本发明涉及一种高纯度磷脂酰丝氨酸的制备方法，尤其涉及一种应用分子印迹技术纯化磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术：
印迹技术是将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程。Southern在1975年首先提出了分子印迹的概念。他将琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段在凝胶中进行变性使其成为单链，然后将一张硝酸纤维素(NC)膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使凝胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的NC膜就可以在杂交液与另一种带有标记的DNA或RNA分子(即探针)进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为“blotting”，译为“印迹技术”。
当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。
磷脂酰丝氨酸，又称复合神经酸，英文名Phosphatidylserine，简称PS，由天然大豆榨油剩余物提取，是细胞膜的活性物质，尤其存在于大脑细胞中。其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能，由于其具有很强的亲脂性，吸收后能够迅速通过血脑屏障进入大脑，起到舒缓血管平滑肌细胞，增加脑部供血的作用。被誉为继胆碱和“脑黄金”DHA之后的一大新兴的“智能营养素”。专家认为，这种天然物质能够帮助细胞壁保持柔韧性，并且能够增强传送大脑信号的神经递质的效率，帮助大脑高效运转，激发大脑的活化状态。
目前市售磷脂酰丝氨酸，纯度规格以20％、40％和50％为主，因其制备过程复杂，实验条件苛刻，尚未有纯度为70％及以上规格的产品批量销售。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作过程简单、实验条件温和的高纯度磷脂酰丝氨酸的制备方法，该方法能够批量生产高纯度磷脂酰丝氨酸。通常将纯度大于等于70％的磷脂酰丝氨酸称为高纯度磷脂酰丝氨酸。
本发明的技术解决方案是：
提供一种高纯度磷脂酰丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：磷脂酰丝氨酸分子印迹聚合物的制备；
1.1：将一份磷脂酰丝氨酸加入反应容器中，向该反应容器加入正己烷，使磷脂酰丝氨酸溶解；
1.2：向步骤1.1的溶液中加入1.5-2份的丙烯酰胺，搅拌0.5-1小时后依次加入15-20份的乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1-0.2份的偶氮二异丁腈，然后向反应容器中充入氮气，密封加热至50-70℃，搅拌20-30小时，得到块状聚合物；
1.3：将步骤1.2得到的块状聚合物粉碎后过60-100目筛，将过完筛的粉末装入色谱柱中，依次用体积比为15-20:1的甲醇-醋酸溶液、甲醇、体积比为20-30:1甲醇-二乙胺溶液和甲醇冲洗上述色谱柱，收集色谱柱中的固体，低温干燥后得到分子印迹聚合物；
步骤二：制备高纯度磷脂酰丝氨酸；
2.1：将步骤1.3中得到的分子印迹聚合物装入色谱柱中；
2.2：将低纯度磷脂酰丝氨酸溶解于正己烷中，得到磷脂酰丝氨酸粗品溶液；
2.3：将步骤2.2得到的磷脂酰丝氨酸粗品溶液加入步骤2.1的色谱柱上，用用体积比为15-20:1的甲醇-醋酸溶液洗脱，收集洗脱液；
2.4：用正己烷萃取步骤2.3得到的洗脱液，收集并浓缩正己烷相，即得到高纯度磷脂酰丝氨酸产品。
检测纯度的方法为：通过HPLC配蒸发光散射检测器进行检测，具体过程采用外标法。
本发明的有益效果是：
通过本发明的制备方法可以得到纯度大于70％的磷脂酰丝氨酸产品，制备方法简单，实验条件温和，生产成本低，提高了产品的经济价值。
具体实施方式
实施例一：
首先，称取20g自制的90％的磷脂酰丝氨酸加入反应容器中，向该反应容器中加100ml正己烷，使得磷脂酰丝氨酸溶解；然后，向该反应容器加入30g丙烯酰胺，搅拌半小时后再依次加入300g乙二醇二甲基丙烯酸酯和2g偶氮二异丁腈，向反应容器中充入氮气后密封，加热至50℃恒温搅拌20小时，得到块状聚合物。
将该块状聚合物粉碎后过60目筛，将筛出的粉末装入色谱柱中，依次用体积比为15:1的甲醇-醋酸溶液200ml、甲醇300ml、体积比为20:1的甲醇-二乙胺溶液200ml和甲醇300ml冲洗色谱柱，将模板分子、残留的功能单体、交联剂冲洗干净，50℃干燥后既得分子印迹聚合物。
将100g制备好的分子印迹聚合物装到色谱柱内；然后将10g50％的磷脂酰丝氨酸溶解于100ml正己烷中，该溶液通过装有分子印迹聚合物的色谱柱吸附，用300ml体积比为15:1甲醇-醋酸洗脱，收集洗脱液，用150ml正己烷萃取两次，合并正己烷相，浓缩，得到高含量磷脂酰丝氨酸产品。经HPLC检测，含量可达到76.35％。
实施例二：
首先，称取20g自制的90％的磷脂酰丝氨酸加入反应容器中，向该反应容器中加150ml正己烷溶解磷脂酰丝氨酸；然后向该反应容器加入35g丙烯酰胺，搅拌45分钟后依次加入350g乙二醇二甲基丙烯酸酯和2.5g偶氮二异丁腈，然后向反应容器中充入氮气，密封反应容器，加热至60℃保温搅拌25小时，得到块状聚合物。
将该块状聚合物粉碎后过60目筛，将筛出的粉末装入色谱柱中，依次用体积比为18:1的甲醇-醋酸溶液200ml、甲醇300ml、体积比为25:1的甲醇-二乙胺溶液200ml和甲醇300ml冲洗色谱柱，将模板分子、残留的功能单体、交联剂冲洗干净，45℃干燥后既得分子印迹聚合物。
将制备好的分子印迹聚合物100g装到色谱柱内，然后将13g50％的磷脂酰丝氨酸溶解于100ml正己烷中，该溶液通过装有分子印迹聚合物的色谱柱吸附，用300ml体积比为20:1甲醇-醋酸洗脱，收集洗脱液，用150ml正己烷萃取两次，合并正己烷相，浓缩，得到高含量磷脂酰丝氨酸产品。经HPLC检测，含量可达到72.43％。
实施例三：
首先称取20g自制的90％的磷脂酰丝氨酸加入反应容器中，向该反应容器加200ml正己烷溶解磷脂酰丝氨酸，然后向该反应容器加入40g丙烯酰胺，搅拌半小时，再向该反应容器依次加入400g乙二醇二甲基丙烯酸酯和3g偶氮二异丁腈，然后向该反应容器充氮气后密封，加热至70℃保温搅拌30小时，得到块状聚合物。
将该块状聚合物粉碎后过60目筛，将筛出的粉末装入色谱柱中，依次用体积比为20:1的甲醇-醋酸溶液200ml、甲醇300ml、体积比为30:1的甲醇-二乙胺溶液200ml和甲醇300ml冲洗色谱柱，将模板分子、残留的功能单体、交联剂冲洗干净，40℃干燥后既得分子印迹聚合物。
将制备好的分子印迹聚合物100g装到色谱柱内，然后将6g50％的磷脂酰丝氨酸溶解于100ml正己烷中，该溶液通过色谱柱吸附，用300ml体积比为18:1甲醇-醋酸洗脱，收集洗脱液，用150ml正己烷萃取两次，合并正己烷相，浓缩，得到高含量磷脂酰丝氨酸产品。经HPLC检测，含量可达到81.79％。
本发明的原理为：当印迹分子(90％磷脂酰丝氨酸)与聚合物单体(丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈)接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当印迹分子除去后，分子印迹聚合物中就形成了与印迹分子空间构型相匹配的具有多重作用点的孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与印迹分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，粗品磷脂酰丝氨酸通过与分子印迹聚合物接触，进入孔穴，得到高含量磷脂酰丝氨酸产品。这种分子印迹聚合物就像锁一样对此钥匙具有选择性。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统，这样的孔穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。