基C226、C229、E233、L234和L235处的取代(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)；在残基K322、L235和L235处的取代(K322A/L234A/L235A)；在残基L234、L235和P331处的取代(L234F/L235E/P331S)；在残基234、235和297处的取代；在残基E318、K320和K322处的取代(L235E/E318A/K320A/K322A)；在残基V234、G237、P238处的取代(V234A、G237A、P238S)；在残基243和264处的取代；在残基297和299处的取代；在残基233、234、235、237和238处的取代，这些残基由EU编号系统定义，包含选自PAAAP、PAAAS和SAAAS的序列(参见WO2011/066501)。Fc沉默抗体导致没有或低的ADCC活性，意味着Fc沉默抗体展现出低于50％特异性细胞裂解的ADCC活性。优选地，抗体基本上缺乏ADCC活性，例如，Fc沉默抗体展现出低于5％或低于1％的ADCC活性(特异性细胞裂解)。Fc沉默抗体也可导致在CD73表达的表面缺乏FcγR介导的CD73的交联。在一个实施例中，抗体在选自下组的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基处的重链恒定区中具有取代，该组由以下各项组成：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331和409(在重链恒定区中的残基编号是根据卡巴特的EU编号)。在一个实施例中，抗体包含在残基234、235和322处的取代。在一个实施例中，抗体具有在残基234、235和331处的取代。在一个实施例中，Fc沉默抗体包含一个Fc结构域，该Fc结构域包含在残基234、235和331处的氨基酸取代，例如具有取代L234F、L235E和P331S的“TM”突变。在一个实施例中，抗体包括在美国专利公开号US2015/0125444中描述的在残基234、235和322处或在残基234、235和331处含有氨基酸取代的Fc结构域，其中残基234是F(苯丙氨酸)；残基235是丙氨酸(A)、冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺(Q)或缬氨酸(V)；残基322是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)或谷氨酰胺；并且残基331是丙氨酸(A)或甘氨酸(G)。氨基酸残基根据卡巴特的EU编号来指定。在一个实施例中，抗体包括含有氨基酸取代的Fc结构域，该氨基酸取代增加与人FcRn多肽的结合以便增加抗体的体内半衰期。示例性突变描述于斯佐霍(Strohl，W.)，2009，生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)第20卷(6):685-691，其披露内容通过引用结合在此。在人IgG1同种型的抗体中使用的取代的实例是在残基M252、S254和T256处的取代；在残基T250和M428处的取代；在残基N434处的取代；在残基H433和N434处的取代；在残基T307、E380和N434处的取代；在残基T307、E380和N434处的取代；在残基M252、S254、T256、H433、N434和436处的取代；在残基I253处的取代；在残基P257、N434、D376和N434处的取代。在一个实施例中，抗体包括含有氨基酸取代的Fc结构域，该氨基酸取代赋予蛋白酶切割降低的敏感性。基质金属蛋白酶(MMP)代表与肿瘤发生相关的最突出的蛋白酶家族。虽然癌细胞可以表达MMP，但是细胞外MMP的大多数由浸润肿瘤的不同类型的基质细胞提供，并且各自产生一组特定的蛋白酶和蛋白酶抑制剂，这些蛋白酶和蛋白酶抑制剂被释放到细胞外空间并且特异性地改变肿瘤周围的环境。存在于肿瘤微环境中的MMP可以切割铰链区内的抗体，并且因此可导致设计为在肿瘤部位内起作用的治疗性抗体的失活。在一个实施例中，包含氨基酸取代的Fc结构域对由任何一种、两种、三种或更多种(或全部)蛋白酶进行的切割具有降低的敏感性，该蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：GluV8、IdeS、白明胶酶A(MMP2)、白明胶酶B(MMP-9)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、基质溶素(MMP-3)和巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)。在一个实施例中，对切割的降低敏感性的抗体包括在残基E233-L234和/或L235处含有氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施例中，抗体包括在残基E233、L234、L235和G236处含有氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施例中，抗体包括在233-238的一个或多个残基处含有氨基酸取代的Fc结构域，例如这样使得E233-L234-L235-G236序列被P233-V234-A235取代(G236被缺失)。参见例如WO99/58572和WO2012087746，其披露内容通过引用结合在此。可以在任何希望的阶段评估结合抗原的化合物抑制CD73的酶活性的能力，尤其是阻断CD73的5'-核苷酸酶活性和减少表达CD73的细胞产生腺苷，并且反过来恢复淋巴细胞的腺苷介导的抑制的活性和/或减轻淋巴细胞的腺苷介导的抑制的能力。可以使用重组可溶性人CD73(作为二聚体)和AMP在无细胞测定中测试抗体抑制CD73的酶活性的能力，其中直接(例如通过测量底物和产物，即AMP、腺苷和/或磷酸盐)或间接地检测AMP向腺苷的转化(和/或其抑制)。在一个实例中，在将测试化合物与重组CD73孵育前后，经由HPLC检测AMP和/或腺苷。重组CD73可获自例如研发系统(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州(Minneapolis，MN))。抗体的抑制活性(即细胞毒性增强潜力)也能以许多其他方式中的任一种来评估。例如，在间接测定中，使用基于荧光素的试剂(例如可从普洛麦格公司(Promega)获得的系统)，以检测AMP的消失。在测定中的荧光素酶反应被AMP抑制。向反应中添加CD73酶降解AMP，并且减轻抑制，产生可检测的信号(参见本文实例2)。使用可溶性CD73的测定将包括在其中以相对于CD73多肽二聚体大量的摩尔过量(例如10倍、20倍、50倍、100倍等)提供抗体的条件下进行测试。当以摩尔过量提供给酶时，抗-CD73抗体将不再能够形成抗体和CD73二聚体的多聚复合体；然后可以选择保留对CD73的酶活性的抑制的抗体。或者或另外，还可以在细胞测定(使用表达CD73的细胞)中测试抗体抑制CD73的5'-胞外核苷酸酶的酶活性的能力。有利地，可以首先在无细胞测定中测试或筛选抗体，以鉴定阻断酶活性的抗体，以降低通过引起CD73内化而选择抑制CD73的抗体的可能性，然后在细胞测定中作为纯化抗体进行测试。细胞测定可以如本文实例中所示进行。例如，在抗CD73抗体存在下将表达CD73的细胞系(例如MDA-MB-231细胞系)涂板在平底96孔板中并孵育。将AMP添加到细胞中并且在4℃下孵育(以避免CD73下调)。然后离心板，并且将上清液转移至平底96孔培养板。然后对由AMP水解成腺苷而产生的游离磷酸进行定量。在抗体存在下AMP水解成腺苷的降低表明抗体抑制细胞的CD73。在一个实施例中，抗体制剂导致CD73多肽的酶活性降低至少50％，优选地CD73多肽(例如可溶性同源二聚体CD73多肽；由细胞表达的CD73)的酶活性降低至少60％、70％或80％。抗体的活性也可以在间接测定中测量其调节淋巴细胞活性的能力，例如减轻腺苷介导的淋巴细胞活性抑制或引起淋巴细胞活性的活化的能力。这可以例如使用细胞因子释放测定来解决。在另一个实例中，可以在间接测定中评估抗体调节淋巴细胞增殖的能力。可以测试抗体内化或诱导CD73下调的能力，例如，无论是通过内化或诱导CD73从细胞表面脱落。抗CD73抗体是否在哺乳动物细胞上结合CD73时内化，或者CD73多肽是否经历细胞内内化(例如在被抗体结合时)可以通过各种测定，包括本文实验实例中描述的那些(例如，实例7)来确定。在其他实例中，为了测试体内内化，将测试抗体进行标记并引入已知具有在某些细胞表面上表达的CD73的动物中。抗体可以用例如荧光或金颗粒进行放射性标记或标记。适合于这种测定的动物包括哺乳动物，例如含有表达人CD73的肿瘤移植物或异种移植物的裸鼠，或已经引入了用人CD73转染的细胞的小鼠或表达人CD73转基因的转基因小鼠。适当的对照包括未接受测试抗体或接受了不相关抗体的动物，以及在感兴趣的细胞上接受了另一种抗原的抗体的动物，已知该抗体在与抗原结合后被内化。可以将抗体给予动物，例如通过静脉内注射。在合适的时间间隔，可以使用已知方法或如下面实验实例中所述的制备动物的组织切片，并通过光学显微镜或电子显微镜分析内化以及细胞中被内化的抗体的位置。对于体外内化，在存在或不存在添加到培养基中的相关抗体的情况下，可以将细胞在组织培养皿中孵育，并且在希望的时间点处理以进行显微分析。如果使用放射性标记的抗体，通过显微镜检查或通过自动射线照相术可以直接观察细胞中内化的、标记的抗体的存在。任选地，在显微镜检查中，可以评估已知多肽或其他细胞组分的共定位；例如内体/溶酶体标记物LAMP-1(CD107a)的共定位可以提供关于内化抗体的亚细胞定位的信息。可替代地，在定量生物化学测定中，将包含表达CD73的细胞的细胞群体与放射性标记的测试抗体在体外或体内接触，并且细胞(如果在体内接触，则在适当量的时间后分离细胞)用蛋白酶处理或经历酸洗涤以除去细胞表面上的未内化的抗体。将细胞磨碎并通过使匀浆穿过闪烁计数器来测量与每批细胞相关的耐蛋白酶的、每分钟放射计数(cpm)的量。基于放射性标记抗体的已知比活性，每个细胞内化的抗体分子的数目可以从磨碎的细胞的闪烁计数推导出。细胞在体外优选以溶液形式与抗体“接触”，例如通过将细胞添加到培养皿或烧瓶中的细胞培养基中并且将抗体与培养基充分混合以确保细胞均匀暴露于抗体。抗体表位在一个方面，抗体结合存在于可溶性CD73和在细胞表面表达的CD73两者上的共同抗原决定簇。在一个方面，抗体结合与抗体11E1、8C7、3C12或6E1基本上相同的表位。在一个实施例中，抗体结合CD73的表位，该表位与抗体11E1、8C7、3C12或6E1结合的表位至少部分重叠或包括其中至少一个残基。由抗体结合的残基可以被指定为存在于CD73多肽的表面上，例如，在细胞表面上表达的CD73多肽。由抗体结合的在CD73上的氨基酸残基可以例如选自下组，该组由以下各项组成：在表1中列出的残基。可以测量抗CD73抗体与用CD73突变体转染的细胞的结合，并将其与抗CD73抗体结合野生型CD73多肽(例如，SEQIDNO:1或2)的能力进行比较。抗CD73抗体和突变体CD73多肽(例如表1的突变体CD73)之间的结合的降低意味着在结合亲和力上有所降低(例如，如通过已知的方法测量的，如对表达特定突变体的细胞进行FACS测试，或通过Biacore测试与突变体多肽的结合)，和/或在抗CD73抗体的总结合能力的降低(例如，如通过在抗CD73抗体浓度对多肽浓度的曲线图中Bmax的降低证实的)。在结合上的显著降低表明当抗CD73抗体结合至CD73时突变的残基直接参与结合抗CD73抗体，或紧密靠近该结合蛋白。在一些实施例中，结合的显著降低意味着在抗CD73抗体与突变体CD73多肽之间的结合亲和力和/或能力相对于在该抗体与野生型CD73多肽之间的结合降低了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合被降至低于检测限度。在一些实施例中，当抗CD73抗体与突变体CD73多肽的结合小于观察到的在抗CD73抗体和野生型CD73多肽之间的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，结合的显著降低得到证实。在一些实施例中，提供了抗CD73抗体，其展示出对突变体CD73多肽的显著更低的结合，其中包含由抗体11E1、8C7、3C12或6E1结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代。在一个实施例中，与结合野生型CD73多肽(例如SEQIDNO:1的多肽)相比，突变体是选自表1的突变体1-15(例如突变体3)的突变体或包含这样的突变体3的一个或多个氨基酸取代的突变体。任选地，失去与突变体1-15的一种或多种突变体结合的抗体对于表1的一种或多种其他突变体CD73多肽(例如一种或多种(或全部)突变体2、5、6或7)不表现出显著更低的结合。在一个方面，抗CD73抗体与具有突变的CD73多肽具有降低的结合，该突变是在选自下组的残基处，该组由以下各项组成：A99、E129、K133、E134、和A135(相对于SEQIDNO:1)；任选地，该突变的CD73多肽具有突变：A99S、E129A、K133A、E134N、和A135S。任选地，在一个方面，抗CD73抗体与具有突变的CD73多肽不具有降低的结合，该突变是在选自下组的残基处，该组由以下各项组成：Q70、R73、A74、A107和R109(相对于SEQIDNO:1)；任选地，该突变的CD73多肽具有突变：A99S、Q70S、R73A、A74E、A107I和R109G。在一个方面，抗CD73抗体结合CD73上的表位，该CD73包含一个、两个、三个、四个或五个残基，该残基选自下组，该组由以下各项组成：A99、E129、K133、E134、和A135(相对于SEQIDNO:1)。任选地，在一个方面，抗CD73抗体不结合CD73上的表位，该CD73包含一个、两个、三个、四个或五个残基，该残基选自下组，该组由以下各项组成：Q70、R73、A74、A107和R109(相对于SEQIDNO:1)。抗体CDR序列抗体11E1将抗体11E1的重链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:3，轻链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:4。在一个具体实施例中，本披露提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体11E1本质上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体11E1的超变区。在本文任何实施例中，抗体11E1可以通过其氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个的实施例中，该单克隆抗体包括11E1的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括11E1的重链可变区。根据一个实施例，单克隆抗体包含11E1的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含11E1的可变轻链可变区或者11E1的轻链可变区的一个、两个或三个CDR的单克隆抗体。任选地，任何所述轻链或重链CDR中的一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体11E1的抗原结合区的部分或全部的任何轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，任选地进一步包含降低效应子功能(与人Fcγ受体结合)的氨基酸取代)融合。在另一个方面，本披露提供了一种抗体，其中该抗体包含：11E1的HCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；11E1的HCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；11E1的HCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；11E1的LCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；11E1的LCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；11E1的LCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代；HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以任选地被指定为所有(或每个，独立地)是卡巴特编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，乔西亚(Chotia)编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，IMGT编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，或任何其他合适的编号系统。抗体6E1将抗体6E1的重链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:21，轻链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:22。在一个具体实施例中，本披露提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体6E1本质上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体6E1的超变区。在本文任何实施例中，抗体6E1可以通过其氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个的实施例中，该单克隆抗体包括6E1的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括6E1的重链可变区。根据一个实施例，单克隆抗体包含6E1的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含6E1的可变轻链可变区或者6E1的轻链可变区的一个、两个或三个CDR的单克隆抗体。任选地，任何所述轻链或重链CDR中的一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体6E1的抗原结合区的部分或全部的任何轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，任选地进一步包含降低效应子功能(与人Fcγ受体结合)的氨基酸取代)融合。在另一个方面，本披露提供了一种抗体，其中该抗体包含：6E1的HCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；6E1的HCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；6E1的HCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；6E1的LCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；6E1的LCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；6E1的LCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代；HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以任选地被指定为所有(或每个，独立地)是卡巴特编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，乔西亚编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，IMGT编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，或任何其他合适的编号系统。抗体3C12将抗体3C12的重链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:36，轻链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:37。在一个具体实施例中，本披露提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体3C12本质上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体3C12的超变区。在本文任何实施例中，抗体3C12可以通过其氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个的实施例中，该单克隆抗体包括3C12的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括3C12的重链可变区。根据一个实施例，该单克隆抗体包括3C12的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包括3C12的可变轻链可变区或3C12的轻链可变区的一个、两个或三个CDR的单克隆抗体。任选地，任何所述轻链或重链CDR中的一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体3C12的抗原结合区的部分或全部的任何轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，任选地进一步包含降低效应子功能(与人Fcγ受体结合)的氨基酸取代)融合。在另一个方面，本披露提供了一种抗体，其中该抗体包含：3C12的HCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；3C12的HCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；3C12的HCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；3C12的LCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；3C12的LCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；3C12的LCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代；HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以任选地被指定为所有(或每个，独立地)是卡巴特编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，乔西亚编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，IMGT编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，或任何其他合适的编号系统。抗体8C7将抗体8C7的重链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:28，轻链可变区的氨基酸序列列为SEQIDNO:29。在一个具体实施例中，本披露提供了一种抗体，该抗体结合与单克隆抗体8C7本质上相同的表位或决定簇；任选地该抗体包括抗体8C7的超变区。在本文任何实施例中，抗体8C7可以通过其氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个的实施例中，该单克隆抗体包括8C7的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括8C7的重链可变区。根据一个实施例，单克隆抗体包含8C7的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含8C7的可变轻链可变区或者8C7的轻链可变区的一个、两个或三个CDR的单克隆抗体。任选地，任何所述轻链或重链CDR中的一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体8C7的抗原结合区的部分或全部的任何轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，任选地进一步包含降低效应子功能(与人Fcγ受体结合)的氨基酸取代)融合。在另一个方面，本披露提供了一种抗体，其中该抗体包含：8C7的HCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；8C7的HCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；8C7的HCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；8C7的LCDR1区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；8C7的LCDR2区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸取代；8C7的LCDR3区，其包含在表A中所列出的氨基酸序列或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个可以缺失或被不同的氨基酸取代；HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以任选地被指定为所有(或每个，独立地)是卡巴特编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，乔西亚编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，IMGT编号系统的那些(对于每个CDR如表A中所示)，或任何其他合适的编号系统。在另一方面，本披露提供结合人CD73的抗体，其包含：(a)SEQIDNO:3、21、28或36的重链可变区的超变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代；以及(b)SEQIDNO:3、22、29或37的轻链可变区的超变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。在另一方面，本披露提供结合人CD73的抗体，其包含：(a)如在SEQIDNO:5-7或30-32中任一项所示的重链CDR1氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；(b)如在SEQIDNO:8-10、23、24或33中任一项所示的重链CDR2氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；(c)如在SEQIDNO:11-13、25或27中任一项所示的重链CDR3氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；(d)如在SEQIDNO:14、15、16、34或35中任一项所示的轻链CDR1氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；(e)如在SEQIDNO:17或18中任一项所示的轻链CDR2氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；和/或(f)如在SEQIDNO:19或20中任一项所示的轻链CDR3氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。在本文任何实施例的另一个方面，11E1、8C7、3C12或6E1的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3中的任一个可以通过其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或被表征为具有与列于相应SEQIDNO中的具体特定CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列一致性的氨基酸序列。在本文任何实施例的一个方面，任何抗体可以包括具有根据选自对应化学式(I)至(V)的对应化学式的的CDR1、CDR2和/或CDR3序列的重链和/或轻链。在本文任何实施例中，具体的HCDR1-3或LCDR-1-3可以被指定为具有对应化学式(I)至(VI)的序列。在一个优选的实施例中，抗体包括含有三个LCDR的轻链以及含有三个HCDR的重链。在一个实施例中，HCDR1包含具有化学式(I)的氨基酸序列：S-Y-N-M-Xaa1(SEQIDNO:38)，其中Xaa1可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa1是Y(Tyr)或N(Asn)。在一个实施例中，HCDR2包含具有化学式(IIa)的氨基酸序列：Y-I-D-P-Y-N-G-G-Xaa2-S-Y-N-Xaa3-Xaa4-F-K-G(SEQIDNO:39)，或其序列，例如，具有化学式(IIb)的氨基酸序列：Y-I-D-P-Y-N-G-G-Xaa2(SEQIDNO:40)其中Xaa2可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa2是S(Ser)或T(Thr)；其中Xaa3可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa3是Q(GIn)或L(Leu)；其中Xaa4可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa4是K(Lys)或T(Thr)。在一个实施例中，HCDR3包含具有化学式(III)的氨基酸序列：G-Y-Xaa5-N-Y-K-A-W-F-A-Y(SEQIDNO:41)，其中Xaa5可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa5是G(Gly)或N(Asn)。在一个实施例中，LCDR1包含具有化学式(IV)的氨基酸序列：K-A-S-Q-S-V-Xaa6-N-D-V-A(SEQIDNO:42)，其中Xaa6可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa6是T(Thr)或S(Ser)。在一个实施例中，LCDR2包含具有化学式(V)的氨基酸序列：Y-A-S-Xaa7-R-Y-T(SEQIDNO:43)，其中Xaa7可以是任何指定的氨基酸的保守或非保守取代或缺失或插入，任选地其中Xaa7是T(Thr)或N(Asn)。在一个实施例中，LCDR3包含SEQIDNO:19或20的氨基酸序列。在一个实施例中，抗体可以包括一个重链，该重链包含：a重链CDR1(HCDR1)，其包括SEQIDNO:38的氨基酸序列；和/或b重链CDR2(HCDR2)，其包括SEQIDNO:39(或40)的氨基酸序列；和/或c重链CDR3(HCDR3)，其包括SEQIDNO:41的氨基酸序列。在一个实施例中，抗体可以包括一个轻链，该轻链包含：a轻链CDR1(LCDR1)，其包括选自SEQIDNO:42的氨基酸序列；和/或b轻链CDR2(LCDR2)，其包括SEQIDNO:43的氨基酸序列；和/或c轻链CDR3(LCDR3)，其包括SEQIDNO:19或20的氨基酸序列。在任何抗体例如11E1、8C7、3C12或6E1中，指定的可变区和CDR序列可以包含序列修饰，例如取代(1、2、3、4、5、6、7、8或更多个序列修饰)。在一个实施例中，重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中取代的残基是存在于人起源的序列中的残基。在一个实施例中，取代是保守的修饰。保守的序列修饰是指未显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守的修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将多种修饰引入抗体中。保守氨基酸的取代典型地是以下取代，其中用具有类似理化特性的侧链的一个氨基酸残基来替换一个氨基酸残基。所指定的可变区以及CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。当进行取代时，优选的取代将是保守的修饰。在本领域中已经限定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且经改变的抗体可以使用本文描述的测定来测试所保留的功能(即，本文列出的特性)。根据IMGT、卡巴特和乔西亚(Chothia)定义系统的CDR的序列已经概括在下表A中。抗体可变区的序列列于下表B中(如果存在前导序列，则任何抗体链可以指定为在前导序列末端紧接的氨基酸位置开始)，并且每个CDR加下划线。在本文任何实施例中，VL或VH序列可以被指定或编号从而包含或缺少信号肽或其任何部分。表A表B抗体的片段和衍生物(它们被如在本申请中使用的术语“抗体”或“多种抗体”涵盖，除非另外陈述或与上下文明显矛盾)可以通过本领域中已知的技术来产生。“片段”包括完整抗体的一个部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，该抗体片段是具有由连续氨基酸残基的一个连续序列组成的一级结构的多肽(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子(2)仅包含一个轻链可变域的单链多肽、或其片段，该片段包含轻链可变域的三个CDR而没有相关联的重链部分的以及(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽、或其片段，该片段包含重链可变区的三个CDR，而没有相关联的轻链部分；以及由多个抗体片段形成的多特异性(例如双特异性)抗体。尤其包括纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。在某些实施例中，产生抗体的杂交瘤的DNA可以在插入表达载体之前进行修饰，例如通过将用于人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源性非人类序列(例如莫里森(Morrison)等人，PANS，pp.6851(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价地连接至免疫球蛋白编码序列。以该方式，可制备“嵌合”或“杂合”抗体，它们具有初始抗体的结合特异性的抗体。典型地，这种非免疫球蛋白多肽可被取代为抗体的恒定结构域。任选地抗体是人源化的。“人源化”形式的抗体是特异性嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合的抗体亚序列)，它们含有源自于鼠免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替代，同时保持所希望的原始抗体的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基可以由相应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个、并且典型地两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR区相应于初始抗体的情况，并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白一致序列的情况。人源化抗体还任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的至少一部分。进一步细节参见琼斯(Jones)等人，自然(Nature)，321，pp.522(1986)；莱兴曼(Reichmann)等人，自然(Nature)，332，pp.323(1988)；普雷斯塔(Presta)，结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)，2，pp.593(1992)；Verhoeyen等人，科学(Science)，239，pp.1534；以及美国专利号4,816,567，其全部披露内容通过引用在此结合)。用于人源化抗体的方法是本领域所熟知的。选择用于制备人源化抗体的人类轻链和重链可变结构域，这对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳适配”法，抗体的可变域的序列针对已知人类可变域序列的整个文库来筛选。然后，将最接近于小鼠序列的人类序列接受为人源化抗体的人类框架(FR)(西姆斯(Sims)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)151，pp.2296(1993)；乔西亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，分子杂志(J.Mol.)196，1987，pp.901)。另一种方法使用来自所有人抗体的轻链或重链的特定亚组的一致序列的特定框架。相同的框架可以用于多种不同的人源化抗体(卡特(Carter)等人，PNAS，89，pp.4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，151，p.2623(1993))。进一步重要的是将抗体人源化，同时保留对于CD73的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种概念性人源化产物的过程而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。可以得到说明并且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构的计算机程序。这些展示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能方面的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。按照此方式，可以从一致的并且输入的序列中选择并且组合FR残基，这样使得所希望的抗体特征，例如增加一种或多种靶抗原的亲和性得以实现。总体上，CDR残基直接地并且在多数情况下基本上涉及影响抗原结合。另一种制备“人源化”单克隆抗体的方法是使用XenoMouse(加利福尼亚州菲蒙市安根尼克斯公司(Abgenix,Fremont,CA))作为用于免疫的小鼠。XenoMouse是鼠宿主，该鼠宿主已经具有免疫球蛋白基因被功能性人免疫球蛋白基因替代。因此，由这种小鼠产生的抗体或从这种小鼠的B细胞制造的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。XenoMouse描述与美国专利号6,162,963中，其通过引用以其全文在此结合。人类抗体还可以根据不同的其他技术制备，例如通过使用其他已经被工程化以表达人类抗体组库的转基因动物进行免疫(雅各博维奇(Jakobovitz)等人，《自然》(Nature)362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法进行的抗体谱选择。此类技术是技术人员已知的并且可以从如在本申请中披露的单克隆抗体开始来实施。抗体配制品抗CD73抗体可以掺入包含浓度从1mg/ml至500mg/ml的药物配制品中，其中所述配制品具有从2.0至10.0的pH。该配制品可以进一步包含缓冲体系、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，药物配制品是水性配制品，即包含水的配制品。此类配制品典型地常是溶液或悬浮液。在进一步的实施例中，药物配制品是水性溶液。术语“水性配制品”定义为包含至少50％w/w水的配制品。同样，术语“水性溶液”定义为包含至少50％w/w水的溶液，术语“水性悬浮液”定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。在另一个实施例中，药物配制品是冷冻干燥的配制品，在使用前医生或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。在另一个实施例中，药物配制品是干燥的配制品(例如冷冻干燥或喷雾干燥的)，可立即使用而需无任何预先溶解。在进一步方面，药物配制品包含此类抗体的水性溶液和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述配制品具有从约2.0至约10.0的pH。在另一个实施例中，配制品的pH在选自从约2.0至约10.0、约3.0至约9.0、约4.0至约8.5、约5.0至约8.0和约5.5至约7.5组成的列表的范围内。在进一步实施例中，缓冲液选自下组，该组由以下各项组成：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二甘氨酸、两性离子缓冲剂(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲液中的每一个构成可替代的实施例。在进一步实施例中，该配制品进一步包括药学上可接受的防腐剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括等渗剂。在进一步实施例中，该配制品还包含螯合剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括稳定剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括表面活性剂。为了方便起见，参考雷明顿(Remington)：药学科学与实践(TheScienceandPracticeofPharmacy)，第19版，1995。可能的是其他成分可以存在于该肽药物配制品中。此类另外的成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质载体、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类另外的成分不应不利地影响药物配制品的总体稳定性。含有抗体的药物组合物可以在的几个部位，例如在局部部位，例如皮肤和粘膜部位、在旁路吸收的部位，例如在动脉中、在静脉中、在心脏中和在涉及吸收的部位，例如在皮肤中、皮肤下、在肌肉中或腹部中向对此类治疗有需要的患者给予。药物组合物的给予可以通过几种给予途径，例如皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、舌、舌下、口腔、口服、胃和肠内、鼻、肺(例如通过细支气管和绒毛膜或其组合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼睛(例如通过结膜)、输尿管和胃肠外向对此类治疗有需要的患者给予。合适的抗体配制品也可以通过检查其他已经开发的治疗性单克隆抗体的经验来确定。已经显示几种单克隆抗体在临床情况下有效，例如瑞图宣(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥单抗)、索雷尔(Xolair)(奥马珠单抗)、百克沙(Bexxar)(托西莫单抗(Tositumomab))、坎帕斯(Campath)(阿仑单抗(Alemtuzumab))、泽娃灵(Zevalin)、Oncolym和类似配制品可以与抗体一起使用。例如，可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用的小瓶中以10mg/mL的浓度提供单克隆抗体，配制成在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和注射用无菌水中用于IV给予。将pH调节到6.5。在另一个实施例中，抗体以约6.0的pH在包含约20mM柠檬酸钠、约150mMNaCl的配制品中提供。恶性肿瘤的诊断和治疗还提供了使用如本文所述的抗CD73抗体治疗个体，尤其是人类患者的方法。在一个实施例中，本披露提供了如本文所述的抗体在制备用于向人类患者给予的药物组合物中的用途。典型地，患者患有癌症或处于癌症的风险中。例如，在一个方面，提供了恢复或加强在对其有需要的患者中淋巴细胞活性的方法，该方法包括向所述患者给予中和的抗CD73抗体的步骤。抗体可以是例如人或人源化抗CD73抗体，该抗体降低或消除人CD73的5'-核苷酸酶活性。在一个实施例中，该方法用于增加在患有疾病的患者中的淋巴细胞(例如T细胞)活性，在该疾病中增加的淋巴细胞活性是有益的或该疾病是由免疫抑制、免疫抑制性细胞或由例如CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞产生的腺苷引起或以其为特征。这些方法对于例如具有实体瘤的患者将特别有用，其中怀疑肿瘤微环境(和其中的CD73介导的腺苷产生)可能导致通过免疫系统的识别缺乏(免疫逃逸)。肿瘤可以例如以表达CD73的免疫细胞例如CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞为特征。更具体地，这些方法和组合物用于治疗各种癌症和其他增殖性疾病。因为这些方法通过减少抑制淋巴细胞的抗肿瘤活性的腺苷来起作用，并且还可能另外通过增加ATP来增加淋巴细胞的抗肿瘤活性，所以它们可应用于非常广泛的癌症，包括特别是实体瘤，其中肿瘤微环境中的腺苷可以在抑制抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。在一个实施例中，用抗CD73抗体治疗的人患者具有肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、黑色素瘤、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的那些癌症)、血液恶性肿瘤包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴样白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和前体T淋巴细胞淋巴瘤、以及所述癌症的任何组合。本披露也可用于治疗转移性癌症。可以在治疗之前、治疗过程中或治疗之后测试或选择患者的一种或多种上述临床属性。在一个实施例中，抗CD73抗体以在个体中有效实现和/或维持(例如，持续1、2、3、4周，和/或直到随后给予结合抗原的化合物)用于中和CD73的酶活性的至少EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的血液浓度的量给予。在一个实施例中，抗CD73抗体的活性量是有效实现用于中和个体的血管外组织中CD73的酶活性的EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的量。在一个实施例中，抗CD73抗体的活性量是在个体中有效实现(或维持)用于抑制中和CD73的酶活性的EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的量。任选地，在一个实施例中，与通过ADCC(其例如可在等于或基本上低于提供受体饱和的浓度下提供完全效能)旨在消耗表达CD73的肿瘤细胞的一些抗体相反，抗CD73抗体是纯的阻断剂(没有实质的Fcγ受体介导的活性)，并且以有效中和CD73的酶活性的量给予持续希望的时间段，例如1周、2周、一个月、直到下一次抗CD73抗体的连续给予。在一个实施例中，抗CD73抗体以在个体中有效实现和/或维持(例如，持续1、2、3、4周、和/或直到随后给予抗CD73抗体)用于抑制CD73介导的AMP分解代谢成腺苷的至少EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的血液浓度的量给予(例如，通过定量AMP至腺苷的水解来评估在MDA-MB-231细胞中的5'-胞外核苷酸酶活性的中和，参见实例5)。在一个实施例中，抗CD73抗体的量是有效实现(或维持)在个体的血管外组织中抑制CD73介导的将AMP分解代谢成腺苷的EC50、任选地EC70、任选地基本上EC100的量。在一个实施例中，提供了用于治疗或预防个体中的癌症的方法，该方法包括向患有疾病的个体给予实现或维持指定的时间段的循环中(任选地在感兴趣的血管外组织(例如肿瘤或肿瘤环境)中)的浓度的量的抗CD73抗体，该浓度高于循环中50％、70％或完全(例如90％)受体饱和表达CD73的细胞所需的浓度(例如，如在PBMC中评估的)。任选地，实现的浓度比指定的受体饱和所需的浓度高至少20％、50％或100％。在一个实施例中，提供了用于治疗或预防个体中的癌症的方法，该方法包括向该个体给予实现或维持指定的时间段的循环中(任选地在感兴趣的血管外组织(例如肿瘤或肿瘤环境)中)的浓度的量的抗CD73抗体，该浓度高于结合表达CD73的细胞的EC50、任选地EC70或任选地EC100(如通过在表达CD73的细胞(例如在实例4中的MDA-MB-231细胞)上滴定抗CD73抗体所评估的)。任选地，实现的浓度比结合表达CD73的细胞的EC50、任选地EC70或任选地EC100高至少20％、50％或100％。在任何实施例中，抗体可以例如具有用于在人PBMC中结合表达CD73的细胞的为0.5-100ng/ml、任选地1-100ng/ml、任选地30-100ng/ml、例如约30-90ng/ml的EC50、任选地EC70或任选地EC100(例如，如通过在表达CD73的细胞例如实例4中的MDA-MB-231细胞上滴定抗CD73抗体所评估的)。例如，EC50可以是约30、37、39、43、57、58、61、62、90、95、143ng/ml。用抗CD73抗体中和CD73的酶活性的EC50可以是例如在约0.01μg/ml和1μg/ml之间、任选地在0.1μg/ml和10μg/ml之间、任选地在0.1μg/ml和1μg/ml之间。例如，EC50可以是约0.1μg/ml、约0.2μg/ml或约0.3μg/ml。因此，例如给予该抗CD73抗体的量以致于实现和/或维持至少0.1μg/ml、任选地至少0.2μg/ml、任选地至少1μg/ml、或任选地至少2μg/ml的血液浓度。当脉管系统外部的组织被靶向(肿瘤环境，例如在实体瘤的治疗中)时，与在循环中提供相应浓度的剂量相比，典型地认为需要约10倍更高的剂量。为了实现(和/或保持)循环(血液)中约1g/ml、2g/ml、10g/ml或20g/ml的浓度而给予的抗CD73抗体的量预期实现(和/或维持)分别为约0.1μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、2μg/ml的血管外组织(例如肿瘤组织)浓度。在一个实施例中，抗CD73抗体例如以使得实现和/或维持至少0.1μg/ml、任选地至少0.2μg/ml、任选地至少1μg/ml、或任选地至少2μg/ml的组织(例如肿瘤环境)浓度的量给予。抗体可以例如以实现和/或维持至少约1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml或20μg/ml，例如在1-100μg/ml、10-100μg/ml、1-50μg/ml、1-20μg/ml、或1-10μg/ml的血液浓度的量给予。可以调节给予的量以便在给予之后(例如1、2、3、4周等)的指定时间段期间提供希望的浓度的维持。在一些实施例中，给予一定量的抗CD73抗体以致于获得对应于用于中和CD73的酶活性的至少EC70或EC100的血液(血清)或血管外组织(例如肿瘤环境)中的浓度。抗体可以例如以实现和/或维持至少约1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml或20μg/ml的血液浓度或血管外组织(例如肿瘤环境)的量给予。可以例如在细胞测定中评价中和CD73的酶活性的EC50、EC70或EC100，如本文实例中所示的(例如通过定量AMP向腺苷的水解的对MDA-MB-231细胞中5'-胞外核苷酸酶活性的中和，参见实例5)。关于CD73的酶活性的中和的“EC50”是指抗CD73抗体的有效浓度，其产生相对于酶活性中和的最大反应或效应的50％。)。关于CD73的酶活性的中和的“EC70”是指产生其最大反应或效应的70％的抗CD73抗体的有效浓度。关于CD73的酶活性的中和的“EC100”是指抗CD73抗体的有效浓度，其产生相对于酶活性的这样的中和的基本上最大反应或效应。在一些实施例中，特别是对于实体瘤的治疗，设计所实现的浓度以导致在组织中(脉管系统外部，例如在肿瘤或肿瘤环境中)对应于中和酶活性的至少EC50(任选地约或至少约EC100)的浓度。在一个实施例中，抗CD73抗体的量在1和20mg/kg体重之间。在一个实施例中，该量每周、每两周、每月或每两个月一次向个体给予。在一个实施例中，提供了治疗患有癌症的人类个体的方法，该方法包括向个体给予有效量的本披露的抗CD73抗体至少一个给予周期(任选地至少2、3、4或更多个给予周期)，其中该周期是8周或更短的时期，其中对于该至少一个周期中的每一个，以1-20mg/kg体重的剂量给予抗CD73抗体的一次、两次、三次或四次剂量。在一个实施例中，通过静脉内输注给予抗CD73抗体。用于治疗人的合适的治疗方案包括例如向患者给予抗CD73抗体的如本文披露的量，其中该方法包括至少一个给予周期，其中给予至少一次剂量的抗CD73抗体。任选地，给予至少2、3、4、5、6、7或8次剂量的抗CD73抗体。在一个实施例中，给予周期是在2周和8周之间。在一个实施例中，提供了用于治疗或预防个体中的疾病(例如癌症、实体瘤、血液肿瘤)的方法，该方法包括向患有疾病(例如癌症、实体瘤)的个体给予中和CD73的酶活性的抗CD73抗体持续至少一个给予周期，该给予周期包括抗CD73抗体的至少第一次和第二次给予(并且任选地第三次、第四次、第五次、第六次、第七次和/或第八次或更多次)，其中该抗CD73抗体以有效实现或维持两次连续给予之间的量给予，至少0.1g/ml、任选地至少0.2μg/ml、任选地至少1μg/ml、或任选地至少2μg/ml(例如用于治疗血液肿瘤)、或任选地至少约1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、或20μg/ml，例如在1-100μg/ml、1-50μg/ml、1-20μg/ml、或1-10μg/ml之间的抗CD73抗体的血液(血清)浓度(例如用于治疗实体瘤，用于治疗血液肿瘤)。在一个实施例中，维持指定的连续血液浓度，其中血液浓度在指定时间段期间不会基本上降低到指定血液浓度(例如在两次给予抗体之间、数周、1周、2周、3周、4周)，即尽管血液浓度可在指定时间段期间变化，但保持的指定血液浓度代表最小或“谷(trough)”浓度。在一个实施例中，抗CD73抗体的治疗活性量是这样的抗体的量：在血液和/或组织中，在给予抗体之后能够提供用于中和CD73的酶活性持续至少约1周、约2周或约1个月的时间的(至少)EC50浓度、任选地EC70浓度、任选地EC100浓度的量。在使用本披露的抗CD73抗体治疗过程之前或期间，可以在患者肿瘤内和/或邻近患者肿瘤评估表达CD73的细胞、腺苷、ADP和/或AMP的存在或水平，以评估患者是否适合于治疗(例如预测患者是否可能对治疗有反应)。表达CD73的细胞的存在或水平、腺苷、ADP和/或AMP的水平的增加可以指示个体适合用本披露的抗CD73抗体(包括但不限于抑制底物结合的CD73的抗体)治疗(例如可能从中受益)。在用本披露的抗CD73抗体治疗的过程之前或期间，还可以在患者肿瘤内和/或邻近患者肿瘤评估腺苷、ADP和/或AMP水平，以评估患者是否从用抗CD73抗体的治疗受益。与治疗(或抗体的给药)之前的水平相比，在给予(或抗体的给药)之后，降低的腺苷、ADP和/或AMP的水平可以表明个体受益于用本披露的抗CD73抗体的治疗(包括但不限于抑制底物结合的CD73的抗体)。任选地，如果患者受益于用抗CD73抗体的治疗，那么方法可以进一步包括向患者给予另外剂量的抗CD73抗体(例如，继续治疗)。在一个实施例中，评估患者肿瘤内和/或其附近的组织样品中的腺苷、ADP和/或AMP水平包括从患者获得人类组织的生物样品(该人类组织选自下组，该组由以下各项组成：来自癌症患者的组织，例如，癌症组织、邻近癌症或处于癌症周围的组织、癌症邻近组织、邻近非肿瘤组织或正常邻近组织)，以及检测组织内的腺苷、ADP和/或AMP水平。来自患者的水平可以是将该水平与参考水平(例如，对应于健康个体)进行比较。在一个实施例中，本披露提供了用于在对其有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，该方法包括：a)检测CD73表达的细胞(或腺苷、ADP和/或AMP)肿瘤环境，任选地在肿瘤内和/或在相邻组织内；并且b)在确定肿瘤环境包含任选以与参考水平相比增加的水平的表达CD73的细胞(或腺苷、ADP和/或AMP)时，向个体给予抗CD73抗体。任选地，在肿瘤环境内检测表达CD73的细胞(或腺苷、ADP和/或AMP)包括从个体获得包含癌症组织和/或癌症附近或处于肿瘤周围的组织(例如，癌症邻近组织、邻近非肿瘤组织或正常邻近组织)的生物样品，以及检测表达CD73的细胞(或腺苷、ADP和/或AMP)的水平。表达CD73的细胞可以包括(例如)肿瘤细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞。患有癌症的患者可用抗CD73抗体治疗，用或不用预先检测步骤来评估CD73在肿瘤微环境(例如在肿瘤细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞上)中的细胞上的表达。任选地，治疗方法可以包括检测来自个体的肿瘤(例如，在癌症组织、癌症邻近或处于癌症周围的组织、癌症邻近组织、邻近非肿瘤组织或正常邻近组织中)的生物样品中的CD73核酸或多肽的步骤。生物样品包含表达CD73的细胞(例如与参考相比，显著地表达；以高水平表达CD73，用抗CD73抗体进行高强度染色)的确定表明患者具有可能从用抑制CD73的药剂的治疗强烈受益的癌症。在一个实施例中，该方法包括在生物样品中确定CD73核酸或多肽的表达水平并且将该水平与对应于健康个体的参考水平进行比较。生物样品包含以比参考水平增加的水平的表达CD73核酸或多肽的细胞的确定表明患者具有可以用本披露的抗CD73抗体治疗的癌症。任选地，检测生物样品中的CD73多肽包括检测在恶性细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞表面上表达的CD73多肽。在一个实施例中，生物样品包含显著地表达CD73核酸或多肽的细胞的确定表明患者具有可以用本披露的抗CD73抗体治疗的癌症。当提及CD73多肽时，“显著地表达”意指CD73多肽在从给定患者获取的大量细胞中表达。然而术语“显著地表达”的定义不限于精确的百分率值，多数情况下，称为“显著地表达”的受体将存在于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的取自患者的肿瘤细胞上。确定个体是否具有以表达CD73多肽的细胞为特征的癌症可以例如包括从包含来自癌症环境(例如肿瘤或肿瘤相邻组织)的细胞的个体获得生物样品(例如通过进行活组织检查)，使所述细胞与结合CD73多肽的抗体接触，并且检测这些细胞是否在其表面上表达CD73。任选地，确定个体是否具有表达CD73的细胞包括进行免疫组织化学测定。在一个实施例中，本披露提供了用于在对其有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，该方法包括：a)确定在肿瘤环境内，任选地在肿瘤内和/或在相邻组织内的细胞的CD73多肽状态，并且b)当确定肿瘤环境包含表达CD73多肽的细胞之后，任选地在与参考水平相比增加的水平，向个体给予抗CD73抗体。在一个实施例中，细胞是肿瘤细胞。在另一个实施例中，在肿瘤环境、肿瘤和/或相邻组织内的细胞是非恶性免疫细胞，例如T细胞。任选地，确定在肿瘤环境内的CD73多肽状态包括从个体获得包含癌症组织和/或癌症邻近或处于癌症周围的组织的生物样品(例如，癌邻近组织、邻近非肿瘤组织或正常邻近组织)，使所述细胞与结合CD73多肽的抗体接触，并且检测表达CD73的细胞。抗体组合物可以用于单一疗法或与一种或多种其他治疗剂(包括通常用于给予抗体的特定治疗目的的试剂)的组合疗法。另外的治疗剂将通常按照在用于正治疗的具体疾病或病状的单次疗法中针对该药剂典型使用的量和治疗方案来给予。这样的治疗剂包括但不限于抗癌剂和化疗剂。在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是能够诱导针对其结合的细胞的ADCC的抗体或其他含Fc结构域的蛋白质，例如，经由NK细胞表达的CD16。典型地，这样的抗体或其他蛋白质将包含结合感兴趣的抗原(例如，存在于肿瘤细胞(肿瘤抗原)上的抗原)的结构域和Fc结构域或其部分，并且将展示经由抗原结合结构域与抗原的结合以及经由Fc结构域与Fcγ受体(例如CD16)的结合。在一个实施例中，其ADCC活性将至少部分地由CD16介导。在一个实施例中，另外的治疗剂是具有天然或经修饰的人Fc结构域的抗体，例如来自人IgG1或IgG3抗体的Fc结构域。术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是在本领域中已被充分理解的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、以及嗜酸性粒细胞。术语“ADCC诱导的抗体”是指如通过本领域技术人员已知的一种或多种测定来测量的显示ADCC的抗体。典型地，这种活性的特征在于Fc区与各种FcR的结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员将认识到抗体显示ADCC的能力可以例如凭借其亚类(例如IgG1或IgG3)、通过引入Fc区的突变、或凭借对抗体Fc区中的碳水化合物模式的修饰。在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是抑制CTLA-4或PD-1轴(即抑制PD-1或PD-L1)的药剂(例如，抗体)。可以使用结合CTLA-4、PD-1或PD-L1的抗体，例如，以此类试剂用作单一疗法的示例性剂量和/或频率，例如，如下所述。PD-1是CD28受体家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(冈崎(Okazaki)等人(2002)免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)14:391779-82；班尼特(Bennett)等人(2003)免疫学杂志(JImmunol)170:711-8)。已经鉴定了PD-1的两个配体，PD-L1和PD-L2，它们已经显示在结合PD-1后下调T细胞活化(弗里曼(Freeman)等人(2000)实验医学杂志(JExpMed)192:1027-34；Latchman等人(2001)自然免疫学(NatImmunol)2:261-8；卡特(Carter)等人(2002)欧洲免疫学杂志(EurJImmunol)32:634-43)。PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(董(Dong)等人(2002)自然医学(Nat.Med.)8:787-9)。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖的减少和癌性细胞的免疫逃避。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时效应是加和的。阻断PD-1可以有利地包括使用防止PD-L1诱导的PD-1信号传导的抗体，例如通过阻断与其天然配体PD-L1的相互作用。在一个方面，该抗体结合PD-1(抗PD-1抗体)；这样的抗体可以阻断PD-1和PD-L1之间和/或PD-1和PD-L2之间的相互作用。在另一个方面，抗体结合PD-L1(抗PD-L1抗体)并且阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用。目前存在至少六种市售或临床评价的阻断PD-1/PD-L1途径的药剂，这些药剂中的任一种可与本披露的抗CD73抗体组合使用。一种药剂是BMS-936558(纳武单抗(Nivolumab)/ONO-4538，百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb)；以前的MDX-1106)。纳武单抗(商品名)是FDA批准的完全人类IgG4抗PD-L1mAb，其抑制PD-L1配体与PD-1和CD80两者的结合，并且在WO2006/121168中被描述为抗体5C4，其披露内容通过引用结合在此。对于黑色素瘤患者，在3mg/kg的剂量下观察到最显著的OR，而对于其他癌症类型，其为10mg/kg。纳武单抗通常以10mg/kg每3周一次给药，直到癌症进展。MK-3475(来自默克公司(Merck)的人IgG4抗-PD1mAb)，也称为兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)或潘布陆利珠单抗(pembrolizumab)(商品名)，也已被FDA批准用于治疗黑色素瘤并且正在其他癌症中进行测试。以2mg/kg或10mg/kg每2或3周一次测试潘布陆利珠单抗直至疾病进展。编码人源化抗体h409AII的重链和轻链的可变区的DNA构建体已经保藏在美国典型培养物保藏中心专利储存库(维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA))。含有编码h409A-I1重链的DNA的质粒于2008年6月9日储存并鉴定为081469_SPD-H，并且含有编码h409AI1轻链的DNA的质粒于2008年6月9日储存并鉴定为0801470_SPD-L-I1。MPDL3280A/RG7446(来自罗氏公司(Roche)/基因技术公司(Genentech)的抗PD-L1)是包含工程化的Fc结构域的人抗PD-L1Ab，其通过最小化FcγR结合和随后的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而优化功效和安全性。每3周一次给予≤1、10、15、和25mg/kgMPDL3280A的剂量长达1年。在3期试验中，在NSCLC中每三周一次通过静脉内输注以1200mg给予MPDL3280A。AMP-224(阿帕里免疫公司(Amplimmune)和GSK公司)是包含融合到Fc结构域的PD-L2胞外结构域的免疫黏附素。皮立珠单抗(Pidlizumab)(CT-011；治疗技术公司(CureTech))(来自治疗技术公司(CureTech)/梯瓦制药公司(Teva)的人源化IgG1抗PD1mAb)、皮立珠单抗(CT-011；治疗技术公司(CureTech))(参见例如WO2009/101611)，患有利妥昔单抗敏感性复发性FL的30名患者使用3mg/kg静脉内CT-011每4周一次持续4次输注进行治疗，从第一次输注CT-011后2周开始，每周与以375mg/m2剂量的利妥昔单抗组合进行治疗持续4周。另外已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括AMP-224(授权给GSK公司的B7-DC/IgG1融合蛋白)、在WO2012/145493中描述的AMP-514、在WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗体MEDI-4736(由阿斯利康有限公司(AstraZeneca)/米迪缪尼公司(Medimmune)开发的抗PD-L1)、在WO2010/077634中描述的抗体YW243.55.S70(抗PD-L1)、MDX-1105(也称为BMS-936559，描述于WO2007/005874中的由百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb)开发的抗PD-L1抗体)，以及在WO2006/121168、WO2009/014708、WO2009/114335和WO2013/019906中描述的抗体和抑制剂，其披露内容通过引用在此结合。抗PD1抗体的进一步实例披露于WO2015/085847中(上海恒瑞医药有限公司(ShanghaiHengruiPharmaceuticalCo.Ltd.))，例如分别具有SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:8的轻链可变域CDR1、2和3的抗体，和分别为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的抗体重链可变域CDR1、2和3，其中SEQIDNO参考号是根据WO2015/085847进行编号的，其披露内容通过引用结合在此。还可以使用与这些抗体中的任一种竞争结合PD-1或PD-L1的抗体。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152，是CD28受体家族的另一种抑制成员，并且在T细胞上表达。结合和抑制CTLA-4的抗体是本领域已知的。在一个实例中，抗体是伊匹木单抗(ipilimumab)(商品名百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb))，一种人IgG抗体。Yervoy的示例性给药方案是每三周一次经90分钟静脉内给予3mg/kg。在一个实例中，与本披露的抗CD73抗体组合使用的抗体是与伊匹木单抗竞争结合CTLA-4的抗体。在治疗方法中，CD73结合化合物和第二治疗剂可以分开、一起或顺序地给予，或在混合剂中给予。在一些实施例中，结合抗原的化合物是在给予第二治疗剂之前给予。例如，CD73结合化合物可以是在给予第二治疗剂之前约0至30天给予。在一些实施例中，CD73结合化合物是在给予第二治疗剂之前从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1至5天来给予。在一些实施例中，CD73结合化合物是与治疗剂的给予同时给予的。在一些实施例中，CD73结合化合物是在给予第二治疗剂之后给予的。例如，CD73结合化合物可以在给予第二治疗剂之后约0至30天来给予。在一些实施例中，CD73结合化合物是在给予第二治疗剂之后从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1至5天来给予。实例实例1：新颖的抗huCD73抗体的产生为了获得抗人CD73抗体，用重组人CD73-His细胞外结构域重组蛋白(如下所述克隆并产生于InnatePharma公司)来免疫Balb/c小鼠。小鼠接收了用50μgCD73蛋白和全弗氏佐剂的乳液进行的一次初次免疫(腹膜内注射)，用由50μgCD73蛋白和不完全弗氏佐剂的乳液进行的第二次免疫(腹膜内注射)，并且用10μgCD73蛋白进行最后加强(静脉内注射)。在该加强后3天将免疫脾细胞与X63.Ag8.653无限增殖的B细胞融合，并且在经辐照的脾细胞存在下培养。将杂交瘤铺在含有半固体甲基纤维素的培养基中，并且使用clonepix2装置(分子器件公司(MolecularDevices))挑取生长的克隆。初级筛选：在初级筛选中通过流式细胞术使用亲本和huCD73、cynoCD73或moCD73表达的重组宿主细胞系测试生长克隆的上清液(SN)。表达huCD73和cynoCD73的重组宿主细胞分别用0.35μM和0.035μMCFSE染色。对于流式细胞术筛选，所有细胞均等混合，并且通过用PE标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(pAb)揭示出在上清液中的反应抗体的存在。发现47个抗体结合人和食蟹猴CD73。结合huCD73和cynoCD73的所有抗体作为具有重链N297Q(卡巴特EU编号)突变的嵌合人IgG1抗体产生，该重链N297Q突变导致缺乏N-键联的糖基化和基本上缺乏对Fcγ受体的结合。第二次筛选：在重组CD73蛋白上进行该信息筛选(参见实例2)，以评估47种选择的抗体的CD73酶活性阻断性质。47种抗体中的35种似乎完全或部分阻断CD73活性。重组huCD73的克隆、生产和纯化分子生物学使用以下引物从MIAPACA-2cDNA克隆huCD73蛋白：TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCCCCGAGCCGCGCG(SEQIDNO：45)(正向)和CCGCCCCGACTCTAGAtcaGTGATGGTGATGATGGTGcttgatccgaccttcaactg(SEQIDNO：46)(反向)。然后使用InFusion克隆系统将纯化的PCR产物克隆到表达载体中。将6xHis标签添加到蛋白质的C-末端部分中用于纯化步骤。克隆的huCD73的氨基酸序列：MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKHHHHHH(SEQIDNO：2)huCD73蛋白的表达和纯化在克隆的序列验证后，细胞被核转染，然后将产生的池亚克隆以获得产生huCD73蛋白的细胞克隆。收获来自在滚筒中生长的huCD73克隆的上清液，使用Ni-NTA柱纯化，并且使用250mM咪唑洗脱。然后将纯化的蛋白质上样到S200大小排阻层析柱上。将对应于二聚体的纯化蛋白质配制于Tris20mMpH7.5、NaCl120mM和CaCl24mM缓冲液中用于酶活性测定，而配制品缓冲液补充有20％甘油。实例2：可溶性CD73阻断的评价如萨彻弥尔(Sachsenmeier)等人(生物分子筛选杂志(JBiomolScreening)，2012)所述评估抗CD73抗体阻断CD73的酶活性的能力。简言之，在剂量范围的抗CD73或同种型对照Ab存在下，将500ng/ml重组人CD73-his在白色96W平底微板中孵育。将板在37℃下孵育1小时。向每个孔中添加12.5μΜATP和125μΜAMP，并且将板在37℃下孵育另外的30分钟。将含荧光素酶/荧光素的细胞滴度Glo(普洛麦格公司(Promega))添加到孔中，将板在室温下在黑暗中孵育5分钟，并且使用Enspire装置(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))测量发射光。已知过量的AMP阻断ATP依赖性荧光素酶活性。将AMP切割为腺苷+无机磷酸的CD73的添加恢复荧光素酶活性和光发射。因此，阻断CD73的酶活性的抗体将减少光发射。如下所述评估酶抑制的百分比：-条件：○ATP+AMP：最大荧光素酶抑制(100％)○ATP+AMP+CD73：无荧光素酶抑制(0％)-公式：残留CD73活性：使用这个实验设置，发现从实例1获得的35个抗体、以及参考mAb7G2、4G4和1E9所有都抑制CD73活性。考虑到使用参考抗体报道的混合结果，我们考虑了CD73阻断是否可能由二价抗体交联CD73二聚体而不是酶位点的真正阻断引起。也就是说，抗体可能正在引起CD73二聚体的寡聚复合体，因为两价结合的mAb可能结合两种不同的CD73同源二聚体，转而导致更大的蛋白复合体。然后我们通过在抗体:CD73二聚体的高比例下进行阻断测定来测试这种可能性。在这个设置中，mAb大大过量并且可以发生寡聚复合体的诱导，允许观察到真正的CD73功能性阻断。在这个设置中，实际上所有抗体，包括参考mAb4G4和1E9，都不抑制CD73的酶活性。在所有测试浓度下，抗体11E1、8C7、3C12和6E1功能性阻断CD73。对于mAb11E1、8C7和6E1的示例性结果显示于图1中。随后发现进一步的抗体(结果未显示)对在细胞表面上表达的CD73具有低亲和力，因此可能代表不适合于高亲和力结合细胞表面CD73的表位。还测试了在最近出版物中报道的可用的抗CD73参考抗体：评估了7G2、4G4和1E9的CD73阻断。结果(见图1)显示7G2阻断CD73，而4G4和1E9不阻断CD73活性，因为残余酶活性回复到大约起始水平或阴性对照。还测试了抗体AD2，并且发现其在任何浓度下不阻断CD73活性。4G4和1E9因此代表在这个测定中非特异性抑制CD73的抗体类型，可能通过在溶液中引起寡聚化。因此，在这个测定中，抗体7G2、11E1、8C7、3C12和6E1功能性阻断CD73。对于CD73阻断的EC50值显示在下表中。AbEC50(μg/ml)1E110.416E10.338C71.293C120.41实例3：通过ELISA对重组CD73蛋白进行Ab滴定功能性阻断可溶性重组CD73的抗体被更充分地表征为与可溶性重组人CD73的结合。将5μg/ml重组人CD73蛋白(IPH，同种型E6)包被在PBS中的Max-iSorpELISA板(能肯公司(Nunc))上，在4℃下过夜。将板在洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温20)中洗涤5次，并且通过添加200μl/wTBS起始阻断缓冲液(赛默飞世尔公司(ThermoFicher))使非特异性位点饱和。将剂量范围的抗CD73抗体在37℃下孵育2h。将板在洗涤缓冲液中洗涤5次，并且在室温下添加HRP偶联的山羊抗人或山羊抗小鼠IgGFc片段第二抗体(Bethyl，1/50000)持续1hr以检测结合的抗CD73抗体。将板在洗涤缓冲液中洗涤5次，通过添加TMB(HRP底物)并且在室温下在黑暗中孵育板5至10分钟来揭示结合的第二抗体。通过添加HCl1M终止酶反应，并且在450nm处测量O.D.。光密度对抗CD73Ab浓度绘制在图上，并且使用图板棱柱(GraphPadPrism)软件计算EC50。结果显示于图2中。抗体11E1、8C7、6E1和7G2所有都结合可溶性重组CD73。结合的EC50值显示在下表中。抗体EC50(μg/ml)1E110.0126E10.0148C70.0093C120.0147G20.037实例4：流式细胞术滴定使用内源性表达CD73的表达人、食蟹猴和小鼠CD73的重组宿主细胞系或人MDA-MB-231乳腺癌来评价抗CD73抗体结合人CD73且在食蟹猴和/或小鼠CD73上交叉反应的能力。MDA-MB-231细胞可从ATCC(参考HTB-26)获得。将重悬于PBS/0.2％BSA/0.02％NaN3(称为“染色缓冲液”)中的105个细胞分布在圆底96W微板中。将剂量范围的抗CD73抗体添加到板中，并且将细胞在4℃下孵育45min。通过在4℃下以400g将板离心3min，在染色缓冲液中将细胞洗涤三次。将在染色缓冲液中稀释的PE偶联的山羊抗小鼠或山羊抗人IgGFc片段第二抗体(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))添加到细胞中，并且将板在4℃下再孵育另外的30分钟。如上所述将细胞洗涤三次，并且在装备有HTFC读板器的AccuryC6流式细胞仪上分析。将荧光的中值与抗体浓度绘制在图上，并且使用图板棱柱程序计算EC50。对于新的mAb11E1、8C7、3C12和6E1以及参考mAb7G2和1E9的结果显示于图3中。mAb11E1、8C7、3C12和6E1以极好的亲和力结合表达人或食蟹猴(但不是小鼠)CD73的重组宿主细胞。然而，mAb7G2和1E9显示对表达人或食蟹猴CD73的细胞的差的结合。使用内源性表达CD73的人MDA-MB-231乳腺癌细胞重复实验。再次，mAb11E1、8C7、3C12和6E1以极好的亲和力结合，而mAb7G2和1E9显示差的结合。MDA-MB-231细胞的结果显示于图4中。可能的是，7G2和1E9结合CD73上的表位，该表位在表达CD73的细胞(包括尤其是内源性表达CD73的人肿瘤细胞)表面上的重组CD73和CD73中不同地存在，导致mAb对重组CD73(例如用于免疫)结合良好而不是细胞表面CD73。在另一方面，由11E1、8C7、3C12和6E1结合的表位保留存在于细胞表面CD73上。然后使用内源性表达CD73的人MDA-MB-231乳腺癌细胞重复实验。在存在或不存在200μM腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(APCP)的情况下将细胞在37℃下预孵育30分钟，接着添加抗体。APCP是ADP的类似物，并且不可逆地结合到CD73的活性位点。当被APCP结合时，CD73将构象从“开放”构象改变为“闭合”构象。mAb11E1、8C7、3C12和6E1在存在和不存在APCP的情况下以良好的亲和力结合MDA-MB-231细胞。在APCP存在下，EC50与在APCP不存在下观察到的EC50相似。在APCP不存在下，11E1、8C7、3C12和6E1的最大结合的平台比在APCP存在下的更高，而对于AD2的情况则相反。EC50值显示于下表中。实例5：细胞CD73活性阻断部分A：在MDA-MB-231肿瘤细胞中的阻断评价了抗CD73抗体中和细胞表面表达的CD73的5'-胞外苷核酸酶活性的能力。MDA-MB-231肿瘤细胞系被用作表达CD73的模型肿瘤细胞系。在下面详述的实验中使用的所有试剂在TBSpH7.5(Tris20mMpH7.5，NaCl150mM)中稀释。在PBS-EDTA中回收MDA-MB-231细胞系，并且在TBSpH7.5中洗涤两次。在剂量范围的抗CD73抗体存在下将0.5至1x105个细胞涂板在平底96孔板中，并且在4℃下孵育2小时。在4℃下将200mMAMP添加到细胞中持续30分钟的孵育期(以避免CD73下调)。然后离心板，并且将50μΙ上清液转移至平底96孔培养板中。使用孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒(研发系统公司(R&DSystems))并且遵循制造商提供的TDS，定量由AMP水解成腺苷产生的游离磷酸盐。将磷酸盐浓度对抗CD73Ab浓度绘制在图中，并使用图板棱柱软件计算EC50。结果显示于图5中。抗体11E1、8C7、3C12和6E1中和细胞CD73的酶活性和EC50值显示于下表中。AbEC50(μg/ml)1E110.1956E10.2098C70.3193C120.210每种抗体实现了酶活性降低超过75％、或超过80％。抗体7G2，与对细胞CD73的差的结合一致(参见实例4)，没有中和细胞CD73的酶活性。与其结合细胞表面CD73的有限能力一致，抗体7G2在任何浓度下都不中和CD73酶活性，并且在所测试的最高浓度下仅引发轻微的部分抑制。在每种情况下，对于非内化的抗体1E11、6E1、8C7和3C12，中和MDA-MB-231细胞中细胞CD73的酶活性所需的EC50值比用于结合在MDA-MB-231细胞中的细胞表面CD73所需的EC50值高几倍。部分B：在MDA-MB-231、H292和A375肿瘤细胞中的阻断使用与上述相同的测定，评估了抗CD73抗体中和细胞表面表达的CD73的5'-胞外核苷酸酶活性的能力，这次在多个实验中使用平行表达CD73细胞系的三种肿瘤细胞系：MDA-MB-231乳腺癌肿瘤细胞系，H292肺癌细胞系(参见例如ATCC参考CRL-1848)和A375黑色素瘤癌细胞系(参见例如ATCC参考CRL-1619)。计算下表中所示的中和所需的有效浓度(EC，例如EC50、EC70、EC100)作为对三种不同表达CD73的细胞类型的重复实验的平均值。抗体1E113C126E18C7N＝8882EC50(μg/ml)0.100.140.130.21EC70(μg/ml)0.150.180.190.46EC100(μg/ml)0.520.300.680.72实例6：流式细胞术竞争研究使用表达人CD73的重组宿主细胞系来评估我们的候选物和其他商业抗CD73抗体之间的竞争。将在染色缓冲液中重悬的105个细胞分配到圆底96W微板中。在存在或不存在剂量范围的参考小鼠抗人CD73抗体的情况下，将固定剂量的测试抗体(1μg/ml)添加到细胞中。将细胞在4℃下孵育45分钟，然后如上所述洗涤三次。向在染色缓冲液中稀释的PE偶联的或山羊抗人IgGFc片段第二抗体(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))添加到细胞中，并且将板在4℃下孵育另外的30分钟。将细胞洗涤三次，并且在配备有HTFC读板器的AccuryC6流式细胞仪上分析。将荧光的中值对抗体浓度进行绘图。为了研究CD73中和抗体的表位，将已知抗体阻断新抗体与细胞膜CD73的结合的能力评价为抗体之间的竞争。用新抗体候选物测试实例2中所示的参考抗体7G2，该参考抗体7G2具有中和CD73而不依赖于寡聚化诱导的能力，但是其在细胞测定中不结合或中和CD73。抗体11E1、8C7、3C12或6E1都不与7G2竞争结合CD73，说明7G2结合到与新抗体不同的CD73上的区域。实例7：CD73下调使用内源性表达CD73的人MDA-MB-231乳腺癌细胞系评价抗CD73抗体下调CD73表达的能力。将在染色缓冲液中重悬的105个细胞分配到平底96W微板中。向细胞中添加10μg/ml的抗CD73抗体，并且将板在4℃或37℃下孵育一段时间。在T＝10min、30min、1h、2h、3h和4h时，使用PSB/2mMEDTA回收细胞，如先前所述在染色缓冲液中洗涤三次，并且在4℃下孵育直至时间过程结束。向细胞中添加10μg/ml的AlexaFLuor647-偶联的非竞争性抗CD73抗体，并且将板在4℃下孵育30min。将细胞洗涤三次，并且在配备有HTFC读板器的AccuryC6流式细胞仪上分析。表达百分比对孵育时间绘制在图上。评价抗体引起细胞上CD73表达下调的能力，并且与参考mAbAD2、7G2和1E9比较。AD2、7G2和1E9中的每一个引起CD73的下调，表明这些mAb可能引起CD73的聚集和内化。AD2引起超过20％的孔减少，而7G2和1E9各自引起细胞表面的超过50％受体的减少。抗体11E1、8C7、3C12或6E1都不引起细胞表面CD73的减少。结果显示于图6中。实例8：表位作图为了定义抗CD73抗体的表位，我们设计了CD73突变体，其通过在CD73表面上的分子表面暴露的氨基酸的取代来定义。突变体在Hek-293T细胞中转染，如下表所示。使用SEQIDNO:1的编号显示下表1中的靶向氨基酸突变。表1突变体的产生通过PCR产生CD73突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上电泳并使用MachereyNagelPCR清除凝胶提取试剂盒(参考740609)纯化。然后用ClonTechInFusion系统将每个突变体产生的纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备为小量制备品(Miniprep)并测序。在测序之后，使用普洛麦格纯化生产(PromegaPureYield)TM质粒小量制备系统(PlasmidMidiprepSystem)将含有突变序列的载体制备为小量制备品(Midiprep)。在测试转基因表达之前，HEK293T细胞在DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen))中生长，使用英杰公司(Invitrogen)的脂染胺2000用载体进行转染，并且在37℃下在CO2培养箱中孵育24小时。抗CD73与HEK293T转染细胞的结合的流式细胞术分析通过流式细胞术测试抗CD73抗体与每种突变体的结合。进行第一个实验以确定在一个浓度下失去其与一个或若干个突变体的结合的抗体。为了证实结合的丧失，对抗体进行抗体滴定，其结合似乎受CD73突变(1-0.1-0.01-0.001μg/ml)的影响。抗体11E1、8C7、3C12或6E1丧失与CD73的突变体3结合，但不丧失与任何其他突变体结合。突变体3在残基A99、E129、K133、E134、和A135处含有氨基酸取代，表明突变体的一个或多个或所有残基对这些抗体的核心表位是重要的。引起CD73聚集和内化的抗体AD2不丧失与突变体3的结合；AD2反而丧失与在残基Q70、R73、A74、A107和R109处具有取代的突变体2的结合。抗体3C12和AD2的示例性结果显示于图7中。抗体7G2丧失了对突变体5、6和7(但不是突变体2或3)的结合。当被不可逆ADP类似物结合物APCP所示的活性位点配体结合时，CD73将构象从“开放”构象改变为“闭合”构象。如实例4中所示，mAb11E1、8C7、3C12和6E1在APCP存在和不存在下结合细胞CD73，表明当活性位点被占据时，这些抗体的表位保留存在于CD73上。图8A显示了CD73二聚体的分子结构，其中在“开放”或“闭合”两种构型中指示出突变体2(AD2的结合丧失)中突变的氨基酸(白圈)。图8B显示了CD73二聚体的分子结构，其中在“开放”或“闭合”两种构型中指示出突变体3(由11E1、8C7、3C12或6E1的结合丧失)中突变的氨基酸。活性位点由框(虚线)指示出。有趣的是，从图8B中可以看出，当CD73呈现二聚体形式时，在突变体3中突变的氨基酸是在CD73二聚体的共同面上，例如在或近似在平面上(其他突变体的其他表位不是)。最后，从突变体3中的氨基酸的比较可以看出，这些残基相对远离酶活性位点(在图8B中所示)，这与涉及CD73的变构抑制的作用模式一致。实例9：通过表面等离子体共振(SPR)的CD73结合亲和力BiacoreT100一般程序和试剂在25℃下在BiacoreT100装置(BiacoreGE医疗集团)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(BiacoreGE医疗集团)和NaOH10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。使用BiacoreT100评估软件来分析传感图。从GE医疗集团(GEHealthcare)购买蛋白A。在InnatePharma公司克隆、生产和纯化人可溶性二聚体CD73蛋白。蛋白A的固定化蛋白A蛋白质共价地固定在传感器芯片CM5上的葡聚糖层中的羧基基团上。用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺(BiacoreGE医疗集团))将芯片表面激活。将蛋白质A在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH5.6)中稀释至10μg/ml，并且注射直到达到适当的固定水平(即2000RU)。使用100mM乙醇胺pH8(BiacoreGEHealthcare)将剩余的激活的基团失活。亲和力研究根据制造商推荐的标准捕获-动态(Capture-Kinetic)方案(BiacoreGE医疗基团动态术(kineticwizard))进行亲和力研究。将人重组可溶性二聚体CD73蛋白的系列稀释液(范围从1.23nM至300nM)依次注射到捕获的抗CD73抗体上，并且允许在再生前解离10min。使用1:1动态结合模型拟合整个传感图组。二价亲和力和动态结合和解离速率常数显示于下表2中。表2CD73AbKD(nM)1E110.8223C120.6826E10.819在此所引用的所有文献(包括出版物、专利申请、以及专利)均通过引用以其全部内容特此结合，并且引用的程度如同每个文献被个别地并且明确地指示通过引用结合并且以其全部内容在此阐述(至法律允许的最大程度)，而不考虑在此其他地方做出的特定文件的任何单独提供的结合。除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则术语“一个/种”和“该”以及类似指代对象的使用应解释为包括单数和复数二者。除非另有说明，本文提供的所有精确值均代表相应的近似值(例如，所有精确的示例值是相对于具体因子提供的，或者测量可以视为还提供相应的近似测量，在适当时由“约”修饰)。除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则本文关于一种或多种要素使用术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本文的任何方面或实施例的描述，旨在提供对“由那一种或多种特定要素组成”、“基本上由那一种或多种特定要素组成”或“基本上包含那一种或多种特定要素”的本文类似方面或实施例的支持(例如，除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则本文所述的包含特定要素的组合物应理解为也描述由那个要素组成的组合物)。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。序列表<110>INNATEPHARMA公司<120>CD73阻断<130>CD73-1<150>US62/062,323<151>2014-10-10<150>US62/118,549<151>2015-02-20<150>US62/133,597<151>2015-03-16<150>US62/188,881<151>2015-07-06<160>46<170>PatentIn3.5版<210>1<211>574<212>PRT<213>智人<400>1MetCysProArgAlaAlaArgAlaProAlaThrLeuLeuLeuAlaLeu151015GlyAlaValLeuTrpProAlaAlaGlyAlaTrpGluLeuThrIleLeu202530HisThrAsnAspValHisSerArgLeuGluGlnThrSerGluAspSer354045SerLysCysValAsnAlaSerArgCysMetGlyGlyValAlaArgLeu505560PheThrLysValGlnGlnIleArgArgAlaGluProAsnValLeuLeu65707580LeuAspAlaGlyAspGlnTyrGlnGlyThrIleTrpPheThrValTyr859095LysGlyAlaGluValAlaHisPheMetAsnAlaLeuArgTyrAspAla100105110MetAlaLeuGlyAsnHisGluPheAspAsnGlyValGluGlyLeuIle115120125GluProLeuLeuLysGluAlaLysPheProIleLeuSerAlaAsnIle130135140LysAlaLysGlyProLeuAlaSerGlnIleSerGlyLeuTyrLeuPro145150155160TyrLysValLeuProValGlyAspGluValValGlyIleValGlyTyr165170175ThrSerLysGluThrProPheLeuSerAsnProGlyThrAsnLeuVal180185190PheGluAspGluIleThrAlaLeuGlnProGluValAspLysLeuLys195200205ThrLeuAsnValAsnLysIleIleAlaLeuGlyHisSerGlyPheGlu210215220MetAspLysLeuIleAlaGlnLysValArgGlyValAspValValVal225230235240GlyGlyHisSerAsnThrPheLeuTyrThrGlyAsnProProSerLys245250255GluValProAlaGlyLysTyrProPheIleValThrSerAspAspGly260265270ArgLysValProValValGlnAlaTyrAlaPheGlyLysTyrLeuGly275280285TyrLeuLysIleGluPheAspGluArgGlyAsnValIleSerSerHis290295300GlyAsnProIleLeuLeuAsnSerSerIleProGluAspProSerIle305310315320LysAlaAspIleAsnLysTrpArgIleLysLeuAspAsnTyrSerThr325330335GlnGluLeuGlyLysThrIleValTyrLeuAspGlySerSerGlnSer340345350CysArgPheArgGluCysAsnMetGlyAsnLeuIleCysAspAlaMet355360365IleAsnAsnAsnLeuArgHisThrAspGluMetPheTrpAsnHisVal370375380SerMetCysIleLeuAsnGlyGlyGlyIleArgSerProIleAspGlu385390395400ArgAsnAsnGlyThrIleThrTrpGluAsnLeuAlaAlaValLeuPro405410415PheGlyGlyThrPheAspLeuValGlnLeuLysGlySerThrLeuLys420425430LysAlaPheGluHisSerValHisArgTyrGlyGlnSerThrGlyGlu435440445PheLeuGlnValGlyGlyIleHisValValTyrAspLeuSerArgLys450455460ProGlyAspArgValValLysLeuAspValLeuCysThrLysCysArg465470475480ValProSerTyrAspProLeuLysMetAspGluValTyrLysValIle485490495LeuProAsnPheLeuAlaAsnGlyGlyAspGlyPheGlnMetIleLys500505510AspGluLeuLeuArgHisAspSerGlyAspGlnAspIleAsnValVal515520525SerThrTyrIleSerLysMetLysValIleTyrProAlaValGluGly530535540ArgIleLysPheSerThrGlySerHisCysHisGlySerPheSerLeu545550555560IlePheLeuSerLeuTrpAlaValIlePheValLeuTyrGln565570<210>2<211>553<212>PRT<213>智人<400>2MetCysProArgAlaAlaArgAlaProAlaThrLeuLeuLeuAlaLeu151015GlyAlaValLeuTrpProAlaAlaGlyAlaTrpGluLeuThrIleLeu202530HisThrAsnAspValHisSerArgLeuGluGlnThrSerGluAspSer354045SerLysCysValAsnAlaSerArgCysMetGlyGlyValAlaArgLeu505560PheThrLysValGlnGlnIleArgArgAlaGluProAsnValLeuLeu65707580LeuAspAlaGlyAspGlnTyrGlnGlyThrIleTrpPheThrValTyr859095LysGlyAlaGluValAlaHisPheMetAsnAlaLeuArgTyrAspAla100105110MetAlaLeuGlyAsnHisGluPheAspAsnGlyValGluGlyLeuIle115120125GluProLeuLeuLysGluAlaLysPheProIleLeuSerAlaAsnIle130135140LysAlaLysGlyProLeuAlaSerGlnIleSerGlyLeuTyrLeuPro145150155160TyrLysValLeuProValGlyAspGluValValGlyIleValGlyTyr165170175ThrSerLysGluThrProPheLeuSerAsnProGlyThrAsnLeuVal180185190PheGluAspGluIleThrAlaLeuGlnProGluValAspLysLeuLys195200205ThrLeuAsnValAsnLysIleIleAlaLeuGlyHisSerGlyPheGlu210215220MetAspLysLeuIleAlaGlnLysValArgGlyValAspValValVal225230235240GlyGlyHisSerAsnThrPheLeuTyrThrGlyAsnProProSerLys245250255GluValProAlaGlyLysTyrProPheIleValThrSerAspAspGly260265270ArgLysValProValValGlnAlaTyrAlaPheGlyLysTyrLeuGly275280285TyrLeuLysIleGluPheAspGluArgGlyAsnValIleSerSerHis290295300GlyAsnProIleLeuLeuAsnSerSerIleProGluAspProSerIle305310315320LysAlaAspIleAsnLysTrpArgIleLysLeuAspAsnTyrSerThr325330335GlnGluLeuGlyLysThrIleValTyrLeuAspGlySerSerGlnSer340345350CysArgPheArgGluCysAsnMetGlyAsnLeuIleCysAspAlaMet355360365IleAsnAsnAsnLeuArgHisThrAspGluMetPheTrpAsnHisVal370375380SerMetCysIleLeuAsnGlyGlyGlyIleArgSerProIleAspGlu385390395400ArgAsnAsnGlyThrIleThrTrpGluAsnLeuAlaAlaValLeuPro405410415PheGlyGlyThrPheAspLeuValGlnLeuLysGlySerThrLeuLys420425430LysAlaPheGluHisSerValHisArgTyrGlyGlnSerThrGlyGlu435440445PheLeuGlnValGlyGlyIleHisValValTyrAspLeuSerArgLys450455460ProGlyAspArgValValLysLeuAspValLeuCysThrLysCysArg465470475480ValProSerTyrAspProLeuLysMetAspGluValTyrLysValIle485490495LeuProAsnPheLeuAlaAsnGlyGlyAspGlyPheGlnMetIleLys500505510AspGluLeuLeuArgHisAspSerGlyAspGlnAspIleAsnValVal515520525SerThrTyrIleSerLysMetLysValIleTyrProAlaValGluGly530535540ArgIleLysHisHisHisHisHisHis545550<210>3<211>120<212>PRT<213>小家鼠<400>3GluIleGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrAlaPheThrSerTyr202530AsnMetTyrTrpValLysGlnSerHisGlyLysSerLeuGluTrpIle354045GlyTyrIleAspProTyrAsnGlyGlyThrSerTyrAsnGlnLysPhe505560LysGlyLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetHisLeuAsnSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGlyTyrGlyAsnTyrLysAlaTrpPheAlaTyrTrpGlyGln100105110GlyThrLeuValThrValSerAla115120<210>4<211>106<212>PRT<213>小家鼠<400>4AspAlaValMetThrGlnThrProLysPheLeuLeuValSerAlaGly151015AspArgValThrIleThrCysLysAlaSerGlnSerValThrAsnAsp202530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