1.一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法,其特征在于:其包括以下的步骤:
步骤一:单核细胞(吞噬细胞前体)的分离与培养;
步骤二:单核细胞体功能的鉴定;
步骤三:单核细胞诱导为吞噬细胞。
2.根据权利要求1所述的一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法,其特征在于:步骤一中,具体步骤如下:
S1:抽取鱼类外周血,以全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀得稀释血液;
S2:取稀释血液1.5倍量、比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液,与血液于离心管中混合;
S2:水平离心机1800-2100rpm离心18-21min,收集单个核细胞层;
S4:加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次,900-1100rpm 离心5min收集细胞沉淀;
S5:重悬于DMEM完全培养基,接种在培养瓶置于24℃培养箱培养3 h;
S6:Hank’s缓冲液洗去上清,加入新鲜培养基继续培养贴壁细胞;
S7:离心获得单核细胞层,即包括淋巴细胞和单核细胞;
S8:将分离后的单个核细胞重悬于添加促贴壁生长因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培养基中;
S9:培养2-4h后洗去悬浮淋巴细胞,获得贴壁的单核细胞。
3.根据权利要求1所述的一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法,其特征在于:步骤三中,具体步骤如下:
S1:在含有单核细胞及15%胎牛血清的完全DMEM培养集中加入5-10%的淋巴细胞;
S2:隔天半量换取新鲜DMEM完全培养基,培养3-12天。
4.一种单核/吞噬细胞的功能验证方法,其特征在于:其包括以下的步骤:
S1:设实验组和对照组,实验组用3.18×105 CFU/g (半致死剂量,LD50) 对半滑舌鳎进行腹腔注射,对照组参照实验组注射与体重相应剂量的PBS注射;24h后分别无菌取实验组鱼和对照组鱼外周血,按照权利要求2的方法分离获得单核细胞;
S2:将分离得到的单核细胞加佛波酯(PMA)刺激剂50ul,在23-25℃下孵育15min;
S3:加二氢若丹明25ul,在24℃下避光孵育5min;
S4:采用PBS缓冲液洗涤2次;
S5:1500rpm离心5min;
S6:去上清液,加0.5mlPBS缓冲液重悬细胞;
S7:用上流式细胞仪检测。