本发明主要技术方法为实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)，该技术的基本原理是以分子杂交、基因扩增、光电三项为基础，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。
背景技术：
19世纪80年代，Miller等采用DNA电泳及Southern杂交检测技术，首次证实慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0kb的HBVDNA分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋DNA分子，首次发现并报道了HBVcccDNA的存在。此后，学者们不断进行探索，20世纪90年代，PCR技术开始应用于HBVcccDNA的检测。Kock等建立了选择性PCR方法检测人PBMC中的HBVcccDNA，该方法利用rcDNA结构上存在缺口的特点，设计了跨越缺口的引物，使结构完整的HBVcccDNA得以选择性扩增；但当rcDNA浓度较高时，高于105copy即可出现非特异的扩增产物，影响了该方法的特异性，也限制了其的进一步应用。Addison等在以上Kock等方法的基础上通过引入竞争性PCR，初步实现了HBVcccDNA的定量检测，并将其用于鸭肝组织中HBVcccDNA的检测，此方法先将PCR产物酶切，再将酶切产物电泳，最后对待测标本进行密度扫描后得出其中HBVcccDNA的相对含量，即该方法未实现对HBVcccDNA的定量检测。香港学者He等建立了选择性实时荧光定量PCR方法，对HBVcccDNA进行定量检测；该方法通过加入荧光探针将普通PCR法的终点检测变为实时动态检测，在很大程度上避免了rcDNA的非特异性扩增，但此法对扩增模板未用能降解rcDNA的酶处理，亦影响了其扩增的特异性。尽管学者们不断改进检测HBVcccDNA的方法，但特异性和敏感度仍是目前HBVcccDNA检测技术所面临的主要问题。同时，先前研究多集中于对细胞模型和动物的
肝脏模型中HBVcccDNA的检测应用。迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定的并得到相关部门正式批准的用于检测HBVcccDNA试剂盒的问世，因此，建立一种快速、灵敏、特异地检测肝细胞内HBVcccDNA方法十分必要。
技术实现要素：
鉴于目前技术存在的上述不足，本发明提供肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，本发明能实现对肝组织中HBVcccDNA、β-actin进行灵敏，特异的扩增，并通过β-actin的测定，实现HBVcccDNA在肝细胞中的量化，可用于临床肝组织及肝细胞中HBVcccDNA的检测及应用。
本发明的采用如下技术方案：
肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，包括以下步骤：
提取肝组织中基因组DNA标本；
构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品；
以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增。
作为本发明的优选技术方案，所述提取肝组织中基因组DNA标本的步骤包括：
将肝组织磨碎，移入1.5mlEP管中，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；
在上述悬浮液中加入20μl蛋白酶K溶液并混匀得到第一混合溶液，其中混匀条件为56℃，3h；
将上述第一混合溶液进行离心后加入200μl缓冲液GB并混匀得到第二混合溶液，其中混匀条件为70℃，10min；
将上述第二混合溶液进行离心后加入200μl无水乙醇震荡混匀得到第三混合溶液，其中震荡时间为15sec；
将上述第三混合溶液加入吸附柱CB3中，其中吸附柱放入收集管中；
将吸附柱CB3中溶液在12,000rpm条件下进行离心30sec弃废液，加入500μl缓冲液GD得到第四混合溶液；
将第四混合溶液在12,000rpm条件下离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW得到第五混合溶液；
将第五混合溶液在12,000rpm，离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW并弃废液，将吸附柱放入收集管中后在12,000rpm条件下，离心2min得到第六混合溶液；
将第六混合溶液弃废液，吸附柱置于室温数分钟后将吸附柱转入一清洁EP管中，悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，然后室温放置5min，12,000rpm，离心2min得到洗脱的DNA。
作为本发明的优选技术方案，所述构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品的步骤包括：
β-actin实时荧光定量PCR引物、探针的设计与合成，其中β-actin引物、探针序列为：
上游F5＇-CTGCAGGTCGACGATTGGACTCCGGTGACGGGGTCA-3＇
下游R5＇-GGATCCTCTAGAGATTATGACCTGGCCGTCAGGCAG-3＇
探针P5＇-(FAM)CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC(Eclipse)-3＇
β-actin质粒标准品的反应体系为：PremixExTaqTM12.5μl，F1μl，R1μl，探针P1μl，模板2μl，dH2O8.5μl，其中所述F、R的浓度为10μmol/L，探针P的浓度为5μmol/L，反应条件为：95℃30sec，95℃5sec、55℃10sec、72℃20sec，45个循环。
作为本发明的优选技术方案，所述以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增的步骤包括：
对提取模板进行PSAD酶切纯化：所述模板PSAD酶切的反应体系为核酸提取产物10μL，PSAD酶1μL，25mMATPSoLution0.8μL，10xReactionBuffer2μL，dH2O6.2μL，其中PSAD酶的浓度为10U/μl，其中反应条件为：37℃水浴1h酶切消化，然后70℃水浴30min灭活PSAD酶；
第一轮普通PCR扩增得到扩增产物，其中反应体系为：酶切后产物2μl，P11μl，P21μl，2xMix12.5μl，dH2O9.5μl，其中P1、P2的浓度为5μmol/L，反应条件为：93℃5min，93℃45sec，58℃45sec，15个循环。
作为本发明的优选技术方案，所述将上述扩增产物用内引物和荧光探针进行定量PCR扩增，其中反应体系为第一轮PCR产物1μl，P31μl，P41μl，探针1μl，RealMasterMix(2.5x)10μl，20xProbeEnhancer1.25μl，dH2O11.75μl，其中所述P3、P4、探针的浓度为5μmol/L，其中反应条件：93℃3min，93℃20sec，55℃30sec，45个循环。
本发明的肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，具有以下有益效果：
1、通过设计一内一外两套特异性引物，进行两次PCR扩增。既通过扩增多个靶位点提高了特异性；又经过两次扩增有效地增加了靶序列，从而极大提高检测的灵敏性。我们先用外引物进行定性PCR扩增，再将第一轮扩增产物用内引物和荧光探针进行定量PCR扩增。再将扩增产物的测序结果应用DNAStar软件与HBV不同基因型(A～G)比较后同源性达90.6％～99.1％，且该方法的检测下限可达102copies/ml，提示该方法的特异性、灵敏度良好，并已用于PBMC中HBVcccDNA检测。
2、可以实现对肝组织中HBVcccDNA、β-actin进行灵敏、特异的扩增，并通过β-actin的测定，实现HBVcccDNA在肝细胞中的量化，可用于临床肝组织及肝细胞中HBVcccDNA的检测及应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，包括以下步骤，
步骤S1：提取肝组织中基因组DNA标本，具体为将肝组织磨碎，移入1.5mlEP管中，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；在上述悬浮液中加入20μl蛋白酶K溶液并混匀得到第一混合溶液，其中混匀条件为56℃，3h；将上述第一混合溶液进行离心后加入200μl缓冲液GB并混匀得到第二混合溶液，其中混匀条件为70℃，10min；将上述第二混合溶液进行离心后加入200μl无水乙醇震荡混匀得到第三混合溶液，其中震荡时间为15sec；将上述第三混合溶液加入吸附柱CB3中，其中吸附柱放入收集管中；将吸附柱CB3中溶液在12,000rpm条件下进行离心30sec弃废液，加入500μl缓冲液GD得到第四混合溶液；将第四混合溶液在12,000rpm条件下离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW得到第五混合溶液；将第五混合溶液在12,000rpm，离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW并弃废液，将吸附柱放入收集管中后在12,000rpm条件下，离心2min得到第六混合溶液；将第六混合溶液弃废液，吸附柱置于室温数分钟后将吸附柱转入一清洁EP管中，悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，然后室温放置5min，12,000rpm，离心2min得到洗脱的DNA；
上述步骤S1更具体为：采用北京天根组织基因组DNA提取试剂盒提取肝组织中基因组DNA)其中具体步骤包括：
步骤S2：构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品，具体包括，β-actin实时荧光定量PCR引物、探针的设计与合成，其中β-actin引物、探针序列为：
上游F5＇-CTGCAGGTCGACGATTGGACTCCGGTGACGGGGTCA-3＇
下游R5＇-GGATCCTCTAGAGATTATGACCTGGCCGTCAGGCAG-3＇
探针P5＇-(FAM)CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC(Eclipse)-3＇；其中β-actin质粒标准品的反应体系为：PremixExTaqTM12.5μl，F1μl，R1μl，探针P1μl，模板2μl，dH2O8.5μl，其中F、R的浓度为10μmol/L，探针P的浓度为5μmol/L，反应条件：95℃30sec，95℃5sec、55℃10sec、72℃20sec，45个循环。
步骤S3：以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增的步骤中具体为，P1.2Ⅱ质粒(含HBV基因组全序列)扩增，经电泳及测序鉴定后，用质粒提取试剂盒提取，再用ScanDrop超微量紫外分光光度计检测质粒总浓度(ng/ml)及纯度，取3次检测值的平均值作为终浓度。最终，计算出质粒DNA的拷贝数，将此溶液依次10倍梯度稀释后的溶液作为检测HBVcccDNA的标准品。以此标准品对标本的HBVcccDNA进行扩增得到扩增产物，首先对模板PSAD酶切纯化，具体反应体系为核酸提取产物10μL，PSAD酶1μL，25mMATPSoLution0.8μL，10xReactionBuffer2μL，dH2O6.2μL，其中PSAD酶的浓度为10U/μl，其中反应条件为：37℃水浴1h酶切消化，然后70℃水浴30min灭活PSAD酶；再进行第一轮普通PCR扩增得到扩增产物，其中反应体系为：酶切纯化后产物2μl，P11μl，P21μl，2xMix12.5μl，dH2O9.5μl，其中P1、P2的浓度为5μmol/L，反应条件为：93℃5min，93℃45sec，58℃45sec，15个循环。
在步骤S3中：将上述扩增产物用内引物和荧光探针进行定量PCR扩增，具体包括：将扩增产物进行第二轮实时荧光定量PCR扩增，其中反应体系为第一轮PCR产物1μl，P31μl，P41μl，探针1μl，RealMasterMix(2.5x)10μl，20xProbeEnhancer1.25μl，dH2O11.75μl，其中所述P3、P4、探针的浓度为5μmol/L，其中反应条件为：93℃3min，93℃20sec，55℃30sec，45个循环。
本发明主要的实现的方式为：首先构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品：以成人外周血细胞的总RNA为模板、反转录合成cDNA，用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA目的片段，再以pMD18-T为载体，构建形成重组质粒，电泳、鉴定测序后，用荧光定量PCR制作β-actin标准曲线。其次，利用HBVcccDNA与rcDNA结构上的差异，设计检测HBVcccDNA的特异性引物及探针，以含HBV基因组全序列的P1.2Ⅱ质粒为检测HBVcccDNA的标准品，建立标准曲线。将肝组织标本中提取的DNA分为2等份，1份经质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切，作为检测HBVcccDNA的模板，另1份不酶切作为检测β-actin的模板，进行肝组织β-actin的定量测定，并以β-actin为参比，对每个肝细胞HBVcccDNA的含量进行标准化。
在本发明中，将巢式-实时定量PCR检测方法应用于肝组织及肝细胞中HBVcccDNA含量的检测；HBVcccDNA存在及复制的场所均为被感染的肝细胞核，所以检测肝组织中HBVcccDNA是最有说服力的指标，能准确反映乙肝病毒在肝细胞内感染的状态及复制的程度。
本发明构建的β-actin质粒标准品可以对肝组织中的β-actin含量进行准确定量。我们以β-actin为内参照基因，可以通过其拷贝数的测定实现对细胞计数，进一步对实现不同物质在细胞中的量化也具有重要的意义，此β-actin质粒标准品具有一定的应用价值，可用于进一步的临床实验。在此基础上，我们将本研究所建立的β-actin质粒标准品用于检测肝组织标本中β-actin的含量；同时进行检测肝组织中HBVcccDNA标准品的构建，不同浓度的HBVcccDNA阳性标准品的PCR扩增曲线均呈S型、较光滑，且模板的浓度与其相应的Ct值具有较好的线性关系，空白对照、阴性对照无扩增曲线，相关系数R2＝0.998，检测的灵敏度可以达到102copy/ml，重复检验阳性参照标准品，均为阳性结果，采用t检验统计，比较组间差异无统计学意义(P＞0.05)，提示该方法重复性好，结果可靠。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。