大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及来源于大米草(Spartina anglica)的液泡膜焦磷酸酶的一个编码基因SaVP1的序列和应用。

背景技术：

大米草(Spartina anglica)属于禾本科米草属，为多年生湿生草本植物，适宜在海滩中潮带生长。作为一种盐生植物，大米草耐盐能力很强，能够在高达3％-3.5％盐度的海水中正常生长。在沿海滩涂引种后，一旦形成密集草丛，即可抗较大风浪，具有促淤造陆、消浪抗蚀、保护海堤，提高海滩土壤肥力的作用。大米草叶的背腹面均有盐腺，根吸收的盐分可以由此排出体外，显示大米草的耐盐机理不同于双子叶甜土植物拟南芥，也不同于禾本科甜土植物水稻，也不同于真盐生植物。克隆大米草的耐盐相关基因有利于进一步研究大米草独特的耐盐机理和应用基因工程手段改良甜土植物的耐盐能力。

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。全世界约有10亿hm²土地具有不同程度的盐渍化，其中，我国盐渍土地面积超过1亿hm²。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地急剧下降，不合理灌溉、耕作又造成了大量良田的次生盐渍化。如何利用大面积的盐碱地,提高作物耐盐性已经成为生产上迫切需要解决的问题。

在盐胁迫条件下，植物通常通过渗透机制的调节、抗氧化防御系统、拒盐和对离子的选择吸收、代谢途径的改变、离子区隔化等途径耐盐。近年来的研究表明，在诸多途径中，钠离子转运引起离子区隔化在植物耐盐机理中的作用犹为突出。Apse等(1999)从拟南芥克隆到液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(NHX1)，并在拟南芥中过量表达，获得耐1/2海水浇灌的植株，其耐盐能力的提高程度远远高于以往所报道的其它耐盐基因。这表明，通过基因工程将Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因转入植物，加强钠离子区隔化的能力，将可以显著改良植物的耐盐能力。

另外的一些研究指出，质膜和液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其跨膜的Na⁺/H⁺逆向转运与膜上的质子泵是偶联的。液泡膜的H⁺-ATPase和H⁺-PPiase产生跨液泡膜的H⁺电化学势梯度，为Na+/H+逆向转运蛋白提供驱动力，从而进行离子的电化学运输，实现钠离子的区隔化。这说明如果通过相关基因的过量表达增加跨液泡膜的H⁺电化学势梯度，将有利于Na⁺/H⁺逆向转运蛋白将更多的Na⁺转运到液泡内，增强钠离子的区隔化作用，提高耐盐能 力。

从理论上讲，液泡膜H⁺-ATPase和液泡膜H+-PPase这2个H⁺泵中的任何一个过量表达，都有可能提高H⁺的利用率，增大H⁺跨膜梯度。但是，液泡膜H⁺-ATPase是由许多亚基组成的，只有当编码这些亚基的若干个基因都达到超表达的水平时，液泡膜H⁺-ATPase才能实现超表达，就目前的技术水平而言，难以实现。液泡膜H⁺-PPase只由一条受单基因编码的多肽组成，因此，液泡膜H⁺-PPase超量表达就简单多了。

Gaxiola等的研究结果表明，拟南芥液泡膜焦磷酸酶(H⁺-PPase)AVP1基因的过量表达，明显地增加了跨液泡膜的H+电化学势梯度，促进了液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白NHX1的活性，使Na⁺区隔化至液泡中，明显地增强了植物的耐盐、耐旱能力。进一步的研究发现，AVP1基因还能通过改变液泡中的pH值，调控植物体内生长激素的转运，从而促进植物器官顶端的细胞分裂和生长，使植物高产、抗旱、抗土壤瘠薄。随后另外一些学者的研究结果也显示，将H⁺-PPase基因转入烟草、拟南芥、玉米、水稻，转基因植物的耐盐性和耐旱性显著提高。

液泡膜焦磷酸酶可以提供膜内外质子梯度，除了促进Na⁺转运的外，还可能促进其它重金属离子的转运，从而促进重金属离子的累积。液泡中某些溶质的积累，也可以有益于植物抗寒能力的提高。酶水解焦磷酸的活性，有利于植物体内的蔗糖合成代谢，从而促进产量的增加。

因此，构建适当的表达盒，可以将该基因应用于植物耐盐、耐旱、耐寒、高产、重金属离子富集等性状的改良。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种来源于大米草的液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因序列及其应用。该基因在植物耐盐、耐旱、耐寒、高产、重金属离子富集等性状改良上的应用。

本发明的大米草液泡膜焦磷酸酶基因cDNA全长序列由2506个核苷酸组成，该序列具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，其所对应的氨基酸序列如SEQ ID No.3所述。相应的基因命名为SaVP1。SaVP1基因cDNA全长序列中含一个完整的开放阅读框，位置为第192-2195核苷酸，开放阅读框的长度为2004个核苷酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码667个氨基酸。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因，该基因核苷酸全长序列中含有SEQ ID NO.2所示的开放阅读框。

上述的大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。cDNA全长序列由2506个核苷酸组成，cDNA全长序列中含一个完整的开放阅读框，位置为第192-2195核苷酸，开放阅读框的长度为2004个核苷酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

上述的SaVP1基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

用于扩增上述SaVP1基因全长的引物，它包括：(1)用于5’RACE扩增的第一轮巢式RCR引物对UPM和GSP1以及第二轮巢式PCR引物对NUP和GSP2；(2)用于3’RACE扩增的第一轮巢式RCR引物对UPM和GSP3以及第二轮巢式PCR引物对NUP和GSP4；

其中，各引物对的序列如下所示：

所述的UPM为由UPML和UPMS按照1:5的体积比混合后稀释而成，

UPML:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPMS:CTAATACGACTCACTATAGGGC

NUP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

GSP1:CCCATAACAGCACCAGAGCGGAAAGC

GSP2:AAATGCCTTCCCAACACC

GSP3:ATCAGTGACAATGCTGGTGG

GSP4:TGTCAGCAGAGCTGGAGTG

用于克隆上述SaVP1基因的开放阅读框的引物对P3、P4，(SaVP1基因全长是由5‘端、中间段(P3、P4扩的开放阅读框)、3‘端拼接而成，做P3、P4扩增是为了确保开放阅读框的序列的准确性这是核心的部分，而P3、P4引物对是在简并引物扩出来最早的中间序列后与3’、5‘端序列拼接得到的初步的全长序列基础上设计的，实际上是做了核对工作，最后得到了核对过的全长)，所述P3、P4引物对的序列为：

P3：CCATGGACCATGGCGATCTTTGCTGTTGTTATC

P4：GGTCACCTTAGAATAGCTTGAAGAGCAG。

含有上述SaVP1基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

所述的重组表达载体为将上述的SaVP1基因插入到pCAMBIA1301的NcoI和BstEII位点之间得到的重组表达载体pCAMBIA1301-SaVP1。

上述的SaVP1基因在提高植物耐受性上的应用

上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在提高植物耐受性上的应用。

所述的耐受性优选为耐盐性、耐旱性、耐寒性、高产性和重金属离子富集中的至少一 种。

本发明的有益效果：

本发明所述的SaVP1基因应用基因工程手段改良植物的耐逆性尤其是耐盐性效果显著。

附图说明：

图1大米草总RNA的提取与鉴定。

图2大米草SaVP1中间片段PCR扩增结果。

M:分子量标准MarkerIII；1:PCR产物

图3.大米草5’RACE巢式PCR电泳结果。

M:分子量标准DL2000；1:PCR产物

图4.大米草3’RACE巢式PCR电泳结果。

M:分子量标准DL2000；1:PCR产物

图5大米草SaVP1全长的克隆电泳结果。

M:分子量标准DL2000；1:PCR产物

图6大米草SaVP1蛋白二级结构的预测。

Hh:α-螺旋；Ee:β-折叠；Tt:β-转角；Cc:无规则卷曲

图7大米草SaVP1蛋白的疏水性预测。

图8大米草SaVP1蛋白的亲水性预测。

图9大米草SaVP1蛋白的跨膜区域预测(TMpred)。

图10大米草SaVP1蛋白的跨膜区域预测(TMHMM)。

图11大米草SaVP1蛋白信号肽预测(神经网络法)。

图12大米草SaVP1蛋白信号肽预测(马科夫模型)。

图13植物表达载体pCAMBIA1301-SaVP1的构建。

图14pCAMBIA1301-SaVP1酶切分析。

M:DL2000；1:pCAMBIA1301；2:pCAMBIA1301NcoI/BstEII双酶切；3:pMD18-T-SaVP1；4:pMD18-T-SaVP1NcoI/BstEII双酶切

图15阳性克隆的PCR检测。

M:分子量标准DL2000；1-3:阳性克隆

图16烟草转化。

A:愈伤组织B:分化的愈伤组织C:再生植株

图17转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA的提取。

M：DNA分子量标准；1-10：烟草DNA

图18转基因烟草的PCR检测。

M：DNA分子量标准；CK+：阳性对照；CK－：阴性对照；1-8：转基因烟草

图19NaCl胁迫14天后的转基因烟草和野生型烟草。

具体实施方式

实施例1大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因序列的获得和耐盐性鉴定

1.材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1植物材料

大米草(Spartina anglica)采自江苏启东海边，野生型烟草，温室中培养。

1.1.2菌株和质粒

大肠杆菌(Escheriachia coli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、植物表达载体pCAMBIA1301由本实验室保存。以上均是常规菌株质粒，也可以通过购买获得。

1.1.3试剂

BU-SuperScript RT KIT、IPTG和X-Gal购自Biouniquer；pMD^TM18-T Vector购自TaKaRa；限制性内切酶NcoI和BstEII，T4DNA连接酶，Phusion High-Fidelity DNA Polymerase购自NEB(北京)有限公司；胶回收试剂盒，Marker购自北京天根生化；RNA提取试剂盒，加A反应液购自盖宁生物科技(北京)有限公司。

1.1.4引物

根据液泡膜H⁺-PPase基因的保守序列设计一对简并引物：

P1:NAGRAARGGTGTYGGVAAG

P2:GAGAACCARTANGGRAGC

RACE的接头引物：

UPML:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPMS:CTAATACGACTCACTATAGGGC

NUP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPM为16μl UPML和80μl UPMS用无菌去离子水定容到400μl配制而成。

SMART:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG

3-CDS:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀V N

(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)

5-CDS:(T)₂₅V N

(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)

大米草SaVP1基因5’端巢式PCR特异性引物为：

GSP1:CCCATAACAGCACCAGAGCGGAAAGC

GSP2:AAATGCCTTCCCAACACC

大米草SaVP1基因3’端巢式PCR特异性引物为：

GSP3:ATCAGTGACAATGCTGGTGG

GSP4:TGTCAGCAGAGCTGGAGTG

大米草SaVP1基因开放阅读框克隆引物为：

P3：CCATGGACCATGGCGATCTTTGCTGTTGTTATC

P4：GGTCACCTTAGAATAGCTTGAAGAGCAG

大米草pCAMBIA1301-SaVP1重组体检测引物：

SaVP1P1:AAGATTCAAATAGAGGACCTAACAG

SaVP1P2:GATAAATGCTTTCCCAACACC

以上引物均由有南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.5培养基

1)LB培养基

2)MS₀：MS+蔗糖(30g/L)pH＝5.8

MS₁：MS+蔗糖(30g/L)+琼脂(5.2g/L)pH＝5.8

MS₂：MS+蔗糖(30g/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+琼脂(5.2g/L)+Hyg(20mg/L)+Amp(500mg/L)pH＝5.8

MS₃：1/2MS+蔗糖(15g/L)+NAA(0.2mg/L)+琼脂(2.6g/L)+Amp(250mg/L)pH＝5.8

1.2试验方法

1.2.1大米草RNA的提取及RNA质量检测

依据天根公司的RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒的提取大米草的RNA。具体方法如下：

1)匀浆处理。采取大米草叶片50～100mg，用液氮研磨成细粉，加入1ml裂解液RL。

2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3)每1ml RL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

4)于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分为三层：下层有机相，中间层和上层无色的 水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

5)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。

6)12000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

7)加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。

8)加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心45秒，弃掉废液。

9)加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心45秒，弃掉废液。

10)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μlRNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外再加30μlRNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。

12)将得到的RNA溶液于-70℃冰箱保存。

吸取5μlRNA溶液使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测大米草的RNA质量。

1.2.2大米草SaVP1基因片段的获得

1.2.2.1第一条链的合成

参照BU-SuperScript RT KIT合成第一条链。

1)

混匀，短暂离心。

Total RNA:12μl

混匀，短暂离心。

2)热循环程序

30℃，10分钟，

42℃，60分钟，

99℃，5分钟，

4℃，5分钟。

3)-20℃保存。

1.2.2.2RT-PCR

PCR反应体系：

PCR反应程序：

98℃1min

98℃ 20s，40℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

于2％的琼脂糖凝胶上电泳检测并回收。

1.2.2.3胶回收

1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称其重量。

2)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；当回收的目的片段<150bp或琼脂糖凝胶浓度>2％时，建议使用6倍体积溶胶液PN(如凝胶重为0.1g，其体积视为100μl，依次类推)。50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新放入收集管中。

4)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。将离心吸附 柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

6)将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μl洗脱缓冲液EB，(如果回收的目的片段>4kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热)，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

7)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。

1.2.2.4纯化后的平末端DNA片段3’末端加A

在一个0.2ml的RNase-free的离心管中加入以下试剂：

反应条件：72℃保温1～1.5小时。

1.2.2.5连接pMD18-T载体

pMD18-T载体的反应体系为：

1)在微量离心管中加入下列溶液，全量为5μl。

pMD^TM18-Vector: 0.5μl

Insert DNA: 4.5μl

2)加入5μl Solution I。

3)16℃反应过夜(12-16小时)。

1.2.2.6CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞

1)挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接种于50ml LB培养基中，37℃摇菌过夜。

2)吸取200μl菌液，接种于50mL LB培养基中摇菌3小时左右，经常观察菌液的生长状，至OD₆₀₀约为0.3左右。

3)将菌液倒入一个1ml的无菌离心管中，置于冰上冷却10分钟。

4)4℃，4000rpm离心10分钟。

5)倒出培养液，将管倒置1min加入1ml冰预冷的0.1M的CaCl₂溶液轻轻地重悬菌体，冰上放置30分钟。

6)4℃，4000rpm离心10分钟。

7)小心倒掉上清，加入100μl冰预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻的重悬。

8)可以立即使用，也可加入1/4体积的无菌甘油，液氮冷萃，放入-70℃，保存备用。

1.2.2.7大肠杆菌感受态的转化和阳性克隆的检测

大肠杆菌感受态的转化过程：

1)全量的连接产物(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

2)42℃热激90秒后，冰浴3-5分钟。

3)向离心管中加入800μl的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时。

4)取400μl LB液体培养基涂布在含有4μL IPTG(200mg/ml)、16μLX-Gal(50mg/ml)和Amp(50mg/ml)的LB固体培养基上，37℃，过夜培养。

5)挑选白色菌落，加入到含有Amp(50mg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

6)使用PCR法检测阳性克隆。

PCR法检测阳性克隆的体系：

PCR反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，40℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，选择阳性克隆子送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

1.2.3大米草SaVP1基因全长的扩增

1.2.3.1第一条链的合成

5'-RACE-Ready cDNA

1)在一个0.2ml的RNase-free的离心管中加入以下试剂：

混匀，短暂离心。

Total RNA:11μl

混匀，短暂离心。

2)热循环程序

30℃，10分钟，

42℃，60分钟，

99℃，5分钟，

4℃，5分钟。

3)-20℃保存。

3'-RACE-Ready cDNA

1)在一个0.2ml的RNase-free的离心管中加入以下试剂：

混匀，短暂离心。

Total RNA:12μl

混匀，短暂离心。

2)热循环程序

30℃，10分钟，

42℃，60分钟，

99℃，5分钟，

4℃，5分钟。

3)-20℃保存。

1.2.3.2 3'RACE

巢式PCR第一轮反应体系：

巢式PCR第一轮反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，60℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

采用热启动，以减少非特异性扩增。从第一轮的反应液中吸取1μl作为巢式PCR第二轮反应的模板。

巢式PCR第二轮反应体系：

巢式PCR第二轮反应程序：

98℃1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

同样采用热启动，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收并纯化目的片段，将目的片段与pMD18-T载体连接，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.3.3 5'RACE

巢式PCR第一轮反应体系：

巢式PCR第一轮反应程序：

94℃5min

5cycles:

94℃ 30s

72℃ 3min

5cycles:

94℃ 30s

70℃ 30s

72℃ 3min

25cycles:

94℃ 30s

65℃ 30s

72℃ 3min

72℃ 10min

采用热启动，以减少非特异性扩增。从第一轮的反应液中吸取1μl作为巢式PCR第二轮反应的模板。

巢式PCR第二轮反应体系：

巢式PCR第二轮反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，52℃ 45s，72℃ 2min，35个循环

72℃ 10min

同样采用热启动，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收并纯化目的片段，将目的片段与pMD18-T载体连接，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.3.4大米草SaVP1基因开放阅读框的扩增

PCR反应体系：

PCR反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

用2％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收。将目的片段与pMD18-T载体连接，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.4对获得的目的基因的生物信息学分析

使用BioEdit、ContigExpress、Clustal X、DNAstar、DNAMAN、MEGA4.0、NCBI网站、http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.htm网站、TMPRED(http://www.ch.embnet.org)、TMHMM(http://cbs.dtu.dk/services/TMHMM)、Swiss-Model等对序列进行分析。

1.2.5植物表达载体pCAMBIA1301-SaVP1的构建

1)大米草SaVP1基因的克隆与酶切

PCR反应体系：

PCR反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环

72℃ 10min

取10μl反应液于2％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收。将目的片段与pMD18-T载体连接，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

取50μl测序正确的菌液加入50ml的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。取2ml培养过夜的菌液进行质粒的提取。

2)使用限制性内切酶NcoI和BstEII对提取的含有大米草SaVP1的质粒进行双酶切

37℃，4h；60℃，4h；65℃，20min。反应结束后，每管加入1μl的0.5M的EDTA灭活BstEII。将反应液于1％的琼脂糖凝胶上电泳检测并回收目的条带。

3)pCAMBIA1301的双酶切

将含有pCAMBIA1301的菌株进行扩繁并使用质粒小提试剂盒提取pCAMBIA1301的质粒。同样使用限制性内切酶NcoI和BstEII对pCAMBIA1301进行双酶切。

37℃，4h；60℃，4h；65℃，20min。反应结束后，每管加入1μl的0.5M的EDTA灭活BstEII。将反应液于1％的琼脂糖凝胶上电泳检测并回收目的条带。

4)连接体系：

16℃，过夜连接。

5)表达载体pCAMBIA1301-SaVP1的筛选

将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，大肠杆菌DH5α感受态的的制备与转化参照1.2.2.6和1.2.2.7。挑选单菌落并摇菌，PCR法检测表达载体pCAMBIA1301-SaVP1的阳性克隆。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，48℃ 45s，72℃ 1min，35个循环

72℃ 10min

取10ul反应液进行电泳检测。

1.2.6重组体pCAMBIA1301-SaVP1转化根癌农杆菌

1.2.6.1农杆菌细胞感受态的制备与转化

1)挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基(含50mg/L Rif)中，28℃、200r/mim培养过夜。

2)取2ml培养物于LB液体培养基(含50mg/L Rif)中继续培养，直至OD₆₀₀为0.5左右。3)转入2ml无菌离心管，4000rpm离心10min，去上清液。

4)加入1ml预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。4℃，4000rpm离心10min，去上清。

5)加入200μl预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。

6)农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，立即使用或每管200μl冻存于-70℃保存。

1.2.6.2冻融法转化农杆菌

1)取出1管解冻的-70℃保存或刚制备的LBA4404感受态细胞，轻轻加入10μl含有目的基因的植物表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴30min。

2)液氮冷冻8min。

3)37℃水浴5min。

4)冰浴5min。

5)加入800μl LB液体培养基与28℃，200rpm振荡培养2h。

6)将复苏后的LB液体培养基涂布在含有Kana(50mg/L)和Rif(50mg/L)的LB固体培养基上。

7)28℃倒置培养2天直到长出菌落。

8)挑取单克隆与含有Kana(50mg/L)和Rif(50mg/L)的LB液体培养基中培养，采用PCR法检测阳性克隆子。

1.2.7叶盘法转化烟草

1.2.7.1农杆菌的培养

1)挑取单菌落，在10ml LB液体培养基中，28℃过夜培养。

2)取1ml以上培养物，加入50ml LB液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.1左右。

3)将50ml培养物离心，收集菌体，用MS₀重悬，使OD₆₀₀保持在0.1左右。

1.2.7.2共培养

1)取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成1cm×1cm左右的叶盘，放在MS₁培养基上。

2)将大约100片叶盘放入100ml含有农杆菌的MS₀培养基中，190rpm，28℃摇床上共培养15分钟。

3)用药勺捞出叶盘，放在已灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上多余的菌液。

4)将吸干的叶盘平放在加有一层滤纸的MS₁培养基上，用封口膜封好培养基，放于25℃，暗培养48h。

1.2.7.3诱导生芽

1)暗培养48h后，取出叶盘放在吸水纸上，吸干多余的菌液。

2)将叶盘背面朝下，放在MS₂培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中。

3)将培养皿放于25℃左右，16h光照培养。

4)约两周后，切下带芽的叶缘，插入MS₂培养基中继续培养。

1.2.7.4诱导生根

在MS₂培养基中培养约4周后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼芽插入MS₃培养基中诱导生根，对每一棵苗进行编号，25℃左右，16h光照培养。

1.2.7.5再生植株的移栽

诱导生根一月后，大部分苗已长出繁茂的根，可将PCR阳性苗移入珍珠岩中培养。待烟草的根系较发达时移入土中栽培。

1.2.8转基因烟草苗的PCR检测

1.2.8.1转基因烟草叶片DNA的提取

使用CTAB法提取烟草的DNA

1)取2g烟草的叶片，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5ml Eppendorf管中。

2)加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min。

3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。

4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。

5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止。

6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min。

7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次。

8)室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。

1.2.8.2转基因烟草的PCR检测

PCR反应体系：

PCR反应程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，48℃ 45s，72℃ 1min，35个循环

72℃ 10min

取10ul反应液进行电泳检测。

1.2.9转基因烟草苗对盐分的耐受性分析

把经PCR检测为阳性的转基因烟草分为5个转基因株系(SaVP1-1、SaVP1-2、SaVP1-3、SaVP1-4、SaVP1-5)，每一个转基因株系分为5个组(A、B、C、D、E)每一组均包括1棵对照组的野生型烟草和1棵转基因烟草。A组每天浇灌浓度为0mM NaCl溶液，B-E组每天浇灌NaCl溶液的浓度依次为100mM、200mM、300mM、400mM。

2.试验结果与分析

2.1大米草RNA的鉴定

对大米草叶片进行总RNA的提取，总RNA经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，28S rRNA与18S rRNA的条带清晰，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.9，未见基因组DNA污染。结果显示，提取的大米草总RNA符合实验要求，能够进行后续实验。如图1。

2.2大米草SaVP1基因中间片段的RT-PCR扩增

以大米草cDNA为模板，P1，P2为引物进行RT-PCR扩增。电泳显示在1245bp存在一条明显的亮带，命名为SaVP1a。如图2。

2.3大米草SaVP1全长的扩增

2.3.15’RACE的扩增

以大米草5’-RACE-Ready cDNA为模板，UPM和GSP1为第一轮巢式RCR引物进行扩增。然后从第一轮的反应液中吸取1μl作为巢式PCR第二轮反应的模板，以NUP和GSP2为引物进行巢式第二轮PCR扩增。结果如图3.

2.3.23’RACE的扩增

以大米草3’-RACE-Ready cDNA为模板，UPM和GSP3为第一轮巢式RCR引物进行扩增。然后从第一轮的反应液中吸取1μl作为巢式PCR第二轮反应的模板，以NUP和GSP4为引物进行巢式第二轮PCR扩增。结果如图4.

2.3.3大米草SaVP1全长的克隆

设计特异性引物P3和P4，以cDNA为模板克隆大米草SaVP1的开放阅读框。结果如图5所示。

对序列进行测定和分析，大米草SaVP1的cDNA核苷酸序列全长如SEQ ID NO.1所示。大米草SaVP1的编码区核苷酸序列全长如SEQ ID NO.2所示(该编码区序列位置为SEQ ID NO.1第192-2195核苷酸，长度为2004个核苷酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码667个氨基酸)。大米草SaVP1所编码的氨基酸序列则为如SEQ ID NO.3所示，由以上可知：大米草SaVP1序列长2506bp，其中ORF长2004bp，共编码667个氨基 酸。

2.4大米草SaVP1基因全长的生物信息学分析

研究表明，液泡膜H⁺-PPase蛋白位于细胞质的一侧有三个高度保守区，即CS1(KAADVGADLVGKVE)、CS2(YYTS)和CS3(GDTIGD)；其中CS1被认为是酶的催化位点。通过对大米草SaVP1蛋白质氨基酸的研究发现，大米草SaVP1蛋白拥有完整的上述三个保守区域，其保守区CS1在151-164区域、CS2在325-328区域、CS3在623-628区域且这些区域均在细胞质一侧。由此可以推测，大米草SaVP1蛋白的酶催化位点在151-164区域。

2.4.1大米草SaVP1蛋白二级结构的分析

通过http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html网站预测大米草Savp1蛋白的二级结构(图6)。由图6的预测分析可知，大米草SaVP1蛋白的二级结构中含有8种相似阈值中的4种类型，分别是α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。其中，α-螺旋共371个，占蛋白的55.62％；β-折叠共99个，占蛋白的14.64％；β-转角共23个，占蛋白的3.45％；无规则卷曲共174个，占蛋白的26.09％。

2.4.2大米草SaVP1蛋白疏水性和亲水性分析

疏水性是指氨基酸远离周围水分子，包围进蛋白质核心的相对趋势，是蛋白质三维空间构想的影响因素之一。使用BioEdit软件预测大米草SaVP1氨基酸的疏水性和亲水性，预测的结果如图7、8所示。通过分析图7、图8，大米草SaVP1蛋白质中1-14、37-63、87-113、200-213、226-239、276-289、300-329、350-400、450-500、550-589、639-663区域出现疏水性的氨基酸，而亲水性的氨基酸主要出现在20-35、165-175、335-345、430-440、525-535、590-600、610-620、630-635区域。疏水性区域在1-14、226-239、350-400出现较大的峰值且峰值为2.8左右，亲水性区域的最大峰值出现在20-35。但是疏水性区域的峰值一般大于1.4而亲水性区域的峰值一般小于1.4。因此，通过以上分析推测，大米草SaVP1为疏水性蛋白质。

2.4.3大米草SaVP1跨膜结构分析

跨膜结构域是膜内在蛋白与膜结合的区域，一般由20个左右的疏水氨基酸残基组成，形成α螺旋，它固着于细胞膜上起锚定作用。借助http://www.ch.embnet.org中的TMPRED和http://cbs.dtu.dk/services中的TMHMM功能分析大米草SaVP1蛋白的跨膜结构。

TMPRED从内向外共预测到12个α螺旋，分别是1-18、36-60、92-110、130-148、229-247、266-287、303-321、360-380、443-461、477-493、548-575、644-664区域，其中在303-321区域峰值最大，477-493区域被认为是最有可能的跨膜结构；从外向内共预测到13 个α螺旋，分别是1-18、40-60、92-110、127-148、227-246、266-285、305-322、360-378、443-461、476-493、543-563、548-582、640-664区域，其中305-322区域峰值最大，127-148、266-285、548-582区域被认为是最有可能的跨膜结构(图9)。TMHMM共预测到12个α螺旋，分别是2-19、39-61、91-113、128-147、228-250、265-287、300-322、349-371、378-400、439-461、468-490、556-578区域(图10)。TMPRED和TMHMM是基于不同算法的两种软件，但是对于大米草SaVP1蛋白的跨膜结构的预测极其相近。

2.4.4大米草SaVP1信号肽分析

信号肽位于蛋白质的N端，是一段引导信合成的肽链进入细胞器的识别序列，一般由16-26个氨基酸残基组成，蛋白质在细胞质中的核糖体上合成后，在信号肽的引导下，转运至不同的细胞器或细胞质基质的特定部位发挥作用。利用网络http://www.cbs.dtu.dk/services/中的SignaIP分析大米草SaVP1蛋白质的信号肽。

在神经网络法中，标记为C的列式剪切位点打分，标记为S的列式信号肽打分，Y列是综合接切点打分。只有C、Y、S值的计算结论为YES的预测结果较好，具有高C分值时又是S分值由高转低的位点才是信号肽预测的最可能的剪切点。由图11可推知，大米草SaVP1蛋白N端存在一段由18个氨基酸组成的信号肽，其信号肽剪切点最有可能在17-18区域。通过分析马科夫模型(图12)同样显示其信号肽剪切点最有可能在17-18区域，说明对大米草SaVP1蛋白信号肽的预测是可信的。

2.5植物表达载体pCAMBIA1301-SaVP1的构建

整个载体构建的过程见图13。本载体构建的思路是：首先，用带有限制性内切酶酶切位点的NcoI和BstEII的引物克隆目的基因SaVP1，然后使目的基因SaVP1与克隆载体pMD18-T连接，将连接的产物送去测序，选择测序正确的pMD18-T-SaVP1重组体；其次，使用限制性内切酶NcoI和BstEII分别对pCAMBIA1301和pMD18-T-SaVP1重组体进行双酶切并对pCAMBIA1301的大片段即去掉GUS的片段和pMD18-T-SaVP1重组体的小片段即SaVP1回收并纯化；再次，将回收的两个片段进行连接并转化大肠杆菌DH5α筛选阳性单克隆重组体pCAMBIA1301-SaVP1；最后，将重组体转化农杆菌LBA4404并筛选重组体pCAMBIA1301-SaVP1。酶切结果如图14，PCR检测pCAMBIA1301-SaVP1转化农杆菌结果如图15。

2.6叶盘法转化烟草

2.6.1共培养

共培养48h后，可以观察到叶盘开始膨大。但是一些比较幼嫩、面积较小的叶盘无此变 化或开始褐化，这些叶盘很有可能没有转化成功。

2.6.2诱导生芽

叶盘转入MS₂培养基约2周后，疑似转化成功的叶盘会继续膨大并有愈伤长出，未转化成功的叶盘会慢慢死亡。叶盘在MS₂培养基上生长约1月左右，诱导的芽可转入生根培养基MS₃中诱导生根。

2.6.3诱导生根

选择长势良好的芽，从叶盘的基部切下插入MS₃培养基中诱导生根。试验共得到329颗无菌苗。2周后对生根情况进行统计发现，共有291颗苗生根，生根率为88.4％。

2.6.4移栽

待生根的烟草苗生长健壮，经过炼苗以后移入土中。温室中培养大约2个月便可开花结果。烟草转化过程如图16所示。

2.7PCR检测

用CTAB法提取转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA，使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图17所示。使用在pCAMBIA1301的35S promoter和目的基因Savp1上分别设计的引物SaVP1P1和SaVP1P2进行转基因的PCR检测，检测结果如图18所示。

2.8转基因烟草苗对盐分的耐受性分析

选取5个转基因烟草株系中的一个株系对盐分的耐受性分析显示，在没有NaCl胁迫下，转基因烟草和野生型烟草的生长状况没有明显的差异；当200mMNaCl胁迫14天后，转基因烟草仍能正常生长，野生型烟草叶片开始发黄；当300mMNaCl胁迫14天后，转基因烟草仍能正常生长，而野生型烟草的叶片开始枯萎，影响正常的生长；但是当使用胁迫的NaCl的浓度达到400mM时，胁迫14天后转基因烟草和野生型烟草均不能生长。如图19。

由表1可知，对5个转基因烟草株系进行盐分的耐受性试验结果显示，在300mMNaCl浓度胁迫下，4个转基因烟草株系仍能生长，但在400mMNaCl浓度下全部死亡；而野生型烟草在200mMNaCl浓度胁迫下不能正常生长，表明SaVP1转基因株能提高烟草耐盐性。

表1 转基因烟草株系的耐受性分析

注：++++：表示烟草株高大于10cm；+++：表示烟草株高大于5cm小于10cm；

+：表示烟草株高小于5cm；-：表示烟草死亡，记为0cm。

<110> 南京晓庄学院

<120> 大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 2506

<212> DNA

<213> 米草属大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因

<400> 1

gggtgaagct ctcgcccgcc gcggccgcgt ccggcggcaa caagaacggc ggctacggcg 60

actatctcat cgaggaggag gagggcctca acgaccacaa cgtcgtcgtc aagtgcgccg 120

agatccagac cgccatctcc gaaggagcaa catcgtttct cttcactgag taccagtatg 180

ttggtatttt catgtcgatc tttgctgttg ttatctttct cttccttggt tcagttgagg 240

gattcagcac aaagagccag ccttgcacct acagcaagga caagacttgc aagccggccc 300

tgttcactgc tctcttcagc actgtgtctt tcttgcttgg agcaatcacc tctctggtct 360

ctggttttct tggaatgaag attgccacat atgccaatgc taggactacc ctggaagcta 420

ggaagggtgt tgggaaagca tttatcactg ctttccgctc tggtgctgtt atgggatttt 480

tgcttgcatc aagtgggctc gtggttctgt acattactat caacgtgttc aagttgtatt 540

acggagatga ctgggagggt ctttttgagt ccatcactgg ttatggcctt ggtggttctt 600

ccatggctct ctttggaaga gttggtggtg gtatttacac aaaggctgca gatgtgggtg 660

ctgatcttgt tggcaaagtt gagaggaaca tccccgagga tgatcctagg aacccagctg 720

tgattgcaga caacgttggt gacaatgtcg gtgacattgc tggaatggga tcagacctct 780

ttggttcata tgcagaatct tcctgcgctg cccttgttgt tgcatctatt tcatcttttg 840

gaatcaacca cgatttcacc gggatgtgct tccccctgct ggttagctct gttggtatca 900

tcgtctgctt gatcacgaca ctgtttgcaa ccgatttctt tgaggttaag gctgtggagg 960

aaatcgagcc tgcacttaag aagcagcttg tcatctccac tgttttgatg accgctggta 1020

ttgcaattat cagctggttg gcccttccag ccaagttcac tatcttcaac ttcggtgccc 1080

agaaggaagt gtctaagtgg ggtttgttct tctgtgttgc aattggtctg tgggctggtc 1140

tgattattgg atttgtgaca gaatactaca ctagcaatgc gtacagccct gtgcaagatg 1200

ttgctgattc ctgcaggacc ggtgctgcca ctaatgtcat atttggtctt gctctaggat 1260

acaagtctgt tatcatccca atttttgcaa ttgcgctcag catctttgtc agtttctcta 1320

ttgctgcaat gtacggcata gcagttgctg ctcttggtat gctaagcaca attgccactg 1380

gccttgctat tgatgcttat ggtcccatca gtgacaatgc tggtggtatt gctgagatgg 1440

ctggaatgag ccacaggatc cgtgagagaa ctgatgcact tgatgctgct ggcaacacaa 1500

cggctgccat tggaaaggga tttgcaattg gatcagctgc tcttgtgtcc cttgcacttt 1560

ttggtgcctt tgtcagcaga gctggagtgc aggttgttga tgtcttatcc cctaaggtct 1620

tcattggttt gattgttggg gccatgcttc cgtactggtt ctctgcaatg accatgaaga 1680

gtgtgggaag tgctgctctg aagatggtgg aggaggtccg caggcagttc aacaccattc 1740

ctgggctgat ggagggaact gggaaacctg actatgccac atgtgtcaag atctctaccg 1800

atgcttccat caaagagatg attcctcctg gtgcattggt catgctcaca ccccttattg 1860

ttggaaccct gtttggtgtg cagactctct ctggcgttct tgctggtgcc cttgtttctg 1920

gagtgcaggt tgccatctct gcctccaaca ctggtggtgc atgggacaat gccaagaagt 1980

acatcgaggc tggtgccagt gagcacgcta ggaccctggg ccccaaggga tctgactgcc 2040

acaaggctgc tgtgattggc gataccattg gcgaccctct gaaagacacc tctggcccct 2100

ccctcaacat cctcatcaag ctcatggccg ttgagtcact cgtgtttgct cccttctttg 2160

ccacacacgg tggcctgctc ttcaagctat tctaagcacc acaccaagcg cagcagaagt 2220

atatgattta tgggacatca caaataactc ctgccagatt gccagtccgt cgcgtgctgc 2280

attgcaccgc tgtttttttt gtttaggtat gttgttggag gattgctact ggtttcactt 2340

ttggcctcca ggaggcgtta ttttggtctt tccgcttcta gcttcatgta gaagagaaca 2400

ggtgtccccc gaccctgcgt atgtcaaatt ttctcatccc ctgatgacgg cgataataca 2460

tgattattgc attgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2506

<210> 2

<211> 2004

<212> DNA

<213> 米草属大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因开放阅读框

<400> 2

atgtcgatct ttgctgttgt tatctttctc ttccttggtt cagttgaggg attcagcaca 60

aagagccagc cttgcaccta cagcaaggac aagacttgca agccggccct gttcactgct 120

ctcttcagca ctgtgtcttt cttgcttgga gcaatcacct ctctggtctc tggttttctt 180

ggaatgaaga ttgccacata tgccaatgct aggactaccc tggaagctag gaagggtgtt 240

gggaaagcat ttatcactgc tttccgctct ggtgctgtta tgggattttt gcttgcatca 300

agtgggctcg tggttctgta cattactatc aacgtgttca agttgtatta cggagatgac 360

tgggagggtc tttttgagtc catcactggt tatggccttg gtggttcttc catggctctc 420

tttggaagag ttggtggtgg tatttacaca aaggctgcag atgtgggtgc tgatcttgtt 480

ggcaaagttg agaggaacat ccccgaggat gatcctagga acccagctgt gattgcagac 540

aacgttggtg acaatgtcgg tgacattgct ggaatgggat cagacctctt tggttcatat 600

gcagaatctt cctgcgctgc ccttgttgtt gcatctattt catcttttgg aatcaaccac 660

gatttcaccg ggatgtgctt ccccctgctg gttagctctg ttggtatcat cgtctgcttg 720

atcacgacac tgtttgcaac cgatttcttt gaggttaagg ctgtggagga aatcgagcct 780

gcacttaaga agcagcttgt catctccact gttttgatga ccgctggtat tgcaattatc 840

agctggttgg cccttccagc caagttcact atcttcaact tcggtgccca gaaggaagtg 900

tctaagtggg gtttgttctt ctgtgttgca attggtctgt gggctggtct gattattgga 960

tttgtgacag aatactacac tagcaatgcg tacagccctg tgcaagatgt tgctgattcc 1020

tgcaggaccg gtgctgccac taatgtcata tttggtcttg ctctaggata caagtctgtt 1080

atcatcccaa tttttgcaat tgcgctcagc atctttgtca gtttctctat tgctgcaatg 1140

tacggcatag cagttgctgc tcttggtatg ctaagcacaa ttgccactgg ccttgctatt 1200

gatgcttatg gtcccatcag tgacaatgct ggtggtattg ctgagatggc tggaatgagc 1260

cacaggatcc gtgagagaac tgatgcactt gatgctgctg gcaacacaac ggctgccatt 1320

ggaaagggat ttgcaattgg atcagctgct cttgtgtccc ttgcactttt tggtgccttt 1380

gtcagcagag ctggagtgca ggttgttgat gtcttatccc ctaaggtctt cattggtttg 1440

attgttgggg ccatgcttcc gtactggttc tctgcaatga ccatgaagag tgtgggaagt 1500

gctgctctga agatggtgga ggaggtccgc aggcagttca acaccattcc tgggctgatg 1560

gagggaactg ggaaacctga ctatgccaca tgtgtcaaga tctctaccga tgcttccatc 1620

aaagagatga ttcctcctgg tgcattggtc atgctcacac cccttattgt tggaaccctg 1680

tttggtgtgc agactctctc tggcgttctt gctggtgccc ttgtttctgg agtgcaggtt 1740

gccatctctg cctccaacac tggtggtgca tgggacaatg ccaagaagta catcgaggct 1800

ggtgccagtg agcacgctag gaccctgggc cccaagggat ctgactgcca caaggctgct 1860

gtgattggcg ataccattgg cgaccctctg aaagacacct ctggcccctc cctcaacatc 1920

ctcatcaagc tcatggccgt tgagtcactc gtgtttgctc ccttctttgc cacacacggt 1980

ggcctgctct tcaagctatt ctaa 2004

<210> 3

<211> 667

<212> PRT

<213> 米草属大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因编码的氨基酸序列

<400> 3

Met Ser Ile Phe Ala Val Val Ile Phe Leu Phe Leu Gly Ser Val Glu

5 10 15

Gly Phe Ser Thr Lys Ser Gln Pro Cys Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Thr

20 25 30

Cys Lys Pro Ala Leu Phe Thr Ala Leu Phe Ser Thr Val Ser Phe Leu

35 40 45

Leu Gly Ala Ile Thr Ser Leu Val Ser Gly Phe Leu Gly Met Lys Ile

50 55 60

Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr Thr Leu Glu Ala Arg Lys Gly Val

65 70 75 80

Gly Lys Ala Phe Ile Thr Ala Phe Arg Ser Gly Ala Val Met Gly Phe

85 90 95

Leu Leu Ala Ser Ser Gly Leu Val Val Leu Tyr Ile Thr Ile Asn Val

100 105 110

Phe Lys Leu Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ser Ile

115 120 125

Thr Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val

130 135 140

Gly Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val

145 150 155 160

Gly Lys Val Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala

165 170 175

Val Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met

180 185 190

Gly Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu

195 200 205

Val Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Gly

210 215 220

Met Cys Phe Pro Leu Leu Val Ser Ser Val Gly Ile Ile Val Cys Leu

225 230 235 240

Ile Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe Glu Val Lys Ala Val Glu

245 250 255

Glu Ile Glu Pro Ala Leu Lys Lys Gln Leu Val Ile Ser Thr Val Leu

260 265 270

Met Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ile Ser Trp Leu Ala Leu Pro Ala Lys

275 280 285

Phe Thr Ile Phe Asn Phe Gly Ala Gln Lys Glu Val Ser Lys Trp Gly

290 295 300

Leu Phe Phe Cys Val Ala Ile Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly

305 310 315 320

Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp

325 330 335

Val Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly

340 345 350

Leu Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala

355 360 365

Leu Ser Ile Phe Val Ser Phe Ser Ile Ala Ala Met Tyr Gly Ile Ala

370 375 380

Val Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile Ala Thr Gly Leu Ala Ile

385 390 395 400

Asp Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly Ile Ala Glu Met

405 410 415

Ala Gly Met Ser His Arg Ile Arg Glu Arg Thr Asp Ala Leu Asp Ala

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile Gly Lys Gly Phe Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Ala Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Phe Gly Ala Phe Val Ser Arg Ala

450 455 460

Gly Val Gln Val Val Asp Val Leu Ser Pro Lys Val Phe Ile Gly Leu

465 470 475 480

Ile Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr Trp Phe Ser Ala Met Thr Met Lys

485 490 495

Ser Val Gly Ser Ala Ala Leu Lys Met Val Glu Glu Val Arg Arg Gln

500 505 510

Phe Asn Thr Ile Pro Gly Leu Met Glu Gly Thr Gly Lys Pro Asp Tyr

515 520 525

Ala Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr Asp Ala Ser Ile Lys Glu Met Ile

530 535 540

Pro Pro Gly Ala Leu Val Met Leu Thr Pro Leu Ile Val Gly Thr Leu

545 550 555 560

Phe Gly Val Gln Thr Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Ala Leu Val Ser

565 570 575

Gly Val Gln Val Ala Ile Ser Ala Ser Asn Thr Gly Gly Ala Trp Asp

580 585 590

Asn Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala Gly Ala Ser Glu His Ala Arg Thr

595 600 605

Leu Gly Pro Lys Gly Ser Asp Cys His Lys Ala Ala Val Ile Gly Asp

610 615 620

Thr Ile Gly Asp Pro Leu Lys Asp Thr Ser Gly Pro Ser Leu Asn Ile

625 630 635 640

Leu Ile Lys Leu Met Ala Val Glu Ser Leu Val Phe Ala Pro Phe Phe

645 650 655

Ala Thr His Gly Gly Leu Leu Phe Lys Leu Phe

660 665 667