鉴定小麦籽粒性状的特异SNP及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种鉴定小麦籽粒性状的特异snp及其应用。
背景技术：
：小麦是世界上种植面积最大的粮食作物，在我国，小麦的种植面积仅次于玉米和水稻，占粮食总产值的21％左右。小麦产量是直接影响我国人民生活水平高低和国家粮食安全与否的重要因素。提高小麦产量、使其高产稳产一直以来是我国小麦育种家们长期追求的主要目标。然而，目前我国小麦生产处于缓慢发展阶段，小麦单产年均增长不到0.8％。随着人口的增长、城镇化、土地沙漠化和盐碱化，粮食种植面积将日益减少，这与粮食消费需求不断刚性增长的矛盾越来越突出和严重。因此，利用分子生物学技术克隆小麦产量相关功能基因，并以此开发功能性分子标记，为小麦分子标记辅助育种提供重要参考基因资源，对加速我国小麦育种进程、提高我国小麦产量方面具有重要的科学意义和实际应用价值。粒重是产量的三要素之一，决定粒重的关键因素包括粒型和籽粒的灌浆速率。在生产和育种实践中，千粒重常被用作为衡量籽粒大小的指标，主要由粒型性状指标(如粒长、粒宽和粒厚等影响要素)构成并与产量呈显著正相关关系。技术实现要素：本发明的目的是提供一种鉴定小麦籽粒性状的特异snp及其应用。本发明提供了一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因组dna中基于2144snp位点的基因型为aa基因型、at基因型还是tt基因型；aa基因型小麦的籽粒性状优于tt基因型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因组dna中基于2144snp位点的基因型为aa基因型、at基因型还是tt基因型；如果为aa基因型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为tt基因型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因组dna中基于2144snp位点的基因型为aa基因型、at基因型还是tt基因型；如果为aa基因型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为tt基因型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。以上任一所述方法中，“检测待测小麦的基因组dna中基于2144snp位点的基因型为aa基因型、at基因型还是tt基因型”的方法包括如下步骤：以待测小麦的基因组dna为模板，采用特异引物组进行pcr扩增，通过检测pcr扩增产物得到基因型结果。所述特异引物组为引物组ⅰ或引物组ⅱ；所述引物组ⅰ由2144f1、2144f2和2144c组成；所述引物2144f1为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列5所示的单链dna分子；(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；所述2144f2为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列6所示的单链dna分子；(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子；所述2144c为如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列7所示的单链dna分子；(b6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的dna分子。所述引物组ⅱ由tatpp-f1和tatpp-r1组成；所述tatpp-f1为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列1所示的单链dna分子；(c2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；所述tatpp-r1为如下(c3)或(c4)：(c3)序列表的序列2所示的单链dna分子；(c4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。所述引物组ⅰ为基于kasp技术的引物组。所述引物组ⅱ为基于普通pcr技术的引物组。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增的反应体系中，2144f1、2144f2和2144c的摩尔比为12：12：30。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增的反应体系中，2144f1的浓度为12μm、2144f2的浓度为12μm、2144c的浓度为30μm。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增的反应体系中，镁离子的浓度为0.2mm。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增的反应体系组成具体可为：模板2.2μl(dna含量约为100ng)、mgcl2水溶液0.04μl、2×mastermix2.5μl、混合引物溶液(混合引物溶液含有2144f1、2144f2和2144c)0.056μl，用ddh2o补足至5μl。2×mastermix的全称为“kaspv4.02×mastermix96/384(lowrox)”，北京lgc公司，产品目录号为kbs-1016-017。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增的反应程序具体可为：94℃15min；95℃20s、某一温度20s(第一次循环的温度为65℃，每次循环比前一循环减低1℃)，10个循环；95℃20s、57℃20s，30个循环。当采用所述引物组ⅰ时，pcr扩增在abi公司生产的quantstudio7仪器上运行，自动输出基因分型结果。如果基因分型的结果为alle2(蓝色圆点)，供试小麦为aa基因型；如果基因分型的结果为alle1(红色圆点)，供试小麦为tt基因型；如果基因分型结果为alle1/alle2，供试小麦为at基因型。本发明还保护用于检测小麦的基因组dna中基于2144snp位点的基因型的物质的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：(d1)鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长；(d2)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重；(d3)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长；(d4)制备具有(d1)或(d2)或(d3)所述用途的试剂盒。本发明还保护特异dna分子(分子标记)，如序列表的序列8所示。当n(也可用“n”表示)为a时，作为高千粒重和/或长粒长的分子标记。当n(也可用“n”表示)为t时作为低千粒重和/或短粒长的分子标记。所述高千粒重为籽粒千粒重≥35g。所述低千粒重为籽粒千粒重＜35g。所述长粒长为籽粒粒长≥0.65mm。所述短粒长为籽粒粒长＜0.65mm。本发明还保护所述引物组ⅰ或所述引物组ⅱ。本发明还保护所述引物组ⅰ或所述引物组ⅱ的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：(d1)鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长；(d2)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重；(d3)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长；(d4)制备具有(d1)或(d2)或(d3)所述用途的试剂盒。本发明还保护一种试剂盒，含有所述引物组ⅰ或所述引物组ⅱ；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长；(d2)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重；(d3)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长。本发明还保护以上任一所述方法或特异dna分子或引物组或试剂盒在小麦育种中的应用。所述育种的目的为筛选高千粒重小麦，进行所述育种时选择基于2144snp位点的基因型为aa基因型的小麦。所述育种的目的为筛选低千粒重小麦，进行所述育种时选择基于2144snp位点的基因型为tt基因型的小麦。所述育种的目的为筛选长粒长小麦，进行所述育种时选择基于2144snp位点的基因型为aa基因型的小麦。所述育种的目的为筛选短粒长小麦，进行所述育种时选择基于2144snp位点的基因型为tt基因型的小麦。所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦。所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦。所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。以上任一所述2144snp位点为序列表的序列8自5’末端第24位核苷酸。本发明开发了与小麦籽粒性状相关的snp位点，并在该snp位点的基础上设计了基于kasp技术的引物组。应用本发明提供的引物组鉴定小麦籽粒性状，具有快捷、方便、准确等优点。本发明对于选育具有不同籽粒性状的小麦具有极好的应用前景。附图说明图1为实施例2的步骤一种的部分原始分型数据。图2为对不同年代育成品种的千粒重以及a/t等位基因变异的频率的变化趋势进行分析的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、特异snp的发现以及特异引物组的设计一、特异snp的发掘供试小麦材料：选择分布于我国不同麦区的，籽粒性状差异较大的34份小麦材料(编号为c1-34，具体材料信息见表1)作为多态性位点的发掘材料。2、序列比对各个供试小麦材料分别进行如下步骤操作：1、提取供试小麦材料的基因组dna。2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用tatpp-f1和tatpp-r1组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。tatpp-f1(序列表的序列1)：5’-cgtgtggttgtttgcgtg-3’；tatpp-r1(序列表的序列2)：5’-ctagatataggcgagggttattac-3’。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，进行克隆测序。每份小麦材料测24个克隆。4、进行序列拼接和比对。将每份小麦材料的24个克隆测序结果进行a基因组序列评接和比对分析，发现不同供试小麦的a基因组pcr扩增产物有两种。两种pcr扩增产物均为2254bp，5’末端均与tatpp-f1一致，3’末端均与tatpp-r1反向互补，一种pcr扩增产物自5’末端第2121-2168位核苷酸如序列表的序列3所示，另一种pcr扩增产物自5’末端第2121-2168位核苷酸如序列表的序列4所示基于所有供试小麦的pcr扩增产物的序列比对，发现一个snp，将其命名为2144snp，为a/t多态。2144snp即序列表的序列8自5’末端第24位核苷酸。各个供试小麦材料基于2144snp的基因型见表1。5、供试小麦材料2012年10月种植于中国农业科学院作物科学研究所院内大网室，常规灌溉施肥管理，2013年7月收获籽粒并测量千粒重。各个供试小麦材料的千粒重见表1。表1编号名称千粒重基因型编号名称千粒重基因型c1中优950751.7gaac18鲁麦9号26.45gttc2郑麦902344.1gaac19铭贤16933.2gttc3攀86001-352.8gaac20安徽3号18.29gttc4晋麦8号41.3gaac21抢场麦30.4gttc5莱州95342.05gaac22白冬麦15.75gttc6小白芒44.42gaac23兰花麦28.6gttc7三颗寸53.66gaac24白芒麦29.85gttc8紫秸红44.35gaac25白花麦24.45gttc9红芒子37.54gaac26中国春27.35gttc10鱼鳅麦44.29gaac27吕旱32833.7gttc11鲁麦1号45.658gaac28农大13932.05gaac12北京1528.55gttc29泾阳6027.3gttc13石家庄5433.28gttc30烟农1534.05gttc14徐州2251.3gaac31白麦子24.45gttc15温麦8号51.7gaac32麻花板20.9gttc16兰考90651.7gaac33红金麦23.4gttc17矮丰3号34.464gttc34三月黄28.85gtt34个供试小麦中，基于2144snp的基因型，15个为aa基因型，19个为tt基因型。aa基因型的供试小麦的籽粒平均千粒重为45.91g，tt基因型的供试小麦的籽粒平均千粒重为27.54g。以千粒重为35g为阈值，籽粒千粒重为35g以上的小麦为高千粒重小麦，籽粒千粒重小于35g的小麦为低千粒重小麦。如果待测小麦基于2144snp的基因型为aa型，该待测小麦为候选的高千粒重小麦；如果待测小麦基于2144snp的基因型为tt型，该待测小麦为候选的低千粒重小麦。用该方法鉴定上述34个供试小麦中的高千粒重小麦的准确率为93％(14/15)，用该方法鉴定上述34个供试小麦中的低千粒重小麦的准确率为100％(19/19)。二、特异引物组的设计根据步骤一发现的特异snp，设计基于kasp技术的引物组如下：2144f1(序列表的序列5)：5’-gaaggtgaccaagttcatgcttcacagactgccacatcagcggct-3’；2144f2(序列表的序列6)：5’-gaaggtcggagtcaacggatttcacagactgccacatcagcggca-3’；2144c(序列表的序列7)：5’-tcttgataaatcagtgccaggag-3’；三、特异引物组的应用步骤一的各个供试小麦材料分别进行如下步骤操作：1、提取供试小麦材料的基因组dna。2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用步骤二设计的特异引物组进行pcr扩增。pcr扩增的反应体系：模板2.2μl(dna含量约为100ng)、mgcl2水溶液0.04μl、2×mastermix2.5μl、混合引物溶液(混合引物溶液含有2144f1、2144f2和2144c)0.056μl，用ddh2o补足至5μl。pcr反应体系中，镁离子的浓度为0.2mm，2144f1的浓度为12μm、2144f2的浓度为12μm、2144c的浓度为30μm。2×mastermix的全称为“kaspv4.02×mastermix96/384(lowrox)”，北京lgc公司，产品目录号为kbs-1016-017。pcr扩增的反应程序：94℃15min；95℃20s、某一温度20s(第一次循环的温度为65℃，每次循环比前一循环减低1℃)，10个循环；95℃20s、57℃20s，30个循环。pcr扩增在abi公司生产的quantstudio7仪器上运行，自动输出基因分型结果。如果基因分型的结果为alle2(蓝色圆点)，供试小麦为aa基因型；如果基因分型的结果为alle1(红色圆点)，供试小麦为tt基因型；如果基因分型结果为alle1/alle2，供试小麦为at基因型。各个供试小麦的基因型检测结果与步骤一的基因型检测结果一致。实施例2、应用特异引物组检测大样本各个供试小麦材料见表2。一、基因型检测1、提取供试小麦材料的基因组dna。2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用实施例1的步骤二设计的特异引物组进行pcr扩增。pcr扩增的反应体系：模板2.2μl(dna含量约为100ng)、mgcl2水溶液0.04μl、2×mastermix2.5μl、混合引物溶液(混合引物溶液含有2144f1、2144f2和2144c)0.056μl，用ddh2o补足至5μl。pcr反应体系中，镁离子的浓度为0.2mm，2144f1的浓度为12μm、2144f2的浓度为12μm、2144c的浓度为30μm。2×mastermix的全称为“kaspv4.02×mastermix96/384(lowrox)”，北京lgc公司，产品目录号为kbs-1016-017。pcr扩增的反应程序：94℃15min；95℃20s、某一温度20s(第一次循环的温度为65℃，每次循环比前一循环减低1℃)，10个循环；95℃20s、57℃20s，30个循环。pcr扩增在abi公司生产的quantstudio7仪器上运行，自动输出基因分型结果。如果基因分型的结果为alle2(蓝色圆点)，供试小麦为aa基因型；如果基因分型的结果为alle1(红色圆点)，供试小麦为tt基因型；如果基因分型结果为alle1/alle2，供试小麦为at基因型。各个供试小麦材料基于2144snp的基因型检测结果见表2、表3和表4。部分原始分型数据见图1。二、性状检测2002、2005和2006年，将供试小麦材料种植于河南洛阳，常规水肥管理，收获籽粒并测量千粒重(tkw)、粒长(kl)和粒宽(kw)。aa基因型的供试小麦材料的结果见表2(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。at基因型的供试小麦材料的结果见表3(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。tt基因型的供试小麦材料的结果见表4(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。从大趋势来看，aa基因型小麦的千粒重大于tt基因型小麦，aa基因型小麦的粒长大于tt基因型小麦。千粒重≥35g，定义为高千粒重；千粒重＜35g，定义为低千粒重。粒长≥0.65mm，定义为长粒长；粒长＜0.65mm定义为短粒长。将aa基因型的小麦鉴定为高千粒重小麦、长粒长小麦，准确率结果见表2。将tt基因型的小麦鉴定为低千粒重小麦、短粒长小麦，准确率结果见表4。表2表3表4三、关联分析供试小麦材料中，选育品种的关联分析的结果见表5。结果显示：aa基因型的供试小麦的三年平均千粒重为41.50g，而tt基因型的供试小麦的三年平均千粒重为36.45g，差异达到极显著水平(p<0.01)；在粒长性状上，aa基因型的小麦材料较tt基因型的小麦材料籽粒长，差异达到显著或极显著水平(p<0.05或p<0.01)。由此可知，相较于tt基因型而言，aa基因型为优良籽粒性状基因型。表5注：*p<0.05，**p<0.01。供试小麦材料中，地方品种的关联分析的结果见表6。结果显示：aa基因型的供试小麦的三年平均千粒重为38.9g，而tt基因型的供试小麦的三年平均千粒重为31.55g，差异达到极显著水平(p<0.01)；在粒长性状上，aa基因型的小麦材料较tt基因型的小麦材料籽粒长，差异达到显著或极显著水平(p<0.05或p<0.01)。由此可知，相较于tt基因型而言，aa基因型为优良籽粒性状基因型。表6注：*p<0.05，**p<0.01。实施例3、基于实施例2的结果，对不同年代育成品种的千粒重以及a/t等位基因变异的频率的变化趋势进行分析，结果见图2。随着年代的推移，我国小麦育成品种的千粒重呈现增大的趋势，与这种变化趋势相一致的是，优异等位变异a在不同年代品种中的出现频率也呈升高的趋势，这表明现代育种对该等位变异进行了很强的选择作用，而该变异与粒重显著相关。因此，该标记可作为提高小麦粒重、进行小麦高产分子标记辅助育种的功能标记。当前第1页12