抗uPAR抗原的人源化抗体H2BL2及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗uPAR抗原的人源化抗体H2BL2及其应用。

背景技术：

肿瘤细胞的浸润和转移是其离开原始部位，迁移到临近的基底膜侵入周围的组织，或穿透血管壁转移并浸润较远位置的过程。尿激酶型纤溶酶原激活系统(uPAS)在肿瘤细胞的浸润与转移过程中发挥重要的作用。该系统由尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)和两个纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1和PAI-2)组成。uPA其初始分泌时是无活性的蛋白酶原，随后蛋白酶原水解成有活性的分子量是50KD糖蛋白。uPAR又称CD87，其缺乏跨膜与胞内区，是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白质，由D1、D2与D3三个同源域组成。

国内外许多研究表明，uPAR在许多肿瘤细胞尤其是头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、前列腺癌等实体瘤细胞中高表达而在正常细胞中低表达。基于uPAR在肿瘤细胞的黏附、迁移、免疫应答、损伤修复、浸润与转移中的重要作用，因此其可作为抗肿瘤药物的重要靶标。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抗uPAR抗原的人源化抗体H2BL2及其应用。

本发明首先提供了一种IgG(命名为H2BL2抗体)，其重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列1自N末端第50-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-126位氨基酸残基所示，其轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如序列表的序列3自N末端第45-54位氨基酸残基、第70-76位氨基酸残基和第109-116位氨基酸残基所示。

所述重链可变区具体如序列表的序列1自N末端第20-137位氨基酸残基所示。

所述轻链可变区具体如序列表的序列3自N末端第21-127位氨基酸残基所示。

所述IgG的重链具体可为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自N末端第20-467位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质。

所述IgG的轻链具体为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列3自N末端第21-233位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所示的蛋白质。

编码所述IgG的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述IgG的重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表的序列2自5’末端第77-1420位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2自5’末端第20-1423位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表的序列2所示的DNA分子；

编码所述IgG的轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：

(4)序列表的序列4自5’末端第80-718位核苷酸所示的DNA分子；

(5)序列表的序列4自5’末端第20-721位核苷酸所示的DNA分子；

(6)序列表的序列4所示的DNA分子。

本发明还保护H2BL2抗体在制备用于抑制癌细胞迁移的药物中的应用。所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。

本发明还保护H2BL2抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。所述癌症具体可为结肠癌。所述癌症具体可为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞引起的癌症。所述癌症具体可为结肠癌细胞引起的癌症。所述结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。

本发明还保护H2BL2抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：

(f1)检测癌细胞；

(f2)结合癌细胞；

(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)；

(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)。

所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。

本发明还保护一种产品，其活性成分为H2BL2抗体；所述产品的用途为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：

(f1)检测癌细胞；

(f2)结合癌细胞；

(f3)检测人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)；

(f4)结合人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(人uPAR蛋白)。

所述癌细胞为高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的癌细胞。所述癌细胞具体可为结肠癌细胞，更具体可为人结肠癌细胞，例如SW480细胞。

本发明提高的H2BL2抗体与人uPAR蛋白具有良好的结合活性，可以显著抑制肿瘤细胞迁移，在治疗肿瘤的领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为洗脱曲线。

图2为H2BL2溶液的10％SDS-PAGE图谱。

图3为细胞划痕实验的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pcDNA-3.3载体(线性质粒)：Invitrogen公司，目录号K8300-01。pOptiVEC载体(线性质粒)：Invitrogen公司，目录号12744-017。293F细胞：Thermo公司产品，目录号R79007。SW480细胞(人结肠癌细胞)：购自ATCC，目录号CCL-228。Opti-I培养基(Opti-MEMI Reduced Serum Medium)：Invitrogen公司，目录号31985-062。脂质体(293fectin^TMTransfection Reagent)：Invitrogen公司，目录号12347-019。Freestyle^TM293表达培养基(FreeStyle^TM293Expression Medium)：Invitrogen公司，目录号12338-018。重组人uPAR蛋白(简称uPAR-ECD)：义翘神州生物技术有限公司，货号10925-H08H-100。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。

实施例1、抗体的发现

发明人基于大量摸索、分析、验证，进行计算机建模和改造，设计了一种新的抗uPAR抗原的抗体(命名为H2BL2抗体)。H2BL2抗体为IgG，其重链如序列表的序列1所示，其轻链如序列表的序列3所示。

序列表的序列1中，自N末端第1-19位氨基酸残基组成前导肽，第20-137位氨基酸残基组成重链可变区VL(其中，第50-54位氨基酸残基组成CDR1、第69-85位氨基酸残基组成CDR2、第118-126位氨基酸残基组成CDR3)，第138-235位氨基酸残基组成重链恒定区CH1，第236-250位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge、第251-361位氨基酸残基组成重链恒定区CH2、第362-467位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。

序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的多肽。序列表的序列2中，自5’末端第20-76位核苷酸编码前导肽，第77-430位核苷酸编码VH，第431-724位核苷酸编码CH1，第725-769位核苷酸编码Hinge，第770-1102位核苷酸编码CH2，第1103-1420位核苷酸编码CH3，第1421-1423位核苷酸为终止密码子。

序列表的序列3中，自N末端第1-20位氨基酸残基组成前导肽，第21-127位氨基酸残基组成轻链可变区VL(其中，第45-54位氨基酸残基组成CDR1、第70-76位氨基酸残基组成CDR2、第109-116位氨基酸残基组成CDR3)，第128-233位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。

序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的多肽。序列表的序列4所示的DNA分子自5’末端第20-79位核苷酸编码前导肽，第80-400位核苷酸编码VL，第401-718位核苷酸编码CL，第719-721位核苷酸为终止密码子。

实施例2、抗体的制备

一、重组质粒的构建

1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入pOptiVEC载体，得到重组质粒pOptiVEC/H2B。

2、将序列表的序列4所示的DNA分子插入pcDNA-3.3载体，得到重组质粒pcDNA-3.3-L2。

二、H2BL2抗体的制备

1、取15μg重组质粒pOptiVEC/H2B和15μg重组质粒pcDNA-3.3-L2，用Opti-I培养基定容至1ml，轻轻混匀。

2、取60μl脂质体，用Opti-I培养基定容至1ml，轻轻混匀后室温孵育5min。

3、将步骤1的溶液和步骤2的溶液混匀，室温孵育20-30min。

4、取125ml细胞培养瓶，加入用Freestyle^TM 293表达培养基悬浮的293F细胞(293F细胞含量为3×10⁷个细胞)。

5、将2ml完成步骤3的溶液加入完成步骤4的细胞培养瓶中，在37℃、8％CO₂、150rpm振荡的条件下培养6-9天。

6、完成步骤5后，12000rpm离心15min，收集上清，调pH至6.0-7.0，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

7、取步骤6得到的滤液，采用Bio-Rad Duo-Flow蛋白纯化系统(760-0135)进行纯化。

Bio-Scale Mini Affi-prep proteinA亲和层析柱(伯乐公司，货号732-4602)：柱体积为5毫升预装柱。

结合缓冲液(pH7.5)：含3M NaCl的20mM的磷酸盐缓冲液。

洗脱缓冲液(pH2.8)：0.1M柠檬酸盐缓冲液。

流速：2ml/min。

过程：(1)用50ml结合缓冲液平衡柱子；(2)上样3ml步骤6得到的滤液；(3)用50ml结合缓冲液洗涤柱子；(4)用25ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集保留UV280大于0.05AU的过柱后溶液。整个过程的洗脱曲线见图1。

8、取步骤7得到的过柱后溶液，立刻用Tris-HCl溶液(pH9.0)调pH至7.0，然后使用截留分子量为10kD的超滤管(Millipore公司，Amicon Ultra-4)进行浓缩换液处理(浓缩换液采用的缓冲液为PBS缓冲液)，得到的溶液即为含H2BL2抗体的溶液，命名为H2BL2溶液。H2BL2溶液的10％SDS-PAGE图谱见图2(图2中的泳道1和泳道2都是H2BL2溶液)。

三、ATN615抗体的制备

ATN615抗体是一种靶向uPAR的单克隆抗体，该抗体与人uPAR亲和力较高且不影响uPAR蛋白与uPA的结合。ATN615抗体，其重链如序列表的序列5所示，轻链如序列表的序列7所示。序列表的序列6所示的双链DNA分子编码序列表的序列5所示的多肽。序列表的序列8所示的双链DNA分子编码序列表的序列7所示的多肽。

参照步骤一和步骤二，制备得到ATN615溶液。

四、空载体试验

用pOptiVEC载体代替重组质粒pOptiVEC/H2B，用pcDNA-3.3载体代替重组质粒pcDNA-3.3-L2，依次进行步骤二的1至8，洗脱过程中不显示任何洗脱峰。

实施例3、亲和力检测

一、ELISA检测

1、包被

取酶标板，每孔加入100μl包被液，4℃孵育过夜。包被液的制备方法：用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液将uPAR-ECD稀释，得到蛋白浓度为2ng/μl的溶液。

2、封闭

完成步骤1后，取所述酶标板，用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)，然后每孔加入200μl 10％小牛血清，置37℃孵育2小时。

3、加样

完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入100μl待测样本溶液，37℃孵育2小时，然后用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)。待测样本溶液为实施例2制备的H2BL2溶液的稀释液或实施例2制备的ATN615溶液的稀释液，用PBS缓冲液作为溶剂进行稀释。待测样本溶液的蛋白浓度为0.125μg/ml或0.0625μg/ml。

4、加酶标抗体

完成步骤3后，取所述酶标板，每孔加入100μl酶标抗体(山羊抗人IgG-HRP,中杉金桥，货号ZB-2304)，37℃孵育2小时，然后用PBST溶液洗板三次(每次350μl、每次3分钟)。

5、显色

完成步骤4后，取所述酶标板，每孔加入100μlTMB底物溶液(天根生物，PA107-01)，37℃孵育15分钟。

6、终止反应

完成步骤4后，取所述酶标板，每孔加入50μl2M硫酸溶液。

7、结果判定

将酶标仪(MD190)扫描波长调至OD450，检测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

进行五次重复试验，结果取平均值。

H2BL2溶液的稀释液(蛋白浓度为0.125μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.60。H2BL2溶液的稀释液(蛋白浓度为0.0625μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.38。ATN615溶液的稀释液(蛋白浓度为0.125μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.55。ATN615溶液的稀释液(蛋白浓度为0.0625μg/ml)作为待测溶液，相应的OD450值为1.26。

结果表明，H2BL2抗体对人uPAR蛋白的亲和力显著高于ATN615抗体。

二、Fortebio检测

Fortebio操作方法简要如下:(1)用pH7.2的PBS缓冲液对系统基线平衡30s；(2)将待测抗体(待测抗体为实施例2制备的H2BL2溶液或实施例2制备的ATN615溶液)的蛋白浓度调整至0.2mg/ml，通过Loading上样步骤将其固定到抗人IgG Fc的芯片上；(3)用pH7.2的PBS缓冲液对系统基线进行再平衡；(4)将抗原uPAR-ECD调整到浓度为1μM、0.75μM、0.5μM与0.25μM四个浓度，与上述进行60s的结合；(5)PBS解离结合的抗原120s，机器检测反应信号，分析抗原抗体结合的结合常数Ka与解离常数Kd值，进而计算出平衡解离常数KD值(KD＝Kd/Ka)。KD越大说明解离越多、代表亲和力越弱，KD越小说明解离越少、代表亲和力越强。

进行五次重复试验，结果取平均值。

ATN615抗体与uPAR-ECD的ka值为7.733e4(1/Ms)，kd值为5.757e-4(1/s)，KD值为7.445e-9(M)。H2BL2抗体与uPAR-ECD的ka值为7.179e4(1/Ms)，kd值为4.538e-4(1/s)，KD值为6.321e-9(M)。

结果表明，H2BL2抗体对人uPAR蛋白的亲和力显著高于ATN615抗体。

三、流式细胞术检测

1、取对数生长期的SW480细胞，制备成浓度为5×10⁵细胞/ml的细胞悬液。

2、取1个EP管，加入1ml步骤1得到的细胞悬液，4℃、1000rpm离心5min,弃上清，用1ml含1％FBS的PBS缓冲液洗涤一次。

3、完成步骤2后，取所述EP管，加入200μl待测溶液4℃孵育60min，然后4℃、1000rpm离心5min,弃上清，用500μ含1％FBS的PBS缓冲液洗涤一次。

待测溶液为实施例2制备的H2BL2溶液的稀释液或实施例2制备的ATN615溶液的稀释液，蛋白浓度为5μg/ml，用PBS缓冲液调整蛋白浓度。

4、完成步骤3后，取所述EP管，加入100μlFITC标记的羊抗人IgG(GAH-FITC，1：32稀释)，4℃避光孵育45min。

5、完成步骤4后，取所述EP管，4℃、1000rpm、离心5min，弃上清，用500μl含1％FBS的PBS缓冲液洗涤一次。

6、完成步骤5后，取所述EP管，加入300μl含1％FBS的PBS缓冲液重悬细胞后进行流式细胞检测。

进行五次重复试验，结果取平均值。

H2BL2抗体与SW480细胞结合的阳性率为99.64％，平均荧光强度为4.44。ATN615抗体与SW480细胞结合的阳性率为98.64％，平均荧光强度为4.96。

结果表明，H2BL2抗体可有效的结合SW480细胞，且结合能力高于ATN615抗体。

实施例4、细胞划痕实验

肿瘤细胞最基本的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性的一种方法，用于鉴定药物抑制肿瘤细胞迁移的能力。

1、用Marker笔在六孔板背后用直尺比着，均匀划横线，每孔5条线。

2、取步骤1的六孔板，每孔加入5×10⁵个SW480细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时(细胞铺满孔底)。

3、完成步骤2后，取所述六孔板，用枪头比着直尺，尽量垂直于Marker线划痕，枪头要垂直于皿底。

4、完成步骤3后，取所述六孔板，用PBS缓冲液洗涤三次以去除划下的细胞。

5、完成步骤4后，取所述六孔板，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM培养基，再加入5μL待测溶液(待测溶液为实施例2制备的H2BL2溶液或ATN615溶液，使得体系中的抗体浓度为50μg/ml)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。将等体积PBS缓冲液作为待测溶液的阴性对照。分别于培养0h或48h后取样进行拍照，测量划痕间距。

结果见图3。

进行五次重复试验，结果取平均值。

待测溶液为PBS缓冲液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为1cm。待测溶液为H2BL2溶液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为4.5cm。待测溶液为ATN615溶液时，0h时刻平均划痕距离为5.5cm，48h后平均划痕距离为4cm。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 抗uPAR抗原的人源化抗体H2BL2及其应用

<130> GNCYX161889

<160> 8

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Phe Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Ala Trp Gly

115 120 125

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 2

<211> 1423

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagcttaatt gccgccacca tggactggac ctggagggtc ttctgcttgc tggctgtagc 60

tccaggtgct caatccgagg ttcagctggt tcagtccggt gctgaggtta agaagccagg 120

ttcctctgtt aaggtttctt gcaaggcttc tggctacact ttcaccgact actacatcca 180

ctgggttcgt caggctccag gccagggtct ggagtggatc ggttggatct tccacggttc 240

tgacaacact gagtacaacg agaagttcaa gtctaaggct actatcactg ctgacgagtc 300

cacttctacc gcttacatgg agctgtcctc tctgcgttcc gaggacactg ctgttttcta 360

ctgcgctcgt tggggtccac actggtactt cgacgcttgg ggtcgtggta ctctggttac 420

tgtttcctca gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag 480

cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt 540

gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct 600

acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa 720

agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact 780

cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc 840

ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga 960

gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctctcc gtcctgcacc aggactggct 1020

gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa 1080

aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcctccatc 1140

tcgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc 1200

cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac 1260

gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa 1320

gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa 1380

ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1423

<210> 3

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro

50 55 60

Lys Pro Leu Met Tyr Glu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Ser Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn

100 105 110

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 4

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagcttaatt gccgccacca tggagacacc cgcccagctg ctgttcctgc tgctgctgtg 60

gctgcccgac accaccggca tggacatcca gatgactcag tccccatcta ctctgtctgc 120

ttccgttggc gaccgtgtta ccatcacttg ccgtgcttct agctccgttt cttacatcca 180

ctggtaccag caaaagccgg gtcgtgctcc gaagccactg atgtacgagg cttcctctcg 240

cgctactgga gttccatctc gcttctctgg ttccggttct ggcactgagt acactctgac 300

tatctcctct ctgcagagcg acgacttcgc tacttactac tgccagcagt ggaactaccc 360

attcactttc ggacagggta ctaagctgga gatcaagcgg accgtggcgg cgccatctgt 420

cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctggt accgctagcg ttgtgtgcct 480

gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 540

atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 600

cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 660

agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta 720

g 721

<210> 5

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Met Gly Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

35 40 45

Phe Thr Asn Phe Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 6

<211> 1426

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttaatt gccgccacca tggactggac ctggagggtc ttctgcttgc tggctgtagc 60

tccaggtgct caatccatgg gcgttaagct gcagcaatcc ggcccagagg ttgttaagcc 120

aggtgcttct gttaagatct cctgcaaggc ttctggatac tccttcacta acttctacat 180

ccactgggtt aagcagcgtc caggtcaggg tctggagtgg atcggttgga tcttccacgg 240

ttctgacaac actgagtaca acgagaagtt caaggacaag gctactctga ctgctgacac 300

ttcctctagc actgcttaca tgcagctgtc ctctctgact agcgaggatt ccgctgttta 360

cttctgcgct cgctggggcc cacactggta cttcgacgtt tggggtcagg gtaccactgt 420

taccgtttcc tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa 480

gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 540

ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 600

cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt 660

gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 720

gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga 780

actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat 840

ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 900

caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga 960

ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc tccgtcctgc accaggactg 1020

gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga 1080

gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgcctcc 1140

atctcgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1200

tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1260

cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga 1320

caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1380

caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1426

<210> 7

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Met Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ile Thr

20 25 30

Ala Ala Ser Leu Gly Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro

50 55 60

Lys Pro Trp Ile Phe Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn

100 105 110

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 8

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcttaatt gccgccacca tggagacacc cgcccagctg ctgttcctgc tgctgctgtg 60

gctgcccgac accaccggca tggacatcgt gctgacccag tccccagaca tcactgctgc 120

ttctctgggc cagaaggtta ctatcacttg ctctgcttct tccagcgttt cctacatgca 180

ctggtaccag cagaagtccg gcactagccc taagccttgg atcttcgaga tctccaagct 240

ggcttccggc gtgccggctc gcttctccgg ctctggttcc ggcactagct actccctgac 300

catctcttcc atggaggctg aggacgctgc tatctactac tgccagcagt ggaactaccc 360

attcactttc ggcggtggta ctaagctgga gatcaagcgg accgtggcgg cgccatctgt 420

cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctggt accgctagcg ttgtgtgcct 480

gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 540

atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 600

cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 660

agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta 720

g 721