纤维素可及度测量的融合蛋白及其应用的制作方法

文档序号:12242763阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于测量纤维素对纤维素酶可及度的融合蛋白,其包含纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白,或者由纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白组成,其中所述连接肽位于纤维素识别多肽和荧光蛋白之间,并且所述融合蛋白的分子量为30-80 kD。

2.如权利要求1所述的融合蛋白,其中所述纤维素识别多肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的纤维素酶的纤维素结合元件(CBM),优选为外切葡聚糖酶的纤维素结合元件;优选地,其中所述纤维素识别多肽包含SEQ ID No:1所示的氨基酸序列,或由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成。

3.如权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白,其中所述连接肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的外切葡聚糖酶的连接肽,优选为外切葡聚糖酶中的CBM与催化域之间的连接肽;优选地,其中所述连接肽包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列,或者由SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成。

4.如权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白,其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白或其变体,包括蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、原绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、光活性绿色荧光蛋白等;优选地,其中所述荧光蛋白为分子量为20-60kD的绿色荧光蛋白;优选地,所述融合蛋白中包含1- 3个绿色荧光蛋白;更优选地,其中所述荧光蛋白包含SEQ ID No:3 所示的氨基酸序列,或者由SEQ ID No:3 所示的氨基酸序列组成。

5.核酸分子,其编码权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白。

6.重组质粒,其包含权利要求5所述的核酸分子;优选地,所述重组质粒表达载体选自大肠杆菌pET28a载体。

7.构建权利要求6所述的重组质粒的方法,其包括以下步骤:

(1)设计并合成权利要求5所述的核酸分子序列,使得其所表达的融合蛋白的分子量为 30-80kD;

(2)PCR扩增步骤(1)中所合成的核酸分子序列;优选地,所使用的扩增引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示;以及

(3)将步骤(2)中所扩增的产物回收并连接到大肠杆菌表达载体上,挑选出阳性克隆。

8.表达权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白的方法,其包括以下步骤:

(1)如权利要求7所述构建重组质粒;以及

(2)将步骤(1)中所构建的重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株中,挑选出阳性克隆,并且诱导培养所述的阳性克隆表达融合蛋白;优选地,所述诱导培养条件如下:诱导剂,终浓度为1 mM IPTG;诱导温度,30℃;诱导时间,6 h。

9. 纤维素可及度的测定方法,其包括利用权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白来测定纤维素的可及度;优选地,所述方法包括以下步骤:将1-100 mg/ml 的底物悬浮在pH4至9的缓冲溶液中,加入1至20μg/ml如权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白,于10至40℃下反应10至180分钟,测定吸附前后液相荧光强度变化,由此计算出底物的纤维素可及度。

10.权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白在测定纤维素可及度中的应用;优选地,所述纤维素为纯的纤维素或者经预处理后的木质纤维素中纤维素。

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