取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于荧光探针化合物的合成技术领域，具体涉及一种取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

汞是一种重金属，俗称水银。离子形态的Hg²⁺具有较高的化学活性，是造成环境污染的主要重金属离子之一，在浓度很低时对生物体就表现出极强的生理毒性。无机汞对人类的危害主要在肾脏方面，而通过环境中的微生物转化生成的甲基汞则会对人类造成多种心脑血管方面的疾病，且这两种形态下的汞都会经生物富集作用最终转移到人类体内，并且无法通过自身代谢作用将汞排出体外，严重危害人类的身体健康。因此，对生物体和环境中汞的分析检测一直是人们非常关注的问题，建立快速、高效的汞离子检测方法在生命科学、医学和环境保护等领域中具有重大意义。

传统的汞离子测定方法有：紫外分光光度法、原子吸收/发射法、生物传感器法、电感耦合等离子体质谱法和电化学法等，上述几种传统的检测方法虽然可以完成对不同体系样品的汞含量检测，但它们对仪器的设备要求很高，价格昂贵，并要求有大量的待测样品，而且不允许连续检测，这些方法的自身局限性制约着对各种待测样品特别是生物体内的即时检测与痕量分析。

荧光分析法在汞的痕量检测中发挥着极大的作用，利用探针分子的荧光信号来表示荧光受体与分析对象发生作用后的光化学信息变化来判断某一特定物质是否存在，其通常以激发光谱和发射光谱为重要参数，具有高灵敏度、高选择性、快速以及检测便捷等优点。因此，近年来荧光分子探针成为在重金属离子和过渡金属离子识别检测研究领域的热点，广泛应用于环境分析和生物细胞成像研究。荧光分子探针分为络合型和反应型两种，络合型荧光探针基于非共价键的超分子相互作用，主要是配位键和氢键作用；反应型荧光探针直接与检测对象发生化学反应，生成不同结构的光活性化合物，使荧光分子探针的光谱性质发生变化，从而实现光学传感。

罗丹明类化合物具有光稳定性好，荧光量子产率高等光物理性质使其被广泛应用为荧光发色基团，其在氢离子或某些金属阳离子作用下可以开环，荧光显著增强且伴随着颜色的变化，因此，基于罗丹明螺环“off-on”机理的反应型金属离子荧光探针成为近年来研究的重点与热点。由于Hg²⁺具有嗜硫性，它可以促进硫羰基化合物发生脱硫反应，生成相应的羰基化合物及硫化汞沉淀，例如Hg²⁺诱导硫脲类衍生物脱硫化生成胍。这使得设计含硫罗丹明类荧光探针有了理论依据。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物，该化合物由于其结构的特殊性可以与重金属汞离子发生相互作用，最终实现检测痕量重金属汞离子的目的。

本发明解决的另一个技术问题是提供了一种工艺流程简单且成本相对低廉的取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物的制备方法。

本发明还解决的技术问题是该取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物在作为检测重金属汞离子有机分子荧光探针中的应用。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物，其特征在于化学结构式为：，其中R为Cl、OMe或CF₃。

本发明所述的取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物的制备方法，其特征在于具体步骤为：

步骤（1），在反应容器中将罗丹明B溶于乙醇中，再加入水合肼水溶液，于85℃的油浴中回流反应，TLC监控原料反应完全后加入蒸馏水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取反应体系，收集有机相后减压蒸馏得到罗丹明B酰肼化合物；

步骤（2），在反应容器中加入2-取代苯异硫氰酸酯类化合物和步骤（1）得到的罗丹明B酰肼化合物，再加入异丙醇，于85℃的油浴中搅拌回流反应，TLC监控原料反应完全后降至室温，减压蒸馏除去溶剂并加入中性氧化铝对其干法拌样，使用中性氧化铝作为固定相进行柱层析分离纯化得到取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物。

进一步优选，步骤（1）中所述水合肼水溶液的质量浓度为80%，水合肼与罗丹明B的摩尔比为20:3。

进一步优选，步骤（2）中所述2-取代苯异硫氰酸酯类化合物与罗丹明B酰肼化合物的摩尔比为1.5:1。

本发明所述的取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物在作为检测重金属汞离子有机分子荧光探针中的应用。

本发明的取代罗丹明B酰胺基硫脲类荧光探针化合物表现出较好的抗干扰能力，能够较为准确地检测痕量重金属汞离子，并且选择性和灵敏度较好。

附图说明

图1是邻氯基罗丹明探针RBS1对不同金属离子的选择性识别曲线；

图2是邻甲氧基罗丹明探针RBS2对不同金属离子的选择性识别曲线；

图3是邻三氟甲基罗丹明探针RBS3对不同金属离子的选择性识别曲线；

图4是共存离子对邻氯基罗丹明探针RBS1检测汞离子的影响图；

图5是共存离子对邻甲氧基罗丹明探针RBS2检测汞离子的影响图；

图6是共存离子对邻三氟甲基罗丹明探针RBS3检测汞离子的影响图；

图7是邻氯基罗丹明探针RBS1对汞离子的荧光测试曲线；

图8是邻甲氧基罗丹明探针RBS2对汞离子的荧光测试曲线；

图9是邻三氟甲基罗丹明探针RBS3对汞离子的荧光测试曲线；

图10是邻氯基罗丹明探针RBS1对汞离子络合的工作曲线；

图11是邻甲氧基罗丹明探针RBS2对汞离子络合的工作曲线；

图12是邻三氟甲基罗丹明探针RBS3对汞离子络合的工作曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

罗丹明B酰肼化合物的合成

取罗丹明B 1.443 g(3 mmol)移入100 mL的圆底烧瓶内，用50 mL乙醇溶解，然后用移液枪移取水合肼水溶液3 mL(80wt%，20 mmol)，此时反应体系呈深酒红色，于85℃的油浴中进行回流反应，薄层色谱检测法(TLC)监测反应进度，展开剂为体积比1:1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液，反应6小时后点板发现薄层板上原料点基本消失，比移值在约0.5位置出现罗丹明酰肼产物点，微热后产物点呈玫红色，此时反应体系由深酒红色变为土黄色，加100 mL蒸馏水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取体系，收集有机相后减压蒸馏得罗丹明酰肼化合物1.2537 g，收率91%。

实施例2

邻氯基罗丹明探针RBS1的合成

取2-氯苯异硫氰酸酯0.1260 g(0.75 mmol)和罗丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并转移至25 mL的圆底烧瓶内，然后加入5 mL干燥的异丙醇，于85℃的油浴中磁力搅拌回流反应，反应5 min后对其进行TLC监测反应，展开剂为体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料点消失，停止反应，体系降至室温后，减压蒸馏除去溶剂并加入中性氧化铝对其干法拌样，使用中性氧化铝作为固定相进行柱层析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分离纯化，产品为白色蓬松状粉末邻氯基罗丹明探针RBS1（收率80%）。

实施例3

邻甲氧基罗丹明探针RBS2的合成

取2-甲氧基苯异硫氰酸酯0.1238 g(0.75 mmol)和罗丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并转移至25 mL的圆底烧瓶内，然后加入5 mL干燥的异丙醇，于85℃的油浴中磁力搅拌回流反应，反应5 min后对其进行TLC监测反应，展开剂为体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料点消失，停止反应，体系降至室温后，减压蒸馏除去溶剂并加入中性氧化铝对其干法拌样，使用中性氧化铝作为固定相进行柱层析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分离纯化，产品为白色蓬松状粉末邻甲氧基罗丹明探针RBS2（收率82%）。

实施例4

邻三氟甲基罗丹明探针RBS3的合成

取2-三氟甲基异硫氰酸酯0.1524 g(0.75 mmol)和罗丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并转移至25 mL的圆底烧瓶内，然后加入5 mL干燥的异丙醇，于85℃的油浴中磁力搅拌回流反应，反应5 min后对其进行TLC监测反应，展开剂为体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料点消失，停止反应，体系降至室温后，减压蒸馏除去溶剂并加入中性氧化铝对其干法拌样，使用中性氧化铝作为固定相进行柱层析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分离纯化，产品为白色蓬松状粉末邻三氟甲基罗丹明探针RBS3（收率67%）。

实施例5

荧光光谱的测定

1、荧光光谱测定条件

激发狭缝宽度5.0 nm，发射狭缝宽度3.0 nm，激发波长λex为566 nm或568 nm，响应时间1 s，波长范围500-700 nm，灵敏度为medium，样品池选择1 cm×1 cm×4 cm的四通石英比色皿。

准确称取0.0125 g RBS1、0.0122 g RBS2和0.0132 g RBS3，分别用二甲亚砜溶液(DMSO)溶解于10 mL容量瓶中并定容，摩尔浓度均为2×10^-3 mol/L。取0.5 mL母液于另一支10 mL容量瓶中用DMSO定容，此时荧光探针化合物摩尔浓度为1×10^-4 mol/L。再用HEPES缓冲溶液配制1×10^-3 mol/L的多种金属盐溶液，同样稀释至1×10^-4 mol/L。

其中RBS1和RBS3的测试条件为Ex=5 nm，Em=3 nm，灵敏度为中，RBS2的测试条件为Ex=3 nm，Em=3 nm，灵敏度为高。测试条件的区别初步表明邻位为供电子取代基团的荧光探针化合物RBS2相对荧光强度较弱。

2、吸电子效应不同造成对汞离子的选择性识别的影响

（1）荧光探针化合物对不同金属离子的选择性识别

为了测定三种荧光探针化合物对不同金属离子的识别性能，分别选择过渡金属(Fe³⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Ag⁺)、碱金属(K⁺、Na⁺)和碱土金属(Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺)为识别对象。如图1-3所示，除细胞内浓度较大的Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的摩尔浓度为20 μM外，其余金属离子及荧光探针化合物的摩尔浓度均为1 μM。结果显示在分别加入空白荧光探针化合物溶液以及K⁺、Na⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺离子时，体系在最大发射波长589 nm处几乎没有荧光，溶液无色，表明此时荧光探针化合物主要以螺环的形式存在，而在加入Hg²⁺后，体系在最大发射波长589 nm处荧光明显增强，溶液颜色由无色变为桃红色，说明Hg²⁺能够诱导荧光探针化合物中的电子发生转移从而导致螺环结构打开。实验结果表明三种荧光探针化合物RBS1、RBS2和RBS3均对Hg²⁺有较高的识别能力。

（2）共存离子对三种荧光探针化合物检测重金属汞离子的影响

本实验考察了其它金属离子和Hg²⁺共存时对Hg²⁺测定的干扰，令三种荧光探针化合物的摩尔浓度均为10 μM，除Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺的摩尔浓度为0.50 mM(50 equiv)外，其它金属离子的摩尔浓度均为0.1 mM(10equiv)，如图4-6所示，黑色柱状图表示在探针分子与不同的竞争离子分别共存情况下的荧光强度，灰色柱状图表示分别加入1 equiv Hg²⁺后各体系内的荧光强度。从图表数据可以看出在共存离子(尤其是Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺的摩尔浓度为Hg²⁺摩尔浓度的50倍)存在的条件下，三种荧光探针化合物RBS1、RBS2和RBS3对其它金属离子均表现出较强的抗干扰能力。因此，荧光探针化合物RBS1、RBS2和RBS3都是对Hg²⁺有较高选择性的荧光增强型探针。

（3）三种荧光探针化合物检测限的测定

不同Hg²⁺浓度条件下三种荧光探针化合物的发射光谱如图7-9所示，在三种荧光探针化合物的最大发射波长(589 nm)处，随着Hg²⁺浓度的逐渐增大，其最大荧光强度不断增强，表明荧光探针化合物RBS1、RBS2和RBS3与Hg²⁺之间均存在良好的作用关系。

进一步研究发现，如图10-12所示，Hg²⁺浓度在1×10^-7-1×10^-6 mol/L范围内与荧光探针化合物RBS1、RBS2和RBS3的荧光强度均呈现出良好的线性关系，对应的曲线方程式分别为y=60.297x+1.067、y=50.873x+12.201和y=20.036x-9.600，这表明三种荧光探针化合物可以在一定范围内定量检测重金属Hg²⁺的含量。

由公式LOD=3σ/K(σ为标准方差，n=6)可以算出其检测限依次为0.6x10^-7 mol/L、0.76x10^-7 mol/L和1.65x10^-7 mol/L，由此可知苯环上邻位取代基为供电子取代基时荧光探针对汞离子识别的灵敏度较差，苯环上邻位取代基为吸电子取代基时荧光探针对汞离子识别的灵敏度较好，其灵敏度随着吸电子强度增大而增高。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。