一种用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置和方法与流程

本发明涉及一种采用体外胃肠模型和Transwell模型来研究环境污染物在消化系统中被消化吸收的情况，属于生物技术科学领域。

背景技术：

体外模型相比于动物实验具有耗时短，相对准确，不会引起伦理问题等优点。而目前应用的体外模型主要有生物可给性简化提取法(SBET)、生物远离提取法(PBET)、Rodriguez体外胃肠法(IVG)等，这些方法已经广泛应用于环境中金属离子、有机污染物等在人体中生物可给性的研究。但这几种方法只模拟了环境污染物在胃和小肠部位的消化情况，无法反应大肠部位的消化情况以及肠道微生物在其中的作用。比利时根特大学研究发明的SHIME装置(Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)增加了结肠部分的模拟并且接种了肠道微生物，但它只能够模拟环境污染物在胃，小肠和结肠部分的生物可给性和代谢的过程，对环境污染物进入人体消化吸收以及经消化吸收后引起的毒性变化不能进行完整的模拟，因此本发明改进了SHIME模型，将其与Transwell模型相结合完整的模拟了环境污染物经口摄入后在人体胃肠道中的代谢和吸收过程以及经消化吸收后的毒性情况。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置，该装置将体外胃肠模型和Transwell模型结合起来，能够完整的模拟环境污染物经口摄入后在人体胃肠道中的代谢和吸收情况。

本发明还要解决的技术问题是提供上述用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置，包括体外胃肠模型和Transwell小室；

其中，所述体外胃肠模型包括五个带夹层的玻璃罐I，五个玻璃罐1分别模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠；还包括装有营养培养基的玻璃罐II和装有胰液的玻璃罐III；装有营养培养基的玻璃罐II和模拟胃的玻璃罐I通过乳胶管相连通，装有胰液的玻璃罐III和模拟小肠的玻璃罐I通过乳胶管相连通，模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I依次通过乳胶管相连通，每个乳胶管上均设置蠕动泵；模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中均设置磁力搅拌器；模拟小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I上还设置采样口，每个采样口外设置PES滤膜，采样口流出的采样液经过PES滤膜过滤；模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中设置pH调节器；

所述模拟小肠、升结肠、横结肠以及降结肠玻璃罐I的采样口分别对应连接一个Transwell小室，所述Transwell小室包括上室和下室，所述上室底部设置滤膜，滤膜上接种人结肠癌细胞Caco-2，人结肠癌细胞Caco-2形成一张细胞膜，采样口流出的采样液经过PES滤膜过滤后在上室中培养。

其中，所述PES滤膜为聚醚砜微孔滤膜，其孔径为0.45μm。

其中，所述Transwell小室中的细胞培养液为500mL不完全高糖培养基+50mL胚胎牛血清。

一种用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的方法，包括如下步骤：

步骤1，构建体外胃肠模型：体外胃肠模型包括五个带夹层的玻璃罐I，五个玻璃罐I分别模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠；还包括装有营养培养基的玻璃罐II和装有胰液的玻璃罐III；装有营养培养基的玻璃罐II和模拟胃的玻璃罐I通过乳胶管相连通，装有胰液的玻璃罐III和模拟小肠的玻璃罐I通过乳胶管相连通，模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I依次通过乳胶管相连通，每个乳胶管上均设置蠕动泵；模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中均设置磁力搅拌器；模拟小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I上还设置采样口；模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中设置pH调节器；

步骤2，往模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I夹层中通37℃恒温水模拟人体体温；启动五个玻璃罐I中的磁力搅拌器，搅拌速度为150rpm；将人的肠道微生物接种到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；

步骤3，装置的运行：用蠕动泵将200ml营养培养基加入模拟胃的玻璃罐I中，模拟食物在胃部的消化情况，液体在胃部位停留2h后全部转移到模拟小肠的玻璃罐I，同时用蠕动泵往模拟小肠的玻璃罐I中加入胰液，在小肠部位消化4h后，用蠕动泵全部转移至模拟升结肠的玻璃罐I，最后用蠕动泵将残液从升结肠玻璃罐I以0.625mL/min的速度连续转移至横结肠玻璃罐I、降结肠玻璃罐I和废液缸中；

步骤4，当体外胃肠模型按步骤3的操作稳定运行三周后，在步骤3的营养培养基中加入环境污染物，模拟环境污染物通过食物或饮水进入人体，在模拟小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I设置的采样口取样，每个玻璃罐I的采样口对应连接一个Transwell小室，采样液经采样口外表面的PES滤膜过滤后得到生物可给性部分；

步骤5，将得到的生物可给性部分进行一定的预处理，预处理后，加入Transwell上室，Transwell上室底部滤膜上接种人结肠癌细胞Caco-2，人结肠癌细胞Caco-2生长形成一张细胞膜，人结肠癌细胞Caco-2细胞膜用于模拟人类肠道表皮粘膜细胞对环境污染物的吸收情况。

其中，步骤2中，所述将人的肠道微生物接种到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中，具体接种过程为取6个月未摄入抗生素的新鲜成人粪便，往粪便中加入80mLpH为7.0、浓度为0.7M的磷酸盐缓冲溶液和1g硫代乙酸纳，将样品均质化，于3000rpm转速下离心3min，离心后取20mL上清液依次转移到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；往模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中分别加入SHIME专用培养基，直至模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的容积分别为800ml、1200ml和800ml，静置一夜；再利用pH控制器将模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的pH分别控制在5.5～5.9、6.0～6.4和6.5～6.9；

其中，步骤3中，所述营养培养基的pH值为2，所述营养培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、1.0g/L木聚糖、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨。

其中，所述营养培养基配好后，将其置于121℃下灭菌后再冷却至室温。

其中，步骤3中，所述胰液的配方为：12.5g/L碳酸氢钠、6.0g/L胆汁盐以及0.9g/L胰液素。

其中，所述pH控制器中酸调节液为0.01M的盐酸，碱调节液为0.5M碳酸氢钠。

所述SHIME专用培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨。

根据本发明装置对环境污染物的吸收情况，再利用细胞毒性试验来研究环境污染物被消化吸收后的毒性情况。

相比于现有模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置及方法，本发明的用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置及方法具有的有益效果为：

本发明的装置及方法完整地模拟了环境污染物进入人体胃肠道后被肠道消化吸收的过程，更加接近真实的消化吸收过程，对后续环境污染物被人体吸收后的毒性情况研究以及环境污染物对人体健康风险评估具有重要意义。

附图说明

图1为本发明用于模拟环境污染物在消化系统被消化吸收的装置的结构示意图；

图2为模拟装置中微生物群落结构图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

将体外胃肠模拟装置与Transwell模拟吸收装置结合研究饮用水中砷在消化系统中被消化吸收的情况：

步骤1，构建体外胃肠模型：体外胃肠模型包括五个带夹层的玻璃罐I，五个玻璃罐1分别模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠；还包括装有营养培养基的玻璃罐II和装有胰液的玻璃罐III；装有营养培养基的玻璃罐II和模拟胃的玻璃罐I通过乳胶管相连通，装有胰液的玻璃罐III和模拟小肠的玻璃罐I通过乳胶管相连通，模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I依次通过乳胶管相连通，每个乳胶管上均设置蠕动泵，蠕动泵用于实现不同罐体之间的连通；模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中均设置磁力搅拌器；模拟小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I上还设置采样口；模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中设置pH调节器；

步骤2，往模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I夹层中通37℃恒温水模拟人体体温；启动五个玻璃罐I中的磁力搅拌器，通过磁力搅拌器模拟人体胃肠道的蠕动，搅拌速度为150rpm；将人的肠道微生物接种到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；具体接种过程为取6个月未摄入抗生素的新鲜成人粪便，往粪便中加入80mLpH为7.0、浓度为0.7M的磷酸盐缓冲溶液，加入1g硫代乙酸纳作为还原剂，将样品均质化，于3000rpm转速下离心3min，离心后取20mL上清液依次转移到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；往模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中分别加入SHIME专用培养基(SHIME专用培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨)，直至模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的容积分别为800ml、1200ml和800ml，稳定过夜；再利用pH控制器通过0.01M盐酸和0.5M碳酸氢钠将模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的pH值分别控制在5.5～5.9、6.0～6.4和6.5～6.9：

步骤3，装置的运行：用蠕动泵将200ml营养培养基加入模拟胃的玻璃罐I中(营养培养基的pH值为2，营养培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、1.0g/L木聚糖、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨；将配好的营养培养基置于121℃下灭菌后再冷却至室温；)，模拟食物在胃部的消化情况，液体在胃部位停留2h后全部转移到模拟小肠的玻璃罐I，同时用蠕动泵往模拟小肠的玻璃罐I中加入胰液(胰液配方为12.5g/L碳酸氢钠、6.0g/L胆汁盐以及0.9g/L胰液素)，在小肠部位消化4h后，用蠕动泵全部转移至模拟升结肠的玻璃罐I，最后用蠕动泵将残液从升结肠玻璃罐I以0.625mL/min的速度连续转移至横结肠玻璃罐I、降结肠玻璃罐I和废液缸中；体外胃肠模型稳定运行三周，在模拟升结肠玻璃罐I、模拟横结肠玻璃罐I以及模拟降结肠玻璃罐I的采样口取样，对样品进行总DNA的提取，以及Miseq高通量测序，得到的群落结构与已有报道的人类肠道微生物群落结构进行对比，其主要门为后壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，与人类肠道微生物群落结构一致，如图2所示；

步骤4，当体外胃肠模型稳定运行三周后，在步骤3营养培养基中分别加入100ppb和600ppb三氧化二砷溶液，模拟As通过饮用水进入人体，分别暴露一周后，在模拟小肠玻璃罐I、模拟升结肠玻璃罐I、模拟横结肠玻璃罐I以及模拟降结肠玻璃罐I的采样口取样，采样液经过采样口外表面的PES滤膜过滤后，得到生物可给性部分的As；

步骤5，将得到的生物可给性部分的As进行一定的预处理，预处理步骤为：将得到的As溶液冻干至无液体，加完全高糖培养基，再用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；预处理后将溶液加入Transwell小室的上室，事先在Transwell下室与上室的接触处，即上室的底部滤膜(滤膜为聚碳酸酯膜)上接种人结肠癌细胞Caco-2，使其长成一张细胞膜，来模拟人类肠道表皮粘膜细胞对环境污染物的吸收过程。

每隔30min在Transwell小室的下室采样，利用HPLC-ICP-MS测量被消化吸收后的砷的形态与浓度。

实施例2

将体外胃肠模拟装置与Transwell模拟吸收装置结合研究双酚A(BPA)在消化系统中被消化吸收的情况：

步骤1，构建体外胃肠模型：体外胃肠模型包括五个带夹层的玻璃罐I，五个玻璃罐1分别模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠；还包括装有营养培养基的玻璃罐II和装有胰液的玻璃罐III；装有营养培养基的玻璃罐II和模拟胃的玻璃罐I通过乳胶管相连通，装有胰液的玻璃罐III和模拟小肠的玻璃罐I通过乳胶管相连通，模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I依次通过乳胶管相连通，每个乳胶管上均设置蠕动泵，蠕动泵用于实现不同罐体之间的连通；模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中均设置磁力搅拌器；模拟小肠、升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I上还设置采样口；模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中设置pH调节器；

步骤2，往模拟胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠的五个玻璃罐I夹层中通37℃恒温水模拟人体体温；启动五个玻璃罐I中的磁力搅拌器，通过磁力搅拌器模拟人体胃肠道的蠕动，搅拌速度为150rpm；将人的肠道微生物分别接种到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；具体接种过程为取6个月未摄入抗生素的新鲜成人粪便，往粪便中加入80mLpH为7.0、浓度为0.7M的磷酸盐缓冲溶液，加入1g硫代乙酸纳作为还原剂，将样品均质化，于3000rpm转速下离心3min，离心后取20mL上清液依次转移到模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中；往模拟升结肠、横结肠和降结肠的玻璃罐I中分别加入SHIME专用培养基(SHIME专用培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨)，直至模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的容积分别为800ml、1200ml和800ml，稳定过夜；再利用pH控制器通过0.01M盐酸和0.5M碳酸氢钠将模拟升结肠、横结肠和降结肠玻璃罐I中液体的pH值分别控制在5.5～5.9、6.0～6.4和6.5～6.9；

步骤3，装置的运行：用蠕动泵将200ml营养培养基加入模拟胃的玻璃罐I中，(营养培养基的pH值为2，营养培养基的配方为：1.0g/L阿拉伯半乳聚糖、2.0g/L果胶、1.0g/L木聚糖、4.0g/L淀粉、0.5g/L半胱氨酸、0.4g/L葡萄糖、1.0g/L酵母提取物、4.0g/L黏蛋白以及1.0g/L蛋白胨；将配好的营养培养基置于121℃下灭菌后再冷却至室温；)模拟食物在胃部的消化情况，液体在胃部位停留2h后全部转移到模拟小肠的玻璃罐I，同时用蠕动泵往模拟小肠的玻璃罐I中加入胰液(胰液配方为12.5g/L碳酸氢钠、6.0g/L胆汁盐以及0.9g/L胰液素)，在小肠部位消化4h后，用蠕动泵全部转移至模拟升结肠的玻璃罐I，最后用蠕动泵将残液从升结肠玻璃罐I以0.625mL/min的速度连续转移至横结肠玻璃罐I、降结肠玻璃罐I和废液缸中；体外胃肠模拟装置稳定运行三周，在模拟升结肠玻璃罐I、模拟横结肠玻璃罐I以及模拟降结肠玻璃罐I的采样口取样，对样品进行总DNA的提取，以及Miseq高通量测序，得到的群落结构与已有报道的人类肠道微生物群落结构进行对比，其主要门为后壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，与人类肠道微生物群落结构一致，见附图2；

步骤4，当体外胃肠模型稳定运行三周后，在步骤3营养培养基中分别加入BPA溶液(浓度分别为25mg/L、250mg/L和2500mg/L)，模拟BPA通过食物或饮水进入人体，分别暴露一周后，在模拟小肠玻璃罐I、模拟升结肠玻璃罐I、模拟横结肠玻璃罐I以及模拟降结肠玻璃罐I的采样口取样，采样液经过采样口外表面的PES滤膜过滤后，得到生物可给性部分的BPA；

步骤5，将得到的生物可给性部分的BPA进行一定的预处理，预处理步骤为：将得到的BPA溶液冻干至无液体，加完全高糖培养基，再用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；预处理后将染毒物液体加入Transwell小室的上室，事先在Transwell小室中接种人结肠癌细胞Caco-2，使其长成一张细胞膜，来模拟人类肠道表皮粘膜细胞对环境污染物的吸收过程。

每隔30min在Transwell小室的下室采样，利用GC-MS分析BPA代谢后的物质与浓度。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。