一种侵入型乳酸菌及其制备方法与流程

文档序号：12097471阅读：514来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种侵入型乳酸菌、侵入型乳酸菌重组质粒pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG及其它们的制备方法。

背景技术：

乳酸菌是一类革兰氏阳性的食品级细菌，其中嗜酸乳杆菌主要存在小肠中，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起拮抗作用的抗菌素，如嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等。其在厌氧琼脂平板上35℃培养48 h，形成较小(直径约0.5 mm)、网形、凸起、表面粗糙、边缘卷曲的菌落。可调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拮抗作用。同时，该菌株也是良好的外源蛋白运载系统，能够在体内和体外传递质粒。其本身可作为DNA疫苗载体，但是没有侵入能力，因此递送DNA的能力不强；而一些弱致病菌如减毒沙门氏菌由于其可侵入到细胞中，可以更好的递送DNA，因此可模拟病原菌的侵入过程，以构建侵入型重组乳酸菌，使其具有更好的递送能力。

沙门氏菌能够通过Ⅲ型分泌系统逃避非吞噬细胞诱导一种触发的侵入过程。rck基因是一个编码跨膜蛋白的毒力基因,在沙门菌中首次被发现于鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的毒力质粒上。该基因能促进宿主菌的粘附和侵袭力,并能增加抵抗血清杀菌的能力,与细菌的胞外介质的形成密切相关(Arrecubieta C, et al.,2011)。Rck是由细菌的大毒力质粒上的rck基因编码的一个19-kDa的外膜蛋白（Siddiqui FJ, et al.,2011）。除了粘附力和侵入能力以外，Rck对补体的细菌活性也进行了更高的抵抗，通过抑制细菌膜上的补体成分C9的聚合，不依赖于脂多糖的结构（Taylor PW. 2009）。Mature rck (mRck) 是成熟的Rck，与Rck相比少了24个氨基酸，这些氨基酸能够分泌信号肽，具有锚定功能。

聚-γ- 谷氨酸合成酶A（Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A ，pgsA ）是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）多聚谷氨酸合成酶系统PGA 的组成蛋白，它可以作为一种细菌表面展示元件将该酶系统稳定地锚定在细胞壁表面。但由于pgsA 基因较长（1143bp ），使质粒载体承载外源基因的能力受到一定的影响，根据pgsA 蛋白的特性，可获取截短基因pgsA’(563bp)，并研究截短的锚定蛋白在Lb. plantarum 的表面展示能力。

本发明旨在通过构建展示在嗜酸乳杆菌表面的一种侵入型重组融合蛋白，获得具有细胞侵入能力的乳杆菌载体，为今后以其作为口服DNA疫苗载体奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是为了食品级乳酸菌能侵入细胞内，应用于口服DNA疫苗载体，而提供一种侵入型乳酸重组质粒pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG及侵入型乳酸菌。

一种融合基因pgsA^，-mRck-FLAG，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；

所述的pgsA^，-mRck-FLAG为人工合成。

侵入型乳酸重组质粒pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG，是载体pW425et中插入了如序列表SEQ ID NO.4所示的基因。

一种侵入型乳酸菌，它是转染了侵入型乳酸重组质粒pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG的乳酸菌；

所述的乳酸菌为嗜酸乳杆菌；

所述的嗜酸乳杆菌CICC6075株或植物乳杆菌NC8株。

本发明提供了一种融合基因pgsA^，-mRck-FLAG，其中mRck-FLAG来源于鼠伤寒沙门氏菌χ3761，将pgsA^，-mRck-FLAG插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒载体 pW425et中，获得了侵入型乳酸重组质粒pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG，将其转染至嗜酸乳杆菌中，获得了一种侵入型乳酸菌，侵入性实验表明，一种侵入型乳酸菌成功地侵入了RAW细胞，为今后以重组的侵入型乳酸菌作为口服DNA疫苗的细胞载体奠定基础。

附图说明

图1 Rck基因的PCR结果电泳图（M：DL2000 marker；1:Rck-FLAG基因的PCR扩增结果）；

图2 mRck基因的PCR结果电泳图（M：DL2000 marker；1:mRck-FLAG基因的PCR扩增结果）；

图3 Rck-FLAG及mRck-FLAG基因的酶切纯化结果电泳图（M：DL2000 marker；1： Rck-FLAG基因的酶切纯化结果；2：mRck-FLAG基因的酶切纯化结果）；

图4 pgsA’基因的PCR结果电泳图（M：DL2000 marker；1：pgsA’基因酶切回收产物）；

图5 pW425et-Rck-FLAG 重组质粒的酶切鉴定结果电泳图（M1：λ-HindIII marker；M2：DL5000 marker；1，2：pW425et-Rck-FLAG 重组质粒的酶切鉴定结果）；

图6 pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG重组质粒的酶切鉴定结果电泳图（M：DL5000 marker；1，2：pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG 重组质粒的酶切鉴定结果）；

图7 pW425et-Rck-FLAG的 Western-blot检测结果（M：低分子量的蛋白质marker；1：空载体对照；2：pW425et-Rck-FLAG）；

图8 pW425et-pgsA’-mRck-FLAG 的Western-blot检测结果（M：低分子量的蛋白质marker；1：空载体对照；2，3：pW425et-pgsA’-mRck-FLAG）。

具体实施方式

实施例1 目的基因pgsA’、Rck-FLAG和mRck-FLAG的PCR扩增

1.主要实验材料及分子生物学试剂

(1)菌株及质粒载体

大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒载体 pW425et，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) CICC6075、植物乳杆菌NC8株，鼠伤寒沙门氏菌χ3761均由本实验室保藏。

(2)主要材料及试剂

细菌基因组提取试剂盒，普通质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自OMEGA公司；高保真PCR聚合酶，限制性内切酶，T4DNA连接酶，DL2000 marker、DL5000 marker、λ-hind III marker，4×SDS buffer由宝生物（Takara）公司提供；氨苄青霉素和红霉素均为Amresco公司分装；CloneJET PCR Cloning Kit购自Thermo公司；电转杯由Bio-Rad公司提供；硝酸纤维素膜(NC膜)购自Whatman公司；Anti-FLAG抗体（兔源）购自SIGMA公司；HRP标记的山羊抗兔的抗体购自鼎国公司；低分子量蛋白质标准购自上海生工生物工程有限公司；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

2.目的基因pgsA’、Rck-FLAG和mRck-FLAG的PCR扩增

(1)引物的设计与合成

pgsA’基因的引物：

pgsA’ F-NcoI：cgCCATGGGCAAGAAAGAATTAAGTT

pgsA’ R-XbaI：gcTCTAGACACTTTCTGGTAACTAATTTTCTTC

Rck-FLAG基因的引物：

rck-F1-NcoI：ataCCATGGCGatgaaaaaaatcgttctgtc

rck-R1-FLAG-HindIII：tgcAAGCTTtca GACTACAAAGATGACGATGACAAAgaaccggtaaccgacaccaac

mRck-FLAG基因的引物：

mrck-F1-pgsA’-XbaI：cagTCTAGAgacacccattccgtgtcggt

mrck-R1-FLAG-HindIII：tgcAAGCTTtcaGACTACAAAGATGACGATGACAAAgaaccggtaaccgacaccaac ，

其中下标线的碱基为FLAG标签序列。

(2)目的基因的PCR扩增与克隆

1) Rck及mRck基因的扩增

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

c. PCR结果电泳图如图1、图2所示。

d. PCR产物的回收与纯化

采用DNA凝胶回收试剂盒对两个PCR产物进行胶回收，并分别以NcoI/HindIII以及XbaI/HindIII双酶切，37℃水浴锅中酶切2h，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图如图3所示。

或人工合成Rck（其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示）及mRck基因（其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示）。并以其为模板重复上述方法扩增。

2) pgsA’基因的扩增

pgsA序列（GenBank：AB016245.1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，

PCR反应体系：

PCR反应程序：

对pgsA’基因的PCR产物回收后以NcoI/XbaI进行双酶切并进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。pgsA’ 其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

实施例2 酶切后的目的基因与表达载体连接

1. pW425et载体的双酶切

a. 酶切体系如下，37℃水浴锅中酶切2h：

b.采用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，pgsA’基因的PCR结果见图4。

2.构建pW425et-Rck-FLAG 和pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG重组质粒

a. 目的基因与pW425et连接体系如下：

连接仪上16℃连接过夜，次日转化到E.coli TOP10化学感受态细胞，铺LB/Em(20μg/ml)平板，37℃培养过夜至单克隆形成。每个平板上随机挑取2个克隆，分别加入5mL LB液体培养液（50μl Em），放入摇床中，37℃，180rpm 10-12h，采用OMEGA质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取重组质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃水浴锅中酶切2h，将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳图如图5、图6所示。Rck -FLAG基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，mRck -FLAG基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示，pgsA^，-mRck-FLAG基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示

实施例3 将重组质粒电转化到嗜酸乳杆菌中

(1) 分别取 5μl 重组质粒pW425et-Rck-FLAG 和pW425et-pgsA^，-mRck-FLAG依次加入两管冰浴的 100μl 嗜酸乳杆菌感受态中，轻缓混匀，移入提前预冷的 0.2 cm 间距的电击杯内，静置冰浴 5min 后，放入电转化仪(2.5kV，6ms)中进行电击；

(2) 电转化结束后，立即静置冰浴 5min，取电击杯内液体加入到 800μl 30℃预热的MRS 培养液(含 0.5mol/L 蔗糖)中，30℃厌氧条件下培养 3h；

(3) 将含 Em(20mg/ml)的 MRS 固体培养基上均匀涂布 100μl 上述菌液，30℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，约 18-24h。

实施例4 重组乳酸菌的Western-blot 检测

1.重组乳酸菌的蛋白样处理

采用超声破碎法：

将-80℃冻存的重组乳酸菌进行传代，将第二代的重组菌取出500μl加入到30mL的MRS液体培养基（15μl的Em）中，30℃温箱中厌氧培养3h，诱导过夜，4℃，5000rpm离心10min，弃上清，加入20μl的PBS混匀，使用超声破碎仪进行超声破碎10min，4℃，5000rpm离心10min，弃上清，使用1mL的PBS混悬，离心，沉淀即为菌体蛋白，加入150μl的ddH₂O与4×SDS buffer 进行混匀，100℃煮沸10min，4℃，12000rpm离心1min，上清备用。

2.SDS-PAGE的配置

a.12%分离胶(3mL):分别取30%丙烯酰胺溶液1.20mL、双蒸水0.99mL、1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8) 0.75mL、10%SDS 溶液 30μl、10%过硫酸铵 30μl、TEMED 3μl,混匀后灌入垂直板。

b.5%浓缩胶(2mL):分别取双蒸水1.35mL、30%丙烯酰胺溶液0.335mL、l.0mol/L Tris-Cl(pH6.7)0.25mL、10%SDS 溶液 20μl、10%过硫酸铵 20μl、TEMED 2.5μl,混匀后,灌入垂直板(待浓缩胶凝固约30min)并插入梳子。

c.待浓缩胶完全凝固(约20min),缓缓取下梳子,取上清,每孔上样15μl,恒压条件下开始电泳,浓缩胶时使用80v,分离胶时使用160v,待溴酚蓝迁移至凝胶底部时,结束电泳。

3.转膜

SDS-PAGE凝胶电泳结束后,将凝胶取出,连同六张转印滤纸和NC膜浸泡在转印缓冲液中30min。以凝胶面积大小为标准,将滤纸和NC膜剪裁整齐,然后在转印缓冲液中排放好,顺序依次为海绵，3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸，海绵，用玻璃棒擀走每层之间产生的气泡,排放好顺序后放入转印夹中,凝胶一侧与负极相连,NC膜一侧与正极相连,恒流200mA转印约1h。

4.封闭

按照TAKARA商品目录配置封闭液，转印完毕后,将NC膜浸没于封闭液中,室温平缓摇动封闭1h。

5.一抗孵育

将购自SIGMA公司的Anti-FLAG抗体（兔源）按照使用说明书使用TBST按1: 1000稀释,将NC膜至于稀释后的抗体中，4℃孵育过夜。然后TBST洗涤3次(每次10min)。

6.二抗孵育

将洗后的NC膜置于HRP标记的山羊抗兔的抗体(使用封闭液按1 : 1000稀释)中,37°C平缓摇动1h,TBST洗涤3次(每次10min)。

7.ECL显色

使用ECL显色试剂盒，将A液与B液按照1:1比例混匀，进行显色获取结果。

8. Western-blot检测结果

a. pW425et-Rck-FLAG在嗜酸乳杆菌中的表达，见图7。

b. pW425et-pgsA’-mRck-FLAG在嗜酸乳杆菌中的表达，见图8。

a和b的Western-blot显示：重组乳酸菌分别在21KD和40KD处可见有一条明显的蛋白印迹带，而作为阴性对照的含空载体的乳杆菌经蛋白印迹分析后无印迹带。说明乳杆菌内表达了Rck-FLAG和mRck-FLAG蛋白，且这两种蛋白都具有反应原性。

实施例5 重组乳酸菌细胞侵入性实验

1.主要试剂及细胞

鼠巨噬细胞系RAW264.7由本实验室保存，培养基DMEM，犊牛血清FBS，双抗，庆大霉素均购自Sigma公司。

2.细胞侵入实验

RAW细胞以DMEM加10%犊牛血清培养，传代后以约2×10⁵细胞/孔接种24孔细胞培养板后，以无抗生素培养基培养过夜；同时将嗜酸乳杆菌（pW425et）, 乳杆菌（pW425et -rck）及乳杆菌（pW425et -pgsA’-mrck）诱导过夜表达后离心收集菌体，按照感染复数（MOI）为1000:1剂量感染细胞，室温离心（1000rpm）10分钟后，将感染细胞继续放置于培养箱中孵育1h。吸取培养基上清后，加入含有20µg/ml的庆大霉素的培养基继续培养2h后，吸弃上清。以PBS洗涤细胞后用0.2% Triton X-100 破碎细胞后，做倍比稀释并以红霉素抗性MRS平板计数侵入的细菌数。

3.细胞侵入实验结果

侵入实验结果显示，与野生型菌株相比，表达rck及mrck的重组菌显著增强了其细胞侵入性。

<110> 吉林农业大学

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<212> DNA

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atgggcaaga aagaattaag tttccacgag aagttattaa aattgactaa acaacaaaaa 60

aagaagacta acaagcatgt gtttattgct attccaattg ttttcgtttt aatgtttgct 120

tttatgtggg caggtaaagc tgagactcca aaagttaaga cttatagtga tgacgttttg 180

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gctggcaatt ttgaaaatcc tgttacttat cagaaaaact acaaacaagc tgataaagag 360

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