含卤代丙烯酰胺侧链的嘧啶类衍生物及制备和应用的制作方法

本发明属于制药领域，具体涉及一种含卤代丙烯酰胺侧链的嘧啶衍生物、制备方法及其应用。

背景技术：

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因HER1的表达产物，具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性。原癌基因的激活即基因变异是导致肿瘤发生的原因之一。EGFR在细胞周期中起重要作用，与细胞生长、增殖、迁移有关。研究表明，超过60％的恶性肿瘤科出现一种或几种EGFR家族受体过表达或突变。尽管在过去的时间里，EGFR抑制剂在肿瘤治疗中得到了快速发展，但仍留有大量的研究空间，靶点的突变所导致的治疗抗药性对靶向抗肿瘤药物的研究提出了新的挑战，不可逆抑制剂(包括Afatinib、Dacomitinib、Neratinib等)可与EGFR酪氨酸激酶以共价键结合，可以对抗T790M突变，克服了T790M引起的耐药。其中，近FDA已批准勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)开发的afatinib片以商品名Gilotrif上市，作为一种口服的、新的一线治疗药物，证实可以用于肿瘤表皮生长因子受体(EGFR)19号外显子缺失或21号外显子突变(L858R)的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗。Afatinib是首个不可逆ErbB家族阻断剂，该药积极的临床证据，加上全新的作用模式，使其成为一种杰出的治疗选择，有望为肺癌患者提供其急需的临床需求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种含卤代丙烯酰胺侧链的嘧啶类衍生物，具有以下结构通式I：

其中：

R₁为卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基和含氮杂环。

R₂为甲基或乙酰基。

R₃为氢、卤素或者三氟甲基。

X为氧原子或者氨原子。

Y为三氟甲基，卤素原子。

本发明所述的一种含卤代丙烯酰胺嘧啶衍生物为如下任一化合物：

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例1)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例2)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-苯基丙烯酰胺(实施例3)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(实施例4)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例5)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(实施例6)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例7)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例8)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例9)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例10)；

N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例11)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(实施例12)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例13)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例14)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例15)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例16)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例17)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(实施例18)；

N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例19)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例20)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例21)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例22)；

N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺(实施例23)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例24)；

N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例25)；

N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例26)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例27)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺(实施例28)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例29)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例30)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例31)；

N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺(实施例32)；

本发明的另一个目的是提供所述的一种含卤代丙烯酰胺侧链的嘧啶衍生物的制备方法，通过以下步骤实现：

以2，5-二氯嘧啶a为起始原料，和(3-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯(或者是(3-羟基苯基)氨基叔丁酯)b在正丁醇中反应生成中间体c，中间体c在稀盐酸作用下在正丁醇中回流得到5-位取代的中间体d，中间体d结构中的叔丁基保护基在三氟乙酸作用下，脱保护得到游离氨基结构的中间体e，最后与各种卤素取代的丙烯酰氯缩合反应得到目标化合物I；反应式为：

其中取代基的定义同上通式I化合物所述，反应条件：i)二异丙基乙胺，正丁醇，室温；ii)稀盐酸，正丁醇，回流；iii)三氟乙酸，二氯甲烷，冰浴；iv)含卤素丙烯酰氯，三乙胺，二氯甲烷，冰浴到室温。

本发明所涉及的原料或中间体，可直接购买，或按照实施例中提及的文献方法制备。

本发明制备方法中所述的式I化合物，可以使用上面所描述的方法来制备本发明的化合物，将理解的是当给出典型的或优选的工艺操作条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等等)，还可以使用其他工艺操作条件，除非另有说明。最佳反应条件可以随所用的具体反应物或溶剂而变化，但这些条件可以由本领域技术人员通过常规最佳化过程加以确定。通常，可以使用如上所述的反应路线及工艺制备本发明化合物，但并不限于反应条件中的试剂和溶剂。

本发明的再一个目的是提供所述的含卤代丙烯酰胺嘧啶衍生物在制备抗肿瘤细胞和靶向EGFR激酶药物中的应用，所述肿瘤细胞是指过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975和低表达EGFR人结肠癌细胞株SW620，所述EGFR激酶是指野生型EGFR激酶和[L858R/T790M]突变的EGFR激酶。

本发明提供了一类全新的含卤代丙烯酰胺嘧啶衍生物，其中含卤素的丙烯酰胺侧链可作为新型的不可逆共价反应官能团，实验数据显示，其在分子水平上对野生型和[L858R/T790M]突变的EGFR酪氨酸激酶具有较佳的抑制作用，且对[L858R/T790M]突变的EGFR激酶选择性高，在细胞水平上对与EGFR酪氨酸激酶活性相关的肿瘤细胞也具有显著的增殖抑制作用，对低表达EGFR人结肠癌细胞株SW620的抑制活性较弱，可制备相应的抗肿瘤药物，为设计新型克服Gefitinib耐药的EGFR抑制剂提供可能。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺；

步骤1：3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基苯的制备

原料1:3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯按照文献Cancer Discov.2013,12,1404-1415的方法制备；

将3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯(537mg，1mmol)溶于二氯甲烷(2ml)中，随后滴加三氟乙酸(2ml)，反应过夜。待反应结束后，将反应液减压旋蒸得到棕红色黏液，随后滴加乙醚(5ml)，溶液中析出固体，抽滤得到黄色固体(400mg)，粗产品收率为95％，该产物直接进行下步反应。

步骤2：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺的制备

将上一步得到的产物(400mg)溶解在二氯甲烷(5mL)中，冷至0℃-2℃滴入2-氯丙烯酰氯(124mg，1mmol)，随后滴加三乙胺(235ul，4mmol)，继续低温反应过夜。待反应完全，加入水，用二氯甲烷萃取，取有机层减压旋蒸，柱层析色谱纯化(流动相为CH₂Cl₂:MeOH＝100：1)，回收、干燥即得白色固体产物130mg，产率为28.8％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.34(s,1H),8.05(d,J＝13.0Hz,2H),7.43(d,J＝8.8Hz,2H),7.33(d,J＝5.3Hz,2H),7.14(s,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.73(d,J＝1.0Hz,1H),5.92(s,1H),3.79–3.74(m,2H),3.64–3.59(m,2H),3.14-3.05(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H+)：562.1521。

按照实施例1相同方法，采用不同原料，制备以下化合物。

实施例2：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将步骤2中的2-氯丙烯酰氯换成2-氟丙烯酰氯反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体，¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.07(d,J＝20.1Hz,2H),7.95(s,1H),7.43-7.40(m,3H),7.35–7.32(m,2H),7.07(d,J＝33.0Hz,2H),6.87(d,J＝7.9Hz,2H),5.84(d,J＝48.4Hz,1H),5.27(d,J＝14.8Hz,1H),3.77-3.61(m,4H),3.10-3.08(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):510.1829。

实施例3：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-苯基丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将步骤2中的2-氯丙烯酰氯换成2-苯基丙烯酰氯反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.28(s,1H),9.11(s,1H),8.89(s,1H),8.09(s,1H),7.97(s,1H),7.48-7.47(m,5H),7.37-7.35(m 5H),6.76(d,J＝6.9Hz,2H),5.95(s,1H),5.73(s,1H),3.52(m,4H),2.98-2.92(m,4H),2.02(s,3H).ESI(M+H⁺):568.2236。

实施例4：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将步骤2中的2-氯丙烯酰氯换成2-三氟甲基丙烯酰氯反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.17(s,1H),8.91(s,1H),8.17(s,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.51(d,J＝8.9Hz,2H),7.28(s,1H),7.06(d,J＝7.9Hz,1H),6.92–6.82(m,3H),3.60–3.55(m,4H),3.09–3.02(m,2H),3.03–2.96(m,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1781。

实施例5：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,1H),8.04–7.94(m,2H),7.46-7.43(t,,2H),7.39–7.34(m,2H),7.10(s,1H),6.54(d,J＝2.3Hz,1H),6.42(d,J＝8.7Hz,1H),5.90-5.79(m,1H),5.30-5.24(m,1H),3.88(s,3H),3.80–3.76(m,2H),3.65–3.60(m,2H),3.12–3.06(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):540.1928。

实施例6：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

参照实施例5的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,1H),7.75(s,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),7.38(d,J＝7.4Hz,2H),7.36-7.34(m,3H),7.36-7.34(m,1H),7.20(d,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.52(d,J＝2.3Hz,1H),3.85(s,3H),3.78-3.76(m,2H),3.62-3.60(m,2H),3.08-3.05(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):590.1890。

实施例7：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.12(d,J＝8.7Hz,1H),8.06(s,1H),8.01(d,J＝11.8Hz,1H),7.46(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.7Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(s,1H),6.74(d,J＝1.3Hz,1H),6.53(d,J＝2.1Hz,1H),6.42(d,J＝8.6Hz,1H),5.93(d,J＝1.3Hz,1H),3.88(s,3H),3.79–3.76(m,2H),3.64–3.61(m,2H),3.13–3.06(m,4H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):566.1632。

实施例8：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.21(d,J＝6.4Hz,1H),9.67(s,1H),8.53(s,1H),8.32(s,1H),7.78(s,1H),7.41(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝6.9Hz,2H),7.24(d,J＝6.9Hz,1H),7.05(s,1H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H),5.71(dd,J＝47.5,2.8Hz,1H),5.43(dd,J＝15.3,3.1Hz,1H),3.60(s,4H),3.11(d,J＝35.4Hz,4H),2.06(s,3H).ESI(M+H+)：544.2081.

实施例9：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺。

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.40(s,1H),8.14(s,1H),8.08(s,1H),7.62-7.58(m,1H),7.44(d,J＝8.7Hz,1H),7.37(t,1H),7.13(s,1H),7.08(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),6.85-6.81(m,1H),6.74(d,J＝1.2Hz,1H),5.93(d,J＝1.2Hz,1H),3.80–3.77(m,2H),3.64–3.61(m,2H),3.03–2.97(m,4H),2.14(s,3H),1.65(s,3H).ESI(M+H+):590.1990。

实施例10：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.31(s,1H),9.44(s,1H),8.38(s,1H),7.86(s,1H),7.37(m,2H),7.14(m,3H),5.68(d,J＝47.5Hz,1H),5.54–5.43(m,2H),5.33(d,J＝14.1Hz,1H),3.60(s,4H),2.97(d,J＝31.6Hz,4H),2.05(s,3H).ESI(M+H⁺):544.1429。

实施例11：N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.23(s,1H),8.02(s,1H),7.63(d,J＝7.0Hz,2H),7.51(s,1H),7.46(t,J＝8.1Hz,2H),7.05(d,J＝7.5Hz,1H),6.45(s,1H),6.20(s,1H),5.88-5.78(m,1H),5.31–5.23(m,1H),3.81(s,3H),3.11(m,4H),2.58(m,4H),2.36(s,3H).ESI(M+H⁺):513.1819。

实施例12：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

参照实施例5的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.30(s,1H),8.04(s,1H),7.85(s,1H),7.60(s,1H),7.45(t,1H),7.37(s,2H),6.87(s,1H),6.58(s,1H),6.49(s,1H),6.34(s,1H),3.86(s,3H),3.75(s,2H),3.61(s,2H),3.07(d,J＝17.2Hz,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):624.6266。

实施例13：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.25(s,1H),8.03(d,J＝4.5Hz,1H),7.66(d,J＝7.4Hz,2H),7.49-7.45(m,3H),7.06-7.04(m,1H),6.46(d,J＝1.9Hz,1H),6.19(s,1H),5.88-5.78(m,1H),5.29-5.25(m,1H),3.83(s,3H),3.78–3.73(m,2H),3.64–3.58(m,2H),3.10–2.97(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):541.1763。

实施例14：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.15(s,1H),8.10–8.01(m,2H),7.58(d,J＝14.5Hz,1H),7.44–7.33(m,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.18(s,1H),7.13(s,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(t,1H),5.89-5.79(m,1H),5.28-5.25(m,1H),3.78(m,2H),3.62(m,2H),3.01-2.97(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):528.1725。

实施例15：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.06(s,2H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.36–7.32(m,3H),7.28(s,1H),7.12(s,1H),6.99(s,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),6.74(d,J＝1.2Hz,1H),5.93(d,J＝1.2Hz,1H),3.75-3.71(m,2H),3.61–3.57(m,2H),2.87–2.80(m,4H),2.27(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):540.1682。

实施例16：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.53(s,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),8.36(s,1H),8.29(s,1H),7.71-7.69(m,1H),7.39(d,J＝8.1Hz,1H),7.33(t,1H),7.24(d,J＝7.5Hz,1H),7.22-7.20(m,2H),5.86-5.76(m,1H),5.26-5.23(m,1H),3.90(s,3H),2.67(s,6H).ESI(M+H⁺):465.1605。

实施例17：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例3的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(d,J＝9.8Hz,2H),7.95(s,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),7.35-7.30(m,4H),7.11(s,1H),6.96(s,1H),6.94–6.87(m,1H),5.90-5.80(m,1H),5.30-5.26(m,1H),3.75–3.72(m,2H),3.62–3.56(m,2H),2.88–2.79(m,4H),2.28(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):524.1978。

实施例18：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

参照实施例5的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(s,1H),7.88(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(t,1H),7.30-7.28(m 1H),7.11(s,1H),7.02(d,J＝7.8Hz,1H),6.98(s,1H),6.92(d,J＝8.6Hz,1H),3.75(t,2H),3.60(t,2H),2.88–2.82(m,4H),2.27(s,3H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):547.1962。

实施例19：N-[3-[[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.43(s,1H),8.23(s,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.53(t,1H),7.46(t,2H),7.06-7.04(m,1H),6.73(d,J＝1.3Hz,1H),6.45(d,J＝2.3Hz,1H),6.21(s,1H),5.92(d,J＝1.4Hz,1H),3.82(s,3H),3.15–3.04(m,4H),2.61–2.54(m,4H),2.37(s,3H).ESI(M+H⁺):529.1519。

实施例20：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例20的方法，只是将原料2-氟丙烯酰氯换成2-氯丙烯酰氯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.01(s,1H),8.55(d,J＝8.0Hz,1H),8.50(d,J＝2.5Hz,1H),8.37(s,1H),8.28(s,1H),7.71-7.69(m,1H),7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.36–7.30(m,1H),7.26(s,1H),7.24(d,J＝7.1Hz,1H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),6.71(d,J＝1.3Hz,1H),5.91(d,J＝1.3Hz,1H),3.89(s,3H),2.69(s,6H).ESI(M+H⁺):481.1311。

实施例21：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-甲氧基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.47(s,1H),8.24(s,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.51-7.45(m,3H),7.06-7.04(m,1H),6.72(d,J＝1.4Hz,1H),6.46(d,J＝2.2Hz,1H),6.20(s,1H),5.93(d,J＝1.3Hz,1H),3.83(s 3H),3.79–3.72(m,2H),3.63–3.57(m,2H),3.10–2.98(m,4H),2.14(s,3H).ESI(M+H⁺):557.1467。

实施例22：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.12(s,1H),8.06(s,1H),7.60-7.56(m,1H),7.42(d,J＝8.7Hz,1H),7.35(t,1H),7.11(s,1H),7.06(s,1H),7.01-6.99(m,1H),6.81(t,1H),6.72(d,J＝1.2Hz,1H),5.91(d,J＝1.2Hz,1H),3.76(t,3H),3.61(t,3H),3.00–2.95(m,4H),2.12(s,3H).ESI(M+H⁺):544.1431。

实施例23：N-[2-[(2，2-二甲基氨基)5-[[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-(5-氯)-嘧啶基]氨基]苯基]-2-三氟甲基丙烯酰胺

参照实施例20的方法，只是将原料2-氟丙酰氯换成2-三氟甲基丙烯酰氯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ11.78(s,1H),8.69(d,J＝7.6Hz,1H),8.40(s,1H),8.24(s,1H),8.16(d,J＝8.8Hz,1H),7.40(d,J＝7.7Hz,1H),7.37-7.35(m,1H),7.34-7.33(m,1H),7.31-7.30(m,1H),7.19(d,J＝8.8Hz,1H),5.83(s,1H),3.91(s,3H),2.62(s,6H).ESI(M+H⁺):515.1572。

实施例24：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例15的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(三氟甲基)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.31(s,1H),8.24(s,1H),7.81(s,1H),7.49(d,J＝3.0Hz,1H),7.40(d,J＝8.9Hz,2H),7.33(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(t,1H),6.93–6.90(m,2H),6.78(s,1H),6.72(d,J＝1.3Hz,1H),5.91(d,J＝1.3Hz,1H),3.79–3.76(m,2H),3.65-3.63(m,2H),3.19-3.14(m,4H),2.16(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1793。

实施例25：N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.18(s,1H),9.14(s,1H),8.90(s,1H),8.27(s,1H),8.10(s,1H),7.92(s,1H),7.84(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),7.46(d,J＝7.4Hz,1H),7.35(d,J＝24.0Hz,1H),7.31(t,J＝8.0Hz,1H),6.66(d,J＝7.9Hz,1H),6.41(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(d,J＝2.6Hz,1H),3.54-3.51(m,4H),3.41–3.38(m,2H),3.31(m,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):527.1480。

实施例26：N-[3-[[2-[[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)吡啶基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例29的方法，只是将原料2-氯丙烯酰氯换成2-氟丙烯酰氯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)，得到白色固体。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.27(d,J＝2.6Hz,1H),8.14(s,1H),8.04(s,1H),7.97(d,J＝2.5Hz,1H),7.82(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),7.38–7.28(m,3H),7.11(s,1H),6.89(s,1H),6.63(d,J＝9.0Hz,1H),5.84(dd,J＝47.8,3.4Hz,1H),5.27(dd,J＝15.2,3.4Hz,1H),3.78–3.72(m,2H),3.59-3.56(m,4H),3.47–3.40(m,2H),2.15(s,3H).ESI(M+H⁺):511.1760。

实施例27：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.57(s,1H),9.01(s,1H),8.19(s,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(s,1H),7.82(s,1H),7.49(d,J＝6.5Hz,1H),7.40–7.32(m,2H),7.26(d,J＝8.3Hz,1H),6.41(d,J＝1.8Hz,1H),6.09(s,1H),3.51(m,4H),2.77–2.69(m,4H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):594.1390。

实施例28：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氟丙烯酰胺

参照实施例31的方法，只是将原料2-氯丙酰氯换成并2-氟丙烯酰氯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.32(s,1H),9.57(s,1H),9.02(s,1H),8.19(s,1H),7.99(d,J＝11.7Hz,2H),7.81(s,1H),7.55(d,J＝6.3Hz,1H),7.34(d,J＝6.4Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,1H),5.69(dd,J＝47.6,3.0Hz,1H),5.42(dd,J＝15.4,3.0Hz,1H),3.51(m,4H),2.75-2.70(m,4H),2.04(s,3H).ESI(M+H⁺):578.1680。

实施例29：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.20(s,1H),9.41(s,1H),8.98(s,1H),8.16(s,1H),7.92(s,1H),7.74(s,1H),7.52(dd,J＝8.9,2.1Hz,2H),7.35(d,J＝4.8Hz,2H),6.91(d,J＝8.7Hz,1H),6.40(d,J＝2.2Hz,1H),6.08(d,J＝2.4Hz,1H),3.58–3.53(m,4H),2.88–2.83(m,2H),2.81–2.77(m,2H),2.03(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1139。

实施例30：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-氟苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-氯苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.13(s,1H),8.82(s,1H),8.37(s,1H),8.06(s,1H),7.91(s,1H),7.48(d,J＝8.9Hz,1H),7.43(d,J＝7.7Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.18(t,J＝8.1Hz,1H),7.01(d,J＝2.6Hz,1H),6.81(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.43(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(d,J＝2.5Hz,1H),3.57-3.56(m,4H),3.15-3.06(m,4H),2.05(s,3H).ESI(M+H⁺):560.1143。

实施例31：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.38(s,1H),9.56(s,1H),8.42(s,1H),7.70(d,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝1.8Hz,1H),7.48(t,J＝8.2Hz,1H),7.25(s,2H),7.07(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.69(m,2H),6.43(d,J＝2.6Hz,1H),6.12(d,J＝2.6Hz,1H),3.56-3.53(m,4H),3.03–2.85(m,4H),2.03(s,3H).ESI(M+H⁺):527.1363。

实施例32：N-[3-[[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]氨基]苯基]-2-氯丙烯酰胺

参照实施例1的方法，只是将原料3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)苯基]氨基]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯换成3-[2-[[4-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-3-三氟甲基苯基]氧]-5-(氯)-4-嘧啶基]甲酸叔丁酯氨基苯，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝100:1)得到白色固体。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ10.39(s,1H),9.96(s,1H),8.53(s,1H),7.73(s,1H),7.71–7.66(m,2H),7.65(t,J＝2.0Hz,1H),7.47(t,J＝8.1Hz,1H),7.22(d,J＝6.6Hz,1H),7.09–7.04(m,1H),6.43(d,J＝2.6Hz,1H),6.11(d,J＝2.6Hz,1H),3.51-3.50(m,4H),2.78–2.72(m,2H),2.69(t,J＝4.8Hz,2H),2.04(s,3H).ESI(M+H+):595.1250。

效果实施例1：本发明化合物对A431、H1975、SW620细胞增殖抑制活性测定

本实施例用于测定本发明中所公开的化合物对于野生型EGFR高表达人表皮癌细胞株A431，[L858R/T790M]EGFR点突变人肺腺癌细胞株H1975以及低表达EGFR人结肠癌细胞株SW620的增殖抑制活性，化合物对细胞增殖的抑制活性用半数抑制浓度IC₅₀来表示。试验方案如下：野生型EGFR高表达人表皮癌细胞株A431，[L858R/T790M]EGFR点突变人肺腺癌细胞株H1975以及低表达EGFR人结肠癌细胞株SW620均购于ATCC，以适宜的细胞浓度(A431：20000个细胞/ml培养基；H1975：15000个细胞/ml培养基，SW620:20000个细胞/ml培养基)将细胞接种于白色不透明的384孔培养板上；之后将细胞放置于37℃，5％CO₂的环境中进行培养，24小时后，向培养的细胞培养基中加入一系列浓度梯度的药物，一般选择10个浓度，之后将细胞放回原培养环境中继续培养48小时，之后按照MTT检测方法，测定受试化合物对A431,H1975以及SW620细胞增殖的影响，并计算不同浓度的化合物对细胞增殖的抑制活性，本发明受试化合物的IC₅₀数据如下表1。

表1

本发明化合物结构上具有一定的新颖性，同时体外生物活性评价结果显示，本发明的化合物对过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975具有明显的抑制增殖活性，低表达EGFR人结肠癌细胞株SW620的增殖抑制活性较弱。

效果实施例2：本发明化合物对EGFR^WT、EGFR^L858R/T790M酪氨酸激酶活性的抑制作用

酶活性测试采用Mobility shift assay方法进行(Expert Opin Drug Discov.2008,3(6):607–621)。化合物称量后，配制成10mM的DMSO储存液。试验前，根据所需浓度，取适量10mM的化合物储存液，溶解于水中，配制成相应浓度为最终浓度5倍的化合物工作液。并将反应所需的各种激酶，EGFR^WT、EGFR^L858R/T790M溶解于浓度为所需浓度1.25倍的反应缓冲液(62.5mM HEPES，pH7.5、0.001875％Brij-35、12.5mM MgCl2、2.5mM DTT)中，配制成浓度为最终浓度2.5倍的酶工作液。同时将反应所需的ATP和FAM标记的多肽底物也溶液于1.25X的反应缓冲液中，配制成浓度为所需浓度2.5倍的底物和ATP工作液。之后向384孔检测板中加入5μl化合物工作液，向空白对照(min)中加入5μl 250mM的EDTA，向阴性对照(Max)中加入不含药物，但含相同体积的DMSO的工作液。同时加入10μl酶工作液，轻轻混匀后，室温孵育10分钟，之后向各反应孔中加入10μl的底物和ATP工作液，将检测板置于28度条件下孵育60分钟，之后向各反应孔中加入25μl的酶反应中止液(100mM HEPES，pH7.5,、0.015％Brij-35、0.2％Coating Reagent#3,、50mM EDTA)，以中止酶反应，之后将反应板置于Caliper EZ reader中采集各反应孔中的底物转换率(底物被激酶磷酸化的比率)，并对上述数据进行分析，化合物对激酶的抑制率计算按如下公式进行：％inh＝(Max-conversion)/(Max-Min)×100，其中％inh为百分比抑制率，Max为阴性对照孔内的底物转换率，min为空白对照孔内的底物转换率，conversion为加入不同浓度化合物的各反应孔内的底物转换率。将计算得到的各浓度化合物下的％inh导入Xlift中进行分析，获得相应IC₅₀，曲线拟合公式为：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hillslope))。表2为所得结果。

表2

本发明的化合物对EGFR^WT具有较好的抑制活性，特别是对EGFR^L858R/T790M的抑制活性优于EGFR^WT，说明该类化合物的选择性较好。