双改性羧甲基壳聚糖衍生物及其制备方法与流程

文档序号：12834858阅读：478来源：国知局

本发明涉及壳聚糖化学改性领域。更具体地，涉及一种化学双改性的羧甲基壳聚糖衍生物及其制备方法。

背景技术：

甲壳素广泛存在于低等植物菌类，虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳及真菌的细胞壁等，是自然界中储量仅次于纤维素的天然可再生资源。壳聚糖化学名为(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖，是甲壳素脱乙酰后得到的一种碱性多糖。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及抗菌性能。但是由于壳聚糖不溶于水，极大地限制了其在许多领域的应用。

壳聚糖可以在碱性条件下通过羧甲基化反应得到羧甲基壳聚糖(j.adv.drug.deliv.rev.2001,50,591.)。羧甲基的引入赋予了壳聚糖良好的水溶性，拓宽了壳聚糖的适用范围。然而，化学结构的改变在一定程度影响了羧甲基壳聚糖的抗菌性能和生物相容性。

季铵盐类抗菌剂是目前研究较多的一类水溶性抗菌剂，但是小分子抗菌剂存在易挥发、不易加工、生物相容差等缺点。将季铵盐接枝在壳聚糖主链上不但可以大幅改善壳聚糖的水溶性，而且还可以有效提高其抗菌能力(jiaz.etal.carbohyd.res.2001,333,1；lims.h.andhudsons.m.carbohyd.res.2004,339,313)。然而，由于季铵盐的细胞毒性较强，季铵盐改性壳聚糖的生物相容性受到极大影响。

精氨酸为碱性带正电氨基酸，具有优异的生物相容性。在主链上引入精氨酸能够有效提高壳聚糖的生物相容性。而且，精氨酸含有胍基基团，质子化后带正电，可以与表面带负电的细菌作用，从而达到一定的抑菌效果。但由于精氨酸改性壳聚糖抗菌性能有限，目前主要用于基因转染和抗凝材料等方面的研究(casettaril.etal.biomaterials2012,33,7565)。

由此可见，通过单一改性方法制备的壳聚糖衍生物难以同时具备良好的水溶性、抗菌性和生物相容性。因此，通过新的制备方法得到兼具上述多种性能的改性壳聚糖衍生物，将能够很大程度上推进壳聚糖衍生物在许多领域的进一步应用。因此，需要提供一种全新的双改性羧甲基壳聚糖衍生物及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种新的双改性羧甲基壳聚糖衍生物。在羧甲基壳聚糖主链上同时修饰季铵盐和(寡聚)精氨酸，两种功能基团的分布是无规的。羧甲基壳聚糖本身具有良好的水溶性，在此基础上，季铵盐和(寡聚)氨基酸的引入赋予其良好抗菌性能和生物安全性。

本发明的另一个目的在于提供一种制备双改性羧甲基壳聚糖衍生物的方法。该制备方法反应条件相对温和，并且制备过程不使用有机溶剂，不产生有毒物质，整个生产工艺节能环保，可大规模工业化生产。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种双改性羧甲基壳聚糖衍生物，所述双改性羧甲基壳聚糖衍生物的分子结构式如式(1)所示

其中，x、y、z和n为自然数，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，1≤n≤30。

作为本领域公知常识，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的羧甲基化产物。由于羧甲基取代度不同，羧甲基壳聚糖含有不同比例的未羧甲基化单元，如由于壳聚糖原料脱乙酰度不同，羧甲基壳聚糖也会含有不同比例的未脱乙酰单元，如

作为本领域公知常识，通常用通式来表示羧甲基壳聚糖。但是本领域技术人员应当知晓，羧甲基壳聚糖原料分子链中会含有部分未羧甲基化单元，以及含有部分未脱乙酰的单元。

本发明中,上述分子结构式(1)中，三个重复单元在高分子链中的排列顺序并非是完全按照结构式中所标注的顺序，而是采取无规则的排列方式在高分子链中排列组合的。也就是说，双改性羧甲基壳聚糖衍生物分子链中的(寡聚)精氨酸取代基以及季铵盐取代基呈无规则排列。

本发明首次成功制备季铵盐和(寡聚)精氨酸双改性羧甲基壳聚糖衍生物，在保留了羧甲基壳聚糖良好水溶性的前提下，同时提高了羧甲基壳聚糖的抗菌性能和生物安全性。该产物是一种高性能的绿色抗菌剂。

为达到上述第二个目的，本发明所述双功能基团改性壳聚糖的制备方法为：将羧甲基壳聚糖在一定条件下分别与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和(寡聚)精氨酸反应，得到双改性羧甲基壳聚糖衍生物。其中，羧甲基壳聚糖可选用各种市售产品，分子量在10³～10⁶之间。作为优选方案，应采用羧甲基化程度在50％以上的羧甲基壳聚糖。更优选，脱乙酰度95％以上，分子量在10³～2×10⁵da之间的羧甲基壳聚糖。反应所得双改性羧甲基壳聚糖衍生物，经分离纯化，得到最终产品。

具体地，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于水，制得羧甲基壳聚糖溶液；

(2)将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵加入羧甲基壳聚糖溶液，进行反应，得到溶液s1；

(3)将(寡聚)精氨酸在水溶液条件下进行活化，得到(寡聚)精氨酸活化溶液；

(4)将(寡聚)精氨酸活化溶液与溶液s1混合，进行反应；

(5)加入终止剂，以终止反应；

(6)将反应产物分离纯化，获得分子量>5000da的产物，即为双改性羧甲基壳聚糖衍生物。

优选地，步骤(1)中，所述羧甲基壳聚糖重均分子量在10³～10⁶之间，羧甲基取代度在20～100％，脱乙酰度为50～100％；更优选地，步骤(1)中，所述羧甲基壳聚糖数均分子量在10³～3×10⁵之间，羧甲基取代度在50～100％，脱乙酰度为80～100％。最优选地，步骤(1)中，所述羧甲基壳聚糖数均分子量在10³～2×10⁵之间，羧甲基取代度在80～100％，脱乙酰度在95～100％。此优选分子量范围可以保证羧甲基壳聚糖的高分子属性，分子量太大水溶性下降。

优选地，步骤(1)中，所述羧甲基壳聚糖水溶液中羧甲基壳聚糖的浓度为0.1％～50％，按质量体积百分比计。更优选地，所述羧甲基壳聚糖的浓度为0.1％～30％，按质量体积百分比计。此优选羧甲基壳聚糖浓度范围可以保证反应的高生产效率和产物的高接枝率。羧甲基壳聚糖浓度过高会增加反应体系粘度，使反应转化率降低、反应均一性差。

优选地，步骤(2)中，所述羧甲基壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵质量比为1：0.5～10；更优选地，步骤(2)中，所述羧甲基壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵质量比为1：1～7。此优选质量比范围可以保证产物的高接枝率。羧甲基壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵质量比低于上述优选范围，产物接枝率下降，进而抗菌性能随之减弱；质量比高于上述优选范围，会造成原料浪费。

优选地，步骤(3)中，所述(寡聚)精氨酸数均分子量<5000da。更优选地，所述(寡聚)精氨酸的数均分子量<3000da。此优选分子量范围可以保证(寡聚)精氨酸具有较好的抗菌性能。分子量太大会影响反应转化率，产物的抗菌性能也会随之下降。

优选地，步骤(3)中，活化的条件为ph值4.5～7.4。更优选地，所述活化条件为ph值5.5～7.4。最优选地，ph值为6.0～6.5。此优选ph值范围可以保证最佳的催化效率。ph值过低或过高均会影响活化效率，从而影响反应转化率。

进一步地，步骤(3)中，所述活化包括以下步骤：将n-羟基琥珀酰亚胺(以下简写为nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简写为edc)溶于水，得到催化溶液；将(寡聚)精氨酸加入到所述的催化溶液中，得到(寡聚)精氨酸活化溶液。

优选地，步骤(3)中，所述nhs和edc的摩尔比是1：0.1～10。更优选地，nhs与edc的摩尔比是1：0.1～1。此优选nhs与edc的摩尔比范围可以保证最佳的活化效率。摩尔比过低会导致低接枝率；摩尔比过高并不能进一步提高反应转化率，反而造成原料浪费。

优选地，步骤(3)中，所述(寡聚)精氨酸与edc的摩尔比为1：0.5～10。更优选地所述(寡聚)精氨酸与edc的摩尔比为1：0.5～5。此优选摩尔比范围可以保证最佳的反应转化率。摩尔比过低或过高均会影响活化效率，从而影响反应转化率。

优选地，步骤(4)中，所述(寡聚)精氨酸活化溶液中(寡聚)精氨酸与溶液s1中羧甲基壳聚糖的摩尔比为0.02～1：1。更优选地，为0.02～0.5：1。此优选摩尔比范围可以保证终产物最佳的抗菌性能。摩尔比过低会使(寡聚)精氨酸接枝量降低，抗菌性能减弱；摩尔比高于优化范围接枝率不会有明显提高，反而造成原料浪费。

优选地，步骤(4)中，反应的时间为6～48小时。

本发明所涉及的化学反应式如下：

本发明中，由于原材料均具有很好的水溶性，全部制备过程在水溶液环境下进行，无需使用强酸、强碱或有机溶剂，反应条件温和。并且，在接枝了2，3-环氧丙基三甲基氯化铵后，无需提纯过程，大大简化了反应过程，缩短反应时间。所述的制备方法最大限度降低了对环境的污染和能耗。

现有技术中，专利cn102093489a公开了一种两亲性n-长链烷基-n-精氨酸壳聚糖衍生物及其胶束的制备。但是，其与本发明的区别点在于：

专利cn102093489a中，所述的长链烷基具有强疏水性，将其接枝在壳聚糖主链上，使终产物具有两亲性，以形成胶束；所述的精氨酸具有穿膜性，能够提高胶束的穿膜效率，进而提高药物的生物利用度。但是，其也存在相应的缺点和不足：由于壳聚糖不溶于水和有机溶剂，反应需要在较低ph值条件下进行，反应过程复杂、时间长，需要使用强碱和有机溶剂。

本发明所述的2，3-环氧丙基三甲基氯化铵是水溶性小分子，带有正电荷，具有优异的杀菌性能。所述的(寡聚)精氨酸带有胍基集团，同样具有抗菌性能。所述的羧甲基壳聚糖是水溶性大分子。所述的双改性羧甲基壳聚糖具有良好的水溶性、抗菌性和生物相容性，是一种理想的的抗菌材料，极具市场开发前景。

本发明所述的双改性羧甲基壳聚糖衍生物的制备方法，通过对原料的选择和对工艺参数的大量摸索，创造性地采用2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和(寡聚)精氨酸双改性的方法。通过控制反应物浓度和比例(羧甲基壳聚糖水溶液中羧甲基壳聚糖的浓度为0.1％～50％，羧甲基壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1：0.5～10)、反应的时间(不超过12小时)，首先对羧甲基壳聚糖进行季铵盐改性；再选择精氨酸或者精氨酸寡聚物在活化溶液中，通过控制催化剂用量(nhs和edc的摩尔比是1：0.1～1.0，精氨酸或精氨酸寡聚物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：0.5～10)、精氨酸或寡聚精氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比(0.02～1：1)；反应ph值(4.5～7.4)、反应时间(6～48小时)，最终经过分离纯化得到季铵盐和(寡聚)精氨酸双改性羧甲基壳聚糖衍生物。制备过程操作简单、反应时间短，可在同一反应釜中连续进行。反应条件温和，无需强酸强碱或有机溶剂，最大限度减小了对环境的污染。所用主要原料羧甲基壳聚糖来源丰富，所需设备简单，适合工业化生产。

需要注意的是：在本发明说明书中出现的所有分子结构式中，各个重复单元的排列顺序并非是完全按照结构式中所标注的顺序，而是采取无规则的排列方式在高分子链中排列组合的。

另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。

本发明的有益效果如下：

1.双改性羧甲基壳聚糖衍生物的分子链上同时修饰了具有良好抗菌性能季铵盐分子和生物相容性的(寡聚)精氨酸，在提高抗菌性能的同时又改善了生物安全性；

2.羧甲基壳聚糖具有生物可降解性，低毒，生产过程中较少污染；

3.相较于未改性的羧甲基壳聚糖，双改性羧甲基壳聚糖具有较好的抗菌性能；

4.相较于季铵盐改性壳聚糖，本发明产品产生细胞毒性的最低浓度提高十倍；

5.制备方法反应条件温和，无需高温高压处理，且不使用有机溶剂，绿色环保，可用于大规模生产。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出原料羧甲基壳聚糖的¹hnmr谱图。

图2示出本发明实施例1制备的双改性壳聚糖衍生物¹hnmr谱图。

图3示出本发明实施例1制备的双改性壳聚糖衍生物采用涂板法对金黄色葡萄球菌进行抗菌性能检测结果照片。

图4示出本发明实施例1制备的双改性壳聚糖衍生物对永生化表皮细胞hacat细胞的毒性测试结果。

图5示出对比例产品采用涂板法对金黄色葡萄球菌进行抗菌性能检测的结果照片。

图6示出对比例产品对永生化表皮细胞hacat细胞的毒性测试结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一种季铵盐和精氨酸双改性羧甲基壳聚糖衍生物，其分子结构式如下所示：

其中，x、y和z为自然数，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000。

上述季铵盐和精氨酸羧甲基壳聚糖衍生物的具体制备方法如下：

称取0.1g羧甲基壳聚糖(数均分子量为2x10⁵da，羧甲基取代度为100％，脱乙酰度为100％)加入100ml水，得到质量体积百分比浓度为0.1％的溶液；将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵加入羧甲基壳聚糖溶液中，反应12小时，得到溶液s1；将精氨酸在30mlph4.5溶液中活化(nhs和edc摩尔比为1：10)；将精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反应48小时；将与精氨酸等摩尔比的盐酸羟胺加入反应溶液，以终止反应；反应产物经分离纯化，获得分子量>5000da的终产物，即为双改性羧甲基壳聚糖衍生物。该反应中，羧甲基壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵质量比为1：0.5，羧甲基壳聚糖、精氨酸与edc摩尔比为1：1：0.5。

图1示出原料羧甲基壳聚糖的¹hnmr谱图。图2示出本发明实施例1制备的季铵盐和精氨酸双改性羧甲基壳聚糖衍生物¹hnmr谱图。通过对比双改性羧甲基壳聚糖衍生物和原料羧甲基壳聚糖的¹hnmr谱图可以发现，双改性羧甲基壳聚糖衍生物¹hnmr谱图分别在4.2～4.7ppm和1.0～1.2ppm出现季铵盐和精氨酸的特征峰。充分表明双功能基团通过氨基成功接枝到了羧甲基壳聚糖的分子链上。

图3示出本发明实施例1制备的双改性羧甲基壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌进行抗菌性能测试的结果照片。从左到右分别是采用浓度为0.01mg/ml和0.5mg/ml。该测试的具体过程为：将本实施例制备的不同浓度的双改性羧甲基壳聚糖衍生物水溶液分别与菌液混合，37℃的恒温恒湿摇床上培养12小时后涂平板。平板在37℃的恒温恒湿箱中培养48小时，做活菌菌落计数。该结果表明：本实施例制备的双改性羧甲基壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌具有良好杀灭性能。

对本实施例制备的产品采用涂板法对金黄色葡萄球菌减少率的统计结果如下表：

表1双改性壳聚糖对金黄色葡萄球菌抑菌性能测试结果

图4示出本发明实施例1制备的双改性羧甲基壳聚糖衍生物对人永生化表皮细胞hacat细胞的毒性测试结果，浓度≤0.01mg/ml时，细胞存活率>80％。

以上各数据结果说明：双改性羧甲基壳聚糖衍生物不但具有较好的抗菌性能，而且在有效抑菌浓度下细胞正常生长，具有较好的生物安全性。

实施例2