检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及一种免疫磁珠试剂盒及其用途，特别涉及一种用于检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒及其用途，本发明属于生物技术领域。

背景技术：

小反刍兽疫(Peste des petits runinants，PPR)又称羊瘟，主要感染小反刍兽，特别是山羊和绵羊高度易感，野生动物中也偶有发生，是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits runinants virus，PPRV)引起的一种严重的急性、烈性、高度接触传染性疾病，目前尚无感染人的报道，其发病率和死亡率最高均可达100％，世界动物卫生组(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》将其列为重点防范的13种外来动物疫病之一。目前，小反刍兽疫已经在全国大部分地区偶有发生，严重威胁着我国的动物卫生安全和我国畜牧业的发展，是需要严格采取强制预防控制和扑灭的动物疫病之一。

免疫磁珠技术(Immunomagnetic beads,IMB)是一种以抗原抗体反应为基础，以磁载体技术为媒介的新型诊断技术。由于其特有的快速、高效、低毒、特异性高、操作简单等特点而在生物医学领域得到广泛的应用。Jacobsen利用免疫磁珠技术检测单核细胞增生的李斯特氏菌，其敏感性可检测到培养液中的3x10⁴个菌，回收率为95％，在混合培养液中可以很好的去除非目的菌，且特异性良好。杨万等建立了一种免疫磁珠分离技术联合实时定量PCR快速定量检测水中轮状病毒的方法，并通过制备能够分离水中轮状病毒的特异免疫磁珠，成功用于水中轮状病毒的检测。颜小飞等采用免疫磁珠分离技术和阻抗测量技术联用的方法，实现了对禽流感H5亚型病毒的特异性快速检测。何静云等利用特异性抗体包被磁珠，成功地从感染大鼠肝脏中富集和纯化了泰泽氏病原体，研究结果表明，免疫磁珠分离技术可有效地分离和纯化泰泽氏病原体，为血清学抗原检查隐性感染提供了新思路。

针对PPRV感染的常规检测及诊断方法很多，而OIE规定的标准检测方法为竞争ELISA和RT-PCR方法。其中竞争ELISA主要作为PPRV抗体的血清学检测方法，由于无法区分鉴别疫苗免疫抗体和自然感染抗体，因此在PPRV的感染检测中最终确诊仍然需要配合PCR的抗原诊断来判断是否发生PPRV感染。PPRV为单股负链RNA病毒，对外界环境敏感，50℃、30min或阳光照射下很快就会失活降解。由于无法在野外开展PCR检测，因此在病料采集和保存过程中容易造成组织病料中病毒含量降低，以至于造成假阴性的检测结果。

M蛋白是PPRV主要结构蛋白之一，在成熟的病毒粒子从细胞内释放的过程中起着关键作用，在缺失M蛋白的情况下，病毒将失去感染细胞的能力，并且目前针对PPRV M基因的检测方法很少，本发明针对PPRV M基因设计引物用于PPRV的检测，作为PCR方法检测的靶标基因，结果发现本发明设计的引物敏感性高，特异性好，同时由于免疫磁珠的病毒富集作用，因此可以有效解决小反刍兽疫病毒抗原检测中病毒含量低难以检测的问题，可以有效的增加PCR方法的病原检出效率。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的小反刍兽疫病毒抗原检测过程中由于PPRV病原易降解，且病原RNA提取过程中使用的待检毒液体积有限导致所提取的RNA无法达到RT-PCR检测的最低要求，而出现假阴性结果的问题，本发明一方面设计了一对以PRRVM基因为靶点的可用于PPRV检测的特异性引物，另一方面制备了一种可用于富集PPRV病原的特异性免疫磁珠，并最终建立了一种可用于检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒。

具体的，为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒，其包括兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠、以PPRV M基因片段为靶点检测小反刍兽疫病毒抗原的引物对，RT-PCR反应混合液及RNA聚合酶，所述的引物对的序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，优选的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的浓度为10mg/mL。

在本发明中，优选的，所述的免疫磁珠试剂盒还包括PBS缓冲液，更优选的所述的PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

在本发明中，优选的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠是通过以下方法制备得到的：

1)磁珠的洗涤：取磁珠原液于EP管内，利用磁力架吸附作用，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬；

2)抗体的偶联：将过量的兔抗PPRV H蛋白IgG抗体加入到步骤1)重悬后的磁珠中，混匀，37℃震荡15-60min，得到含有兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的混悬液；

3)兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的分离：将步骤2)得到的混悬液利用磁力架吸附，除去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬，即获得所需的兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠。

其中，优选的，步骤1)中磁珠原液的体积为200μL，其中所含有磁珠的重量为6mg，使用600μLPBS缓冲液重悬；步骤2)中所述的兔抗PPRV H蛋白IgG抗体的用量为100μg以上。

其中，优选的，步骤1)以及步骤3)中所述的PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

其中，优选的，步骤2)中的震荡时间为20min。

其中，优选的，所述的兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的终浓度为10mg/mL。

进一步的，本发明还公开了所述的免疫磁珠试剂盒在检测小反刍兽疫病毒抗原中的用途。

使用本发明所述的免疫磁珠试剂盒用于检测小反刍兽疫病毒抗原时，按照以下步骤进行：

1)病毒的富集：取免疫磁珠于1.5mL的EP管中，加入待检样本，37℃震荡反应20-60min；

2)磁珠的洗涤：待病毒富集完成后，将EP管放置于磁力架上，弃去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，再加入2-5倍体积的PBS缓冲液将富集病毒的免疫磁珠重悬；

3)病毒RNA的提取：用热裂解法破坏病毒结构，释放病毒RNA；

4)PCR扩增：利用本发明所述的试剂盒进行一步法RT-PCR的扩增；

5)1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

其中，优选的，步骤1)中每个400μL待检样品检测时使用的免疫磁珠量为20μL，37℃震荡反应时间为30min；步骤2)中采用的热裂解法获得病毒RNA的程序为：95℃裂解10min后迅速冰浴3min；步骤3)中一步法RT-PCR的扩增反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL；2×1Step Buffer 25μL；PPRV RNA模板6μL；RNase Free dH₂O 15μL；上游引物1μL；下游引物1μL，总体积50μL。

扩增程序为：50℃30min；94℃3min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min后于4℃保存。

本发明的提出克服了小反刍兽疫病毒抗原检测过程中PPRV病原易降解，且病原RNA提取过程中使用的待检毒液体积有限导致所提取的RNA无法达到RT-PCR检测的最低要求，而出现假阴性结果的问题，为小反刍兽疫病毒抗原的检测提供了一种有效的技术手段。

附图说明

图1为兔抗PPRV H蛋白血清IgG的纯化；

M：预染蛋白质Marker；1：洗脱液1；2：洗脱液2；3：洗脱液3；

图2为通过SDS-PAGE检测兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠特异性的结果；

1：结合PPRV-H蛋白后的产物；2：PPRV-H蛋白原样；3：结合PPRV疫苗稀释液的产物：4：PPRV疫苗稀释液；

图3为RT-PCR扩增结果；

M：DNA Marker DL2000；1-5：PPRV RNA扩增结果；6：阴性对照

图4为兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠富集后进行RT-PCR扩增结果(敏感性检测)。

M:DNA Marker DL2000；1:阴性对照；2：3mL疫苗稀释液；3:2mL疫苗稀释液；4-9：1mL依次做十倍倍比稀释后的疫苗稀释液。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1以PPRV M基因片段为靶点的，用于检测小反刍兽疫病毒抗原的引物对的设计与合成

本发明发明人根据GenBank中PPRV Nigeria 75/1毒株全基因组序列(登录号：HQ197753.1)设计针对M基因的特异性引物对，所述引物对的序列如下：

上游引物1-up：ATGACCGAGATCTACGATT(SEQ ID NO.1所示)；

下游引物1-low：ACAGGATCTTGAACAGGCC(SEQ ID NO.2所示)。

所述引物对交由生物公司合成。

实施例2兔抗PPRV H蛋白高免血清的制备

根据GenBank中PPRV Nigeria 75/1毒株全基因组序列(登录号：HQ197753.1)设计针对H基因的特异性引物，引物由生物公司合成。引物序列如下：

PPRV-H up:5'-CGGGATCCATGTCCGCACAAAGGGAA-3'(SEQ ID NO.3所示)

PPRV-H down:：5'-ATTTGCGGCCGCTCAGACTGGATTACATGTTA-3'(SEQ ID NO.4所示)

以小反刍兽疫病毒疫苗(疫苗购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)为模版扩增得到H基因，通过原核表达并纯化得到H蛋白。

选取体重约2kg左右的健康成年雄性兔子(新西兰大白兔)10只，颈背部多点和后肢大腿内侧皮下免疫原核表达纯化后的PPRV H蛋白。

具体免疫程序：首免前兔子耳缘静脉采血备用检测，免疫时用弗氏完全佐剂与目的蛋白等量混合后用乳化器进行乳化，免疫剂量为每只兔子5mg左右；首免后2周耳缘静脉采血检测抗体水平，进行加强免疫，免疫剂量增加为每只兔子10mg左右；二免后第2周、第3周分别采血进行抗体检测，待抗体效价达到最高开始下降时，进行三免，免疫量与二免时相同；三免后一周采血检测抗体效价，若ELISA方法检测效价达到1:6400，则通过心脏采血，获得兔抗PPRV H蛋白高免血清。

实施例3兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的制备

(一)兔抗PPRV H蛋白高免血清IgG的纯化：

瑞典法玛西亚公司AKTA FPLC蛋白纯化系统具体操作步骤：

1)将仪器的输液入口(A、B)分别放入相应所需缓冲液中，打开电脑，选择UNICORN软件，在系统控制界面中，选择“manual pump wash FPLC”选择使用的入口A，执行功能冲洗纯化系统的管道及泵；

2)连接G蛋白亲和层析蛋白纯化柱；

3)系统设置：在系统控制界面中，选择“manual pump Flow”输入流速，“insert alarm&mon alarm pressure”中输入泵的压力；

4)平衡纯化柱：用1M pH 9.0的Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱的pH；

5)上样：将PPRV H蛋白免疫的兔血清用蒸馏水做1：5稀释后，在加样管中加入10mL，Binding Buffer的电导控制在50-60mS/cm，pH 7.0-7.4，流速为1.0mL/min，流穿约0.5h左右，收集流穿液，每2ml收集1管。

6)洗脱：待吸收峰稳定后，加Elution Buffer，Elution Buffer的pH控制在2.5-3.0左右，流速为1.0mL/min，观察吸收峰，在吸收峰急速上升时控制样品接收器接收洗脱液，收集洗脱液时每2mL收集一管，依次命名为洗脱液1，洗脱液2……收集后立即加入pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液的pH，使其pH保持在中性或弱碱性。

7)洗脱完毕后，先用蒸馏水冲洗泵及管道，再用20％乙醇继续冲洗。

8)用NanoDrop2000A280测定回收纯化的IgG浓度，并跑SDS-PAGE分析纯化后的IgG纯度，纯化效果图见图1。

(二)兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的制备

1)磁珠的洗涤：取200μL(约6mg)磁珠原液(购自life生物公司)于EP管内，利用磁力架吸附作用，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用600μL PBS缓冲液重悬。

2)抗体的偶联：将过量的抗PPRV H蛋白IgG抗体(大于100μg)加入到步骤1)得到的磁珠混悬液中，混匀，37℃震荡20min，得到含有兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的混悬液；

3)兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠的分离：将步骤2)得到的混悬液利用磁力架吸附，除去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬，即获得所需的兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠，其浓度为10mg/mL。

其中，所用的PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

(三)兔抗PPRV H蛋白IgG偶联免疫磁珠的特异性检测：

1)分别取50μL制备好的免疫磁珠于3个1.5mL的EP管内，分别加入200μL未纯化的PPRV H蛋白以及1：10倍稀释后的小反刍兽疫活疫苗(疫苗购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，病毒含量约为10⁴TCID₅₀/mL)。用移液枪吸打混匀，37℃反应2h或4℃反应过夜(反应过程中不定期用移液枪混匀)；

2)充分反应后，取出EP管，放在磁力架上吸附2min，用移液枪将上清液完全吸出；

3)从磁力架上取下EP管，加入1mL pH 7.4的PBS冲洗，充分混匀后，重新放置于磁力架上吸附2min，用移液枪将上清全部吸出，如此重复洗涤3-5次，最后用200μL pH 7.4的PBS将磁珠重悬，吸取部分悬液，加入4×蛋白电泳上样缓冲液，不煮沸，直接进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图2，该结果说明，此免疫磁珠能够很好的结合PPRV H蛋白以及PPRV全病毒。

实施例4用于检测小反刍兽疫病毒抗原的免疫磁珠试剂盒的制备

所述的试剂盒中包括兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠(10mg/mL，实施例2制备)、以PPRVM基因片段为靶点检测小反刍兽疫病毒抗原的引物对(50pM)(分别如SEQ ID NO.1所示以及SEQ ID NO.2所示)，PBS缓冲液(10mM、pH值为7.4)、2×1Step Buffer及PrimeScript 1Step Enzyme Mix。

实施例5本发明的试剂盒在检测小反刍兽疫病毒抗原中的用途

1、检测样本

1:10倍稀释后的小反刍兽疫病毒疫苗。(疫苗购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，病毒含量约为10⁴TCID₅₀/mL)

2、方法

1)病毒的富集：取兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠(10mg/mL)20μL于1.5mL的EP管中，加入400μL稀释后的小反刍兽疫病毒疫苗，37℃震荡反应30min；

2)磁珠的洗涤：待病毒富集完成后，将EP管放置于磁力架上，弃去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，再加入1.2ml PBS缓冲液(10mM、pH值为7.4)将富集病毒的免疫磁珠重悬；

3)病毒RNA的提取：用热裂解法破坏病毒结构，释放病毒RNA；热裂解法获得病毒RNA的程序为：95℃裂解10min后迅速冰浴3min；

4)PCR扩增：利用实施例4所述的试剂盒进行一步法RT-PCR的扩增；

一步法RT-PCR的扩增反应体系为：

扩增程序如下：

5)1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

共进行了5个重复，结果如图3所示，该结果表明，采用本发明的试剂盒能够很好对小反刍兽疫病毒进行扩增，重复性良好。

实施例6：本发明的试剂盒的灵敏度试验

小反刍兽疫病毒疫苗1:10倍稀释后(病毒含量约为10³TCID₅₀/mL)，取1mL病毒稀释液做十倍倍比稀释，分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别加3mL、2mL疫苗稀释原液和1mL 10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5疫苗十倍倍比稀释液经兔抗PPRV H蛋白IgG偶联的免疫磁珠富集后，提取病毒基因组RNA，进行RT-PCR，方法同实施例5，结果如图4。结果表明，采用本发明的方法最低可检出的样本病毒浓度为0.1TCID₅₀/mL。