莫哈韦芽孢杆菌的生产方法与流程

本发明涉及莫哈韦芽孢杆菌的生产方法，尤其涉及用于提高莫哈韦芽孢杆菌的生产率的方法，更详细地涉及高温培养莫哈韦芽孢杆菌，来增加菌株的活性芽胞数的生产率，从而可大量提供莫哈韦芽孢杆菌的方法。
背景技术：
：莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)作为1994年在莫哈维沙漠最初分离鉴定的菌株，证明为与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilis)类似的菌株(InternationalJournalofsystematicBacteriologyVol.44,p256-264)。据论文报告，1996年，莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)生存为植物体内生物，并具有抗霉菌作用(EnvironmentalHealthPerspectives,Vol.109,p325-332)。并且，Bacon，C.W.等，1996年证明为莫哈韦芽孢杆菌作用为减少植物体内积累霉菌毒素(mycotoxin)的植物内生物(CanadianJournalBotany,Vol.74,p1195～1202)，在2002年证明为可促进植物生长，并生存为植物内生物(BiologicalControl,Vol.23,p274～284)，在2007年报告，在接种禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)的植物中，莫哈韦芽孢杆菌起到抑制作用，从而正常进行植物的生长(BiocontrolScienceandTechnology,Vol.17,p81～94)。最近，发表结果称作为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)生产的第二代谢产物的cyclolipopeptied具有抗菌性物质(J.Agric.Food.Chem.,2009,Vol.57,p4287～4292)。并且，最近，本发明人等曾发表促进植物生长的作用相关结果(JournalofLifeScience2014Vol.24.No.12.1308～1315)。并且，本发明人在韩国专利局曾登录具有抗菌活性及抗真菌活性的新的菌株莫哈韦芽孢杆菌KJS-3的专利(韩国特许登录10-1074878，2011年10月12日)。并且，根据韩国特许登录(10-0380626)，可通过脱氧核糖核酸促旋酶类型A(DNAgyrasetypeA)的基因分析，与萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtillissubsp.Subtillis)、芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubstilissubsp.Spizizenii)等有效区分。另一方面，作为微生物发酵的问题，由于长时间进行培养操作，杂菌污染的危险性大，且菌株有可能变异或退化，由于反应速度比化学反应慢，因而利益不大，生产物的浓度低，分离生产物时使用的费用高，从而在莫哈韦芽孢杆菌的培养方面，也需要解决上述问题。现有技术文献专利文献非专利文献非专利文献0001：InternationalJournalofsystematicBacteriologyVol.44,256-264页非专利文献0002：EnvironmentalHealthPerspectives,Vol.109,325～332页非专利文献0003：CanadianJournalBotany,Vol.74,1195～1202页非专利文献0004：BiologicalControl,Vol.23,274～284页非专利文献0005：BiocontrolScienceandTechnology,Vol.17,81～94页非专利文献0006：J.Agric.Food.Chem.,2009,Vol.57,4287～4292页技术实现要素：本发明用于解决如上所述的现有问题，其目的如下。本发明的目的在于，提供莫哈韦芽孢杆菌的高温培养方法，来增加菌株的培养数，并使活性芽胞数维持高浓度，从而划时代地增加生产率。并且，本发明的目的在于，缩短莫哈韦芽孢杆菌的培养时间，来防止污染可能性和长时间培养导致的菌株的变异，从而提高其经济价值。用于达成上述目的的本发明通过以下解决方法来实现。本发明的莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)的生产方法的特征在于，其包括：在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，TryticSoyBroth)培养基中振荡培养莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)来进行种子培养的步骤；将进行了种子培养的上述莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株接种于工业用培养基的步骤；以及在37℃～48℃温度下，将接种的上述莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株的pH调节为6.8～7.2，并在好氧条件下进行培养的步骤。本发明的特征在于，上述工业用培养基包含1～5重量份的玉米淀粉、l～3重量份的酵母提取物、0.05～0.5重量份的磷酸一钾、0.05～0.5重量份的磷酸二钾、0.05～0.5重量份的二水氯化钙、0.01～0.1重量份的氯化钠、0.01～0.1重量份的七水硫酸镁、0.001～0.01重量份的一水硫酸锰及0.01～0.1重量份的二水氯化钙，并且，上述温度优选为45℃。本发明的特征在于，在上述工业用培养基中，作为抑制莫哈韦芽孢 杆菌(Bacillusmojavensis)的生长的因子还放入葡萄糖、磷酸、镁、锰、钙及硅。本发明根据上述的本结构具有如下效果。本发明提供莫哈韦芽孢杆菌的高温培养方法，增加菌株的培养数，并使活性芽胞数维持高浓度，从而划时代地提高生产率，并且，缩短莫哈韦芽孢杆菌的培养时间，来防止污染可能性和长时间培养导致的菌株的变异，从而提高其经济价值。附图说明图1为表示对莫哈韦芽孢杆菌生长的硅(Si4+)及磷酸(PO42+)的影响的图表。图2为表示对莫哈韦芽孢杆菌生长的Mn2+的影响的图表。图3为表示对莫哈韦芽孢杆菌生长的铝(Al3+)、钙(Ca2+)、镁(Mg2+)的影响的图表。具体实施方式至今，本发明的莫哈韦芽孢杆菌未试图通过高温培养法来进行培养。但是，本发明人发现通过高温培养莫哈韦芽孢杆菌，增加菌株的培养数，并使活性芽胞数维持高浓度，因而划时代地增加生产率。并且，由于缩短培养时间，可防止污染可能性和长时间培养导致的菌株的变异，从而经济价值高。即，本发明中，分别在37℃、40℃、42℃、45℃、50℃温度中进行培养，并比较了不同温度中的结果，确认了微生物在45℃高温中，莫哈韦芽孢杆菌的生长速度最快。并且，微生物发酵的问题如下：因长时间进行培养操作，杂菌污染的危险性大，有可能发生菌株的变异或退化，与化学反应相比，反应速度慢，从而利益不高，由于生产物的浓度低，分离生产物的费用高等，且莫哈韦芽孢杆菌可进行高温发酵，因而污染菌不能在高温条件下生 长，从而降低污染的可能性，在高温中，菌快速生长，从而缩短培养时间，从而可减少污染的可能性。用于本发明的莫哈韦芽孢杆菌的高温培养的培养基可使用碳源、无机氮源、有机氮源、有机营养源、含有少量无机物的天然及合成培养基中的一种。此时，可利用甘油(glycerol)、树胶醛醣(Arabinose)、核糖(Ribose)、木糖(Xylose)、葡萄糖(glucose)、果糖(Fructose)、甘露糖(Mannose)、糖原(Glycogen)，淀粉(starch)、甘蔗液、糖萝卜液等作为碳源，可利用蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵、玉米浆、大豆粕、大豆粉等作为氮源。另一方面，确认到莫哈韦芽孢杆菌在45℃温度下生长速度最快，因添加矿物质而暴增。即，莫哈韦芽孢杆菌在高温培养法中具有作为可增加莫哈韦芽孢杆菌生长的生长因子，只要存在钙、锰、镁、铝、硅、葡萄糖就暴增的特征。具体观察本发明的莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)的生产方法，本发明的特征在于，其包括：在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，TryticSoyBroth)培养基中振荡培养莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)来进行种子培养的步骤；将进行了种子培养的上述莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株接种于工业用培养基的步骤；以及在37℃～48℃温度下，将接种的上述莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株的pH调节为6.8～7.2，并在好氧条件下进行培养的步骤。本发明的特征在于，上述工业用培养基包含1～5重量份的玉米淀粉、l～3重量份的酵母提取物(Saccharomycescerevisiaeextract)、0.05～0.5重量份的磷酸一钾、0.05～0.5重量份的磷酸二钾、0.05～0.5重量份的二水氯化钙、0.01～0.1重量份的氯化钠、0.01～0.1重量份的七水硫酸镁、0.001～0.01重量份的一水硫酸锰及0.01～0.1重量份的二水氯化钙，并且，上述温度优选为45℃。本发明的特征在于，在上述工业用培养基中，作为抑制莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)的生长的因子还放入葡萄糖、磷酸、镁、锰、钙及硅。以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明不局限于这些实施例。本发明中使用的莫哈韦芽孢杆菌通过在真空安瓿中保管以内生孢子(endospore)形态进行冻结干燥的菌体的方法室温保管后使用，在一个月以内的短期内使用的情况下，通过冷藏保管使用了在胰酶大豆琼脂(TryticSoyAgar；DifcoLaboratories，detroit，USA)固体培养基中培养的。在固体培养基中采集菌落来在胰蛋白酶大豆肉汤培养基中进行预培养，并使用自动发酵机接种预培养的培养物来实施本发酵。实施例1在含有营养培养基(NB，NutrientBroth)的500ml的三角烧瓶(baffledflask)中接种一铂环量(oneloopful)的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)，并在25℃温度下，以200rpm的搅拌速度振荡培养48小时来测定了吸光度。并且，采集培养液的一部分，并使用光学显微镜来观察了孢子状态。在各三角烧瓶(Baffledflask)中添加矿物质来比较生长速度。分别添加0.001％、0.005％、0.01％的硅(Si4+)，来观察了因硅而产生的影响。并且，分别添加0.01％、0.05％、0.1％的磷酸(PO42+)来观察了对生长速度的影响(参照图1)。并且，分别添加0.001％、0.005％、0.01％的Mn2+来观察了结果(参照图2)。在铝(Al3+)、钙(Ca2+)、镁(Mg2+)的情况下，24小时和48小时的差异不大，且浓度的影响也不大(参照图3)。在除了营养培养基之外的所有培养液中进行实验的所有情况下，经过24小时后，形成了80％以上的内生孢子(Endospore)，经过48小时后，形成了90％以上的内生孢子。尤其，在0.01％的硅、0.01％的磷酸、钙的所有浓度中形成了99％的内生孢子。如图1和图2所示，即使添加硅，在0.001％、0.005％、0.01％中也没有大的差异，但在0.01％的硅浓度条件下进行48小时培养时表示高的光密度(O.D)。在磷酸的情况下，也具有类似的倾向，但在0.01％进行48小时时相对高。在锰(Mn)的情况下，在0.05％以上进行48小时培养时均高。因此，得知在培养过程中钙、磷酸、锰、镁均重要。作为去除泡沫的消泡剂使用硅衍生物，因而不额外使用硅作为添加剂。实施例2根据实施例1实施了自动发酵。在含有胰蛋白酶大豆肉汤培养基的500ml的三角烧瓶(baffledflask)中接种一铂环量(oneloopful)的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)，并在37℃温度下，以150rpm的搅拌速度振荡培养16小时来实施了种子培养。将种子培养夜移到本培养液(7l发酵槽，Biotron，Korea)中，并以约2％的容量接种在本培养中。在7l的发酵槽中放入3000ml的培养基来进行基本培养，基本培养基的组成成分为包含1.5重量百分比的玉米淀粉、l重量百分比的酵母提取物、作为微量成分的0.1重量百分比的磷酸一钾、0.1重量百分比的磷酸二钾、0.05重量百分比的氯化钠、0.05重量百分比的七水硫酸镁、0.005重量百分比的一水硫酸锰、0.05重量百分比的二水氯化钙的液体培养基，在液体生产中接种2％的上述种子培养液，在37～48℃温度下将pH调节为7.0±1，并将通气量维持为1.0vvm。维持150rpm的旋转搅拌速度，并在好氧性条件下进行了培养。在600nm中使用紫外分光光度计(UVspectrophotometer)来测定 了吸光度。在浓度高的情况下，用胰蛋白酶大豆肉汤培养基稀释后进行了测定。使用显微镜一边观察是否生成内生孢子一边进行培养，在80℃温度下热处理各个培养液2小时来使营养细胞凋亡，并用无菌的稀释液(NaCl5g/l，蛋白胨(peptone)10g/l)连续稀释后，将0.1ml分株到培养皿中，并薄薄地铺开后，干燥表面，之后，在37℃温度下培养16小时，并计算了活性芽胞数。各不同温度的结果如下列表。表137℃40℃42℃45℃48℃在24小时内10-20％50-80％99％99％99％在24小时内50％-60％99％99％99％99％内生孢子数(cfu)5×1081×1092-3×1093-4×1093×108如表1所示，可知在45℃温度下结果最优秀。可知发酵时间短、内生孢子的生成率高、菌数也高。尤其，在这种温度下，基本没有杂菌的污染，这种温度视为商业上非常有用的发酵温度。实施例3实施了大容量发酵。用实施例2的培养培养基组成成分、相同的条件的5000升的发酵槽，利用了2000升的内容量。发酵利用了韩国釜山的机张的釜山海洋生物培养中心的发酵槽。在45℃温度、pH为7.0、通气量为1vvm的条件下进行了实施。利用1升的容量的第二培养液来发酵种子培养液，并培养16小时后，将第二培养液移到5升的培养机的2升的培养液来进行了第三次培养。将第三培养液接种在30升的自动培养机的15升的培养液中来培养16小时，并将其接种于本培养发酵机中来进行了培养。培养72小时，并用显微镜进行观察，最终确认到易形成内生孢子，在80℃温度下，热处理各培养液2小时来使营养细胞凋亡，并使用无菌的稀释液(NaCl5g/L，蛋白胨10g/L)连续稀释后，将0.1ml分株到培养皿中，并薄薄地铺开后，干燥表面，之后，在37℃温度下培 养16小时，并计算了活性芽胞数。离心分离内生孢子来收回了培养液。每1ml的培养液的内生孢子数为3.2×109cfu/ml。冻结干燥了离心分离内生孢子来回收的培养液，并生产了8.7×1011cfu/g的内生孢子。实施例4在胰蛋白酶大豆肉汤培养基中接种种子培养液，在37℃温度下，以140rpm的搅拌速度培养4小时来测定了吸光度。准备5个三角烧瓶，并调节各pH(酸碱度)来实施了发酵。酸碱度2、酸碱度3、酸碱度4.5中，菌株不生长。但是，酸碱度6和酸碱度7.5中，菌株易生长。在这种生长条件下生长后测定了酸碱度，酸碱度维持了中性(参照表2)。这意味着在不调节酸碱度的条件下，莫哈韦芽孢杆菌菌株可生长，且即使生长，也维持中性状态。表2pH234.567.4光密度0.1130.05360.0590.5470.614(在胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSBmedium)中，在37℃温度下以140rpm的速度培养4小时，最终通过紫外可见分光光度计(U.V/VIS)将光密度检查为600nm)即使将莫哈韦芽孢杆菌多使用于植物等，也生长，而不酸化，因而具有大的优点。即，即使多使用，也对植物无害，因而具有大的优点。保藏编号分类命名：莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)保藏单位名称：韩国微生物保存中心(国外)保藏单位地址：韩国首尔市西大门区弘济1洞柳林B/D361-221保藏编号：KCCM10961P保藏日期：20080822当前第1页1 2 3