技术领域:本发明属于医药技术领域，涉及5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其制备方法和在制备抗菌、抗结核药物中的应用。
背景技术：
由于抗生素的广泛使用,特别是不合理的临床误用,造成耐药性致病菌种类的不断增加,如耐甲氧西林的金葡球菌(MRSA)、耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)、耐万古霉素的肠球菌(VRE)和多耐药性结核杆菌(MDRMT)等。即使新近上市的抗菌药物如“奎奴普丁/达福普丁”也已发现有部分临床分离菌耐药；而临床应用时间并不太长的喹诺酮类药物，因国内广泛使用,使其耐药程度严重加剧。因此,开发化学结构独特、作用机制新颖、对耐药菌有效的抗感染药物是各国政府、科研机构和临床医师所共同面临的紧迫任务。化合物结构中含有席夫碱或腙结构片段具有广泛的抗菌生物活性，在医药中应用广泛。Peng-ChengLv等人[LvPC,WangKR,YangY,etal.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2009,19(23):6750-6754]发现噻唑衍生物作为潜在fabH抑制剂具有良好的抗菌活性，结构式如下所示：Jee-YoungLee等人[LeeJY,JeongKW,LeeJU,etal.Bioorg.Med.Chem.,2009,17(4):1506-1513；LeeJY,JeongKW,ShinS,etal.E.J.Med.Chem.,2012,47:261-269]报道了含席夫碱(YKAs3003)或腙结构片段(4-[(5-trifluoromethyl-pyridin-2-yl)-hydrazonomethyl]–benzene-1,3-diol)类衍生物，具有良好的抗菌活性，结构式如下所示：FeiZhang等人[ZhangF,WenQ,WangSF,etal.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2014,24(1):90-95]报道了含席夫碱结构片段的5-(吡啶-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇衍生物，具有良好的抗菌活性，结构式如下所示：
技术实现要素：
：本发明的目的在于提供了一种具有良好的抗菌、抗结核活性的新型结构-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物以及他们的制备方法与用途。本发明的技术方案为：具有抗菌、抗结核活性的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，其结构通式如下：其中，R为H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，卤素，氰基。R1为H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，羟基，卤素，氰基。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，R为H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，卤素，氰基。R1为H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，羟基，卤素，氰基。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，R为H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，卤素，氰基。R1为H，甲基，甲氧基，羟基，卤素，氰基。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，R为H，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，F，Cl，Br，氰基。R1为H，甲基，甲氧基，羟基，F，Cl，Br，氰基。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，R为H，甲基，甲氧基，F，Cl，Br，氰基。R1为H，甲基，甲氧基，羟基，F，Cl，Br，氰基。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，R选自H，p-CH3，p-Cl，p-CH3O。R1可以选自H，p-CH3，p-Cl，p-Br，p-CH3O，p-OH，2,4-二羟基，3,5-二溴。本发明优选如下的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐，本发明所述及的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物的制备方法,其特征在于包括以下步骤：步骤一：将金属钠(4.9g，213mmol)加到70mL无水乙醇中，钠反应完成后，依次加入草酸二乙酯(30.4mL，224mmol)和取代苯乙腈(213mmol)，反应混合物在室温搅拌12h后，反应结束后将反应液慢慢倒入50mL浓盐酸中，立即有大量黄色固体生成，抽滤，水洗，固体在60％乙醇中重结晶，干燥后得浅黄色固体；步骤二：将步骤一中所得苯丙酸乙酯衍生物(12mmol)、盐酸羟胺(1.66g，24mmol)和70mL无水乙醇，加热回流12h，减压蒸流去乙醇。然后加入50mL乙酸乙酯和10mL10％碳酸钠溶液，分出有机相，再经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸流去乙酸乙酯，得到白色或浅黄色粉末状固体。步骤三：将步骤二中所得异恶唑羧酸乙酯衍生物和取代苯甲醛和无水乙醇混合，加入几滴浓硫酸作为催化剂，加热回流，TLC监测反应，反应结束后，降至室温，抽滤，水洗，柱层析纯化得到白色或浅黄色粉末状固体。在所述步骤三中,所述的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物的制备方法，其特征在于：在所述步骤三中,异恶唑羧酸乙酯衍生物和取代苯甲醛摩尔分数比为1：1～2，反应时间为4～12h，取代苯甲醛中苯环上若有羟基基团，则合环反应时间应缩短为4h，否则副反应增多。通过体外抑菌、抗结核试验表明，本发明所述的5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物对革兰阳性和革兰阴性菌具有明显的广谱的抑制作用，而对非致病细菌，如大肠埃希菌抑制作用很小。部分化合物具有明显抗结核活性。因此，本发明提供了一种用于治疗细菌感染的药物。具体实施方式：下面通过实施例的方式对本发明做进一步的说明,并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1:苯丙酸乙酯衍生物的制备将金属钠(4.9g，213mmol)加到70mL无水乙醇中，钠反应完成后，依次加入草酸二乙酯(30.4mL，224mmol)和取代苯乙腈(213mmol)，反应混合物在室温搅拌12h后，反应结束后将反应液慢慢倒入50mL浓盐酸中，立即有大量黄色固体生成，抽滤，水洗，固体在60％乙醇中重结晶，干燥后得浅黄色固体，直接用于下一步反应。实施例2:5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯的制备A1将实施例1中所得苯丙酸乙酯衍生物(12mmol)、盐酸羟胺(1.66g，24mmol)和70mL无水乙醇，加热回流12h，减压蒸流去乙醇。然后加入50mL乙酸乙酯和10mL10％碳酸钠溶液，分出有机相，再经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸流去乙酸乙酯，得到白色粉末状固体2.48g。收率89.11％。mp:188.4-189.1℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ7.30-7.53(m,5H),4.70(brs,2H),4.32(q,J＝7.2Hz,2H),1.32(t,J＝7.0Hz,3H)；HRMS(m/z):calcd.forC12H13N2O3(neutralM+H+)233.09262,found233.093108.按照实施例2方法，制备5-氨基-4-(对甲苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯A2将实施例1中所得苯丙酸乙酯衍生物(12mmol)、盐酸羟胺(1.66g，24mmol)为原料，得到白色粉末状固体2.73g。收率92.30％。mp:180.3-180.6℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ7.31-7.52(m,4H),4.69(brs,2H),4.30(q,J＝7.2Hz,2H),2.32(s,3H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H)；HRMS(m/z):calcd.forC13H15N2O3(neutralM+H+)247.10827,found247.108283.按照实施例2方法，制备5-氨基-4-(对氯苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯A3将实施例1中所得苯丙酸乙酯衍生物(12mmol)、盐酸羟胺(1.66g，24mmol)为原料，得到黄色粉末状固体3.01g。收率94.09％。mp:196.4-197.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ7.23-7.18(m,4H),4.70(brs,2H),4.31(q,J＝7.2Hz,2H),1.36(t,J＝7.0Hz,3H)；HRMS(m/z):calcd.forC12H12ClN2O3(neutralM+H+)267.05364,found267.053318.按照实施例2方法，制备5-氨基-4-(对甲氧基苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯A4将实施例1中所得苯丙酸乙酯衍生物(12mmol)、盐酸羟胺(1.66g，24mmol)为原料，得到黄色粉末状固体3.06g。收率91.69％。mp:187.4-187.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ7.45-6.94(m,4H),4.68(brs,2H),4.28(q,J＝7.2Hz,2H),3.81(s,3H),1.35(t,J＝7.0Hz,3H)；HRMS(m/z):calcd.forC13H15N2O4(neutralM+H+)263.10318,found263.104111.实施例3:(E)-5-(亚苄基氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯的制备B1将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、苯甲醛(0.212g,2mol)和10mL无水乙醇混合，加入1滴浓硫酸作为催化剂，加热回流，TLC监测反应，反应结束后，降至室温，抽滤，水洗，柱层析纯化得到白色粉末状固体0.45g。收率71.77％。mp:231.5-232.0℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.93(d,J＝1.46,1H),7.31-7.76(m,10H),4.32(q,J＝7.2Hz,2H),1.33(t,J＝7.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ161.78,158.88,156.63,153.84,135.94,132.52,130.53,129.94,129.16,128.87,128.63,127.68,96.93,62.90,14.12；HRMS(m/z):calcd.forC19H17N2O3(neutralM+H+)321.12392,found321.123897.按照实施例3方法，(E)-制备5-((4-甲基亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B2将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、对甲基苯甲醛(0.240g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.52g。收率77.42％。mp：237.5-238.8℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.97(d,J＝1.47,1H),7.21-7.56(m,9H),4.37(q,J＝8.0Hz,2H),2.30(s,3H)，1.36(t,J＝7.0Hz,3H)；13CNMR:δ161.80,159.78,156.59,153.80,143.12,133.20,132.47,130.37,130.10,130.04,128.60,127.87,96.10,62.74,21.67,14.35；HRMS(m/z):calcd.forC20H19N2O3(neutralM+H+)335.13957,found335.139588.按照实施例3方法，制备(E)-5-((4-氯亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B3将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、对氯苯甲醛(0.280g,2mol)为原料，得到浅黄色粉末状固体0.55g。收率77.50％。mp:193.7-195.3℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.95(d,J＝1.45,1H),7.63–7.28(m,9H),5.38(d,J＝4.6Hz1H),4.37(q,J＝8.0Hz,2H),1.36(t,J＝8.0Hz,3H).；13CNMR(101MHz,DMSO):δ161.46,157.56,155.45,151.74,134.71,133.83,131.12,130.12,129.54,129.11,128.60,125.77,95.91,60.90,14.20；HRMS(m/z):calcd.forC19H16ClN2O3(neutralM+H+)355.08495,found355.085201.按照实施例3方法，制备(E)-5-((4-溴亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B4将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、对溴苯甲醛(0.370g,2mol)为原料，得到浅黄色粉末状固体0.61g。收率76.16％。mp:256.7-258.8℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.91(d,J＝1.48,1H),7.75–7.28(m,9H),4.38(q,J＝8.0Hz,2H),1.39(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ160.54,157.97,156.13,152.45132.62,131.52,130.28,129.24,129.10,128.10,127.08,122.11,94.18,61.98,14.33；HRMS(m/z):calcd.forC19H16BrN2O3(neutralM+H+)399.03443,found399.035011.按照实施例3方法，制备(E)-5-((4-甲氧基亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B5将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、对甲氧基苯甲醛(0.272g,2mol)为原料，得到浅黄色粉末状固体0.53g。收率75.47％。mp268.9-269.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.94(d,J＝1.46,1H),7.89(m,9H),4.27(q,J＝8.0Hz,2H),3.79(s,3H),1.30(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ161.98,160.15,158.17,156.35,150.74,132.52,131.50,130.44,129.15,128.05,127.55,114.69,94.97,62.10,37.06,14.32；HRMS(m/z):calcd.forC20H19N2O4(neutralM+H+)351.13448,found351.134503.按照实施例3方法，制备(E)-5-((4-羟基亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B6将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、对羟基苯甲醛(0.244g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.49g。收率73.22％。mp:289.6-290.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ9.86(s,1H),8.95(d,J＝1.47,1H),7.66–6.81(m,9H),4.27(q,J＝8.0Hz,2H),1.30(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ160.62,158.47,156.52,153.74,150.59,132.02,131.15,130.29,129.32,128.86,127.66,115.40,93.68,61.90,14.25；HRMS(m/z):calcd.forC19H17N2O4(neutralM+H+)337.11883,found337.118798.按照实施例3方法，制备(E)-5-((2,4-二羟基亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B7将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、2，4-二羟基苯甲醛(0.276g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.49g。收率70.20％。mp:268.1-270.0℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ12.15(s,1H),11.80(s,1H),8.94(d,J＝1.46,1H),7.60–6.33(m,9H),4.27(q,J＝8.0Hz,2H),1.30(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ164.77,162.81,160.28,158.61,157.73,154.15,133.00,131.46,129.50,128.10,126.84,112.49,108.77,101.42,95.48,61.96,14.22；HRMS(m/z):calcd.forC19H17N2O5(neutralM+H+)353.11375,found353.113778.按照实施例3方法，制备(E)-5-((3,5-二溴亚苄基)氨基)-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯B8将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A1(0.464g,2mol)、3，5-二溴苯甲醛(0.526g,2mol)为原料，得到浅黄色粉末状固体0.71g。收率74.50％。mp271.2-273.2℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.91(d,J＝1.48,1H),7.89–7.42(m,8H),4.27(q,J＝8.0Hz,2H),1.31(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ160.47,158.40,154.65,150.93,134.12,133.28,131.34,130.44,129.15,128.53,127.36,121.68,96.45,62.80,14.18；HRMS(m/z):calcd.forC19H15Br2N2O3(neutralM+H+)476.94494,found476.945021.按照实施例3方法，制备(E)-5-((2,4-二羟基苯亚甲基)氨基)-4-(4-甲苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯B9将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A2(0.492g,2mol)、2，4-二羟基苯甲醛(0.276g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.52g。收率71.24％。mp:293.1-293.8℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ11.98(s,1H),11.77(s,1H),8.95(d,J＝1.45,1H),7.52(m,7H),4.27(q,J＝8.0Hz,2H),2.33(d,J＝5.7Hz,3H),1.30(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ164.28,162.50,161.78,158.88,157.13,156.63,137.60,133.36,132.99,132.31,128.51,112.49,110.74,103.45,96.93,62.90,21.42,14.15；HRMS(m/z):calcd.forC20H19N2O5(neutralM+H+)367.12940,found367.130040.按照实施例3方法，制备(E)-5-((2,4-二羟基苯亚甲基)氨基)-4-(4-氯苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯B10将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A3(0.532g,2mol)、2，4-二羟基苯甲醛(0.276g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.60g。收率77.56％。mp:273.1-274.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ12.02(s,1H),11.80(s,1H),8.98(d,J＝1.47,1H),7.67–7.35(m,6H),6.33(m,1H),4.26(q,J＝8.0Hz,2H),1.29(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ166.31162.14,160.65,158.38,157.49,152.06,134.34,132.87,132.90,130.22,127.62,112.29,109.68,101.45,95.71,60.98,14.17；HRMS(m/z):calcd.forC19H16ClN2O5(neutralM+H+)387.07477,found387.075808.按照实施例3方法，(E)-制备5-((2,4-二羟基苯亚甲基)氨基)-4-(4-甲氧基苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯B11将实施例2中所得5-氨基-4-苯基异恶唑-3-羧酸乙酯A4(0.526g,2mol)、2，4-二羟基苯甲醛(0.276g,2mol)为原料，得到白色粉末状固体0.54g。收率70.25％。mp:288.7-289.9℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ12.08(s,1H),11.74(s,1H),8.97(d,J＝1.47,1H),7.68–7.22(m,4H),7.06–6.98(m,2H),6.33(m,1H),4.29(q,J＝8.0Hz,2H),3.95(s,3H),1.32(t,J＝8.0Hz,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO):δ165.78,163.51,160.25,159.33,158.10,157.76,153.86,133.72,131.52,126.90,113.53,112.40,110.56,102.15,95.79,62.87,35.34,14.17；HRMS(m/z):calcd.forC20H19N2O6(neutralM+H+)383.12431,found383.125401.实施例3:5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物衍生物的抗菌、抗结核抑制剂活性测定本发明化合物作为抗菌和抗结核抑制剂的活性可以按许多标准的生物学试验或药理学试验测定。应用琼脂稀释法测定实验化合物的最小抑菌浓度MIC(μg/ml)值。抗菌药物原液的配制：甲醇溶解后配制成2mg/mL溶液，用薄膜滤过法除菌。含药琼脂原液的配制：用稀释法将原液稀释成多个梯度浓度。分别取1ml加入到已作好标记的内径90mm的平板孔内。再取已灭菌的50℃的M-H琼脂19ml到平板孔内，混菌后冷却。接种：用接种器在平板孔内逐个接种，每次接种量为1～2μL(含菌量约为5×105CFU/ml)。最后接种不含药物的生长对照板，以检查整个实验过程中测试菌种的存活状态。孵育：平板置于37℃孵育24h。结果判断：菌落完全生长被完全抑制的最低药物浓度为该化合物对检测菌种的MIC值。单一菌落生长可忽略不计。本发明化合物作为抗菌和抗结核抑制剂测定结果结果表明，5-(取代亚苄基氨基)-4-取代苯基异恶唑-3-羧酸乙酯衍生物对大肠埃希菌Escherichiacoli[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosac[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌Staphyloccocusaureus[CMCC(B)26003]和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC(B)63501]都有不同程度的抑制作用，且部分化合物对耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisCGMCC1.2621也有较好的抑制作用。