一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养及功能验证方法与流程

本发明属于生物细胞培养技术领域，具体地说涉及一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养及功能验证方法。

背景技术：

随着近年来养殖规模的扩大，由鳗弧菌等有害细菌引起的病害问题严重阻碍了高经济价值鱼类（如半滑舌鳎）养殖产业的发展。目前尚无有效的免疫防治技术和方法，仍然采用化学药物和抗生素等传统的方式来控制病害的发生。外周血单核细胞（吞噬细胞的前体），是鱼类体液免疫的重要组成部分，在鱼类特异性免疫和非特异性免疫过程中起着重要作用。目前对于半滑舌鳎等鱼类单核细胞的免疫功能研究尚属起步阶段，尚不清楚其作用机制，而且目前为止未获得能连续培养用于细胞功能研究的半滑舌鳎吞噬细胞。

吞噬细胞的前体是单核细胞，细胞呈球形、圆梨形或不规则形，表面有细长的伪足样胞突。单核细胞的核较小，呈肾形或马蹄形，常偏于一侧，核质比<1。在Giemsa染色中，单核细胞的细胞核呈网格状。透射电镜下，其胞质内有较多的线粒体，有时还有高尔基体、粗面型内质网、核糖体以及被吞噬的衰老细胞或其细胞核等。

单核细胞具有较强的吞噬能力，在鱼类机体中发挥着重要的非特异性吞噬功能。它可通过伪足样胞突捕捉并融合外来物质以及自身的衰老细胞，并能产生活跃的变形运动。另外，单核细胞对环境变化也十分敏感，在生活于严重污染水域的鱼类中，单核细胞的含量可比正常情况高近50倍。在鱼类被寄生虫感染或被人为地注入胶碳颗粒等物质后，也可引起单核细胞数量的骤增。因此，通过测定鱼类单核细胞的数量，可以初步了解鱼类的健康状况及其生活水域的环境质量。

单核细胞以及单核细胞转化后的吞噬细胞在抵抗和防御病原体感染中发挥重要作用，尤其是在细胞内的病原体防御中发挥了巨大的作用。另外，吞噬细胞还存在于被吞噬细胞吞噬后的碎片中，它们在天然免疫和获得性免疫中也发挥着至关重要的作用。根据组织内环境以及它们自身所处的不同分化及活性阶段，它们都表现出不同的机能、形态和代谢作用。单核细胞来源于骨髓中的造血前驱细胞，它经过2-3 d的血液循环便移行到各个组织当中，从而分化形成组织中的吞噬细胞。

获得能在体外长期存活并可传代培养的细胞，是进行细胞免疫学等研究的基础。常见单核细胞分离方法包括：血浆凝胶法，标准 Ficoll 法和Percoll-paque 法。但是这些方法单独利用容易产生淋巴细胞、粒性白细胞、血小板和各种红细胞的混合悬液。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，为了解决上述问题，本发明提出一种用于鱼类单核细胞的分离、培养、转化及功能验证方法。具体的方案如下：

一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法，其包括以下的步骤：

步骤一：单核细胞的分离与培养；

步骤二：单核细胞诱导为吞噬细胞的体外培养；

进一步，步骤一中，具体步骤如下：

S1:抽取鱼类外周血，以全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀得稀释血液；

S2:取稀释血液1.5倍量、比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液与释释血液于离心管中；

S2:水平离心机1800-2100rpm离心18-21分钟，收集单个核细胞层；

S4:加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次，900-1100rpm 离心5min收集细胞沉淀；

S5:重悬于DMEM完全培养基，接种在培养瓶置于24℃培养箱培养3 h；

S6:Hank’s缓冲液洗去上清，加入新鲜培养基继续培养贴壁细胞；

S7:离心获得单核细胞层，即包括淋巴细胞和单核细胞；

S8:将分离后的单个核细胞重悬于添加促贴壁生长因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培养基中；

S9:培养2-4h后洗去悬浮淋巴细胞，获得贴壁的单核细胞。

进一步，步骤二中，具体步骤如下：

S1:在含有单核细胞、15%胎牛血清的完全DMEM培养集中加入10-15%的淋巴细胞；

S2:隔天半量换取新鲜DMEM完全培养基，培养3-12天。

一种单核/吞噬细胞的功能验证方法，其包括以下的步骤：

S1:将分离得到的单核细胞加佛波酯（PMA）刺激剂50ul，在23-25℃下孵育15min；

S2:加二氢若丹明25ul，在24℃下避光孵育5min；

S3:采用PBS缓冲液洗涤2次；

S4:1500rpm离心5min；

S5:去上清液，加0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；

S6:用上流式细胞仪检测。

本发明的有益效果是：

本发明用细胞分离液进行密度梯度离心，通过修正实验过程中的各种参数和实验条件，成功的分离纯化鱼类单核细胞（吞噬细胞），而后通过优化营养和培养条件，将半滑舌鳎单核细胞以贴壁生长的方式培养一周以上，可满足于后续实验。本发明成功进行了吞噬细胞的呼吸爆发检测，为深入研究单核/吞噬细胞的生物学特性和免疫学功能提供材料。

附图说明

图1为本发明实施例中单核细胞形态（A：培养12h；B：培养24h；C：培养32h；D：培养38h）；

图2为本发明实施例中单核细胞生长曲线;

图3为本发明实施例中PMA刺激下的呼吸爆发检测；

图4为本发明实施例中鳗弧菌感染后的呼吸爆发检测；

图5为本发明实施例中单核细胞与吞噬细胞；

图6为本发明实施例中吞噬细胞的几种形态；

图7为本发明实施例中老化的吞噬细胞；

图8为本发明实施例中姬姆萨染色的吞噬细胞；

图9为本发明实施例中吞噬鸡红细胞的吞噬细胞；

图10为本发明实施例中培养第 5 天吞噬细胞染色体中期分裂相；

图11为本发明实施例中吞噬细胞染色体数分布。

具体实施方式

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：在鱼类外周血细胞中，各种细胞由于形态和重量的差异，导致在进行密度梯度离心时：比重最大的红细胞和粒细胞，次之的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞) ，比重最小的血栓细胞会在分离时处于不同层次。因此，通过修正离心转速，离心时间，以及分离液的密度比例，就可以利用密度梯度离心的方法，将上述细胞进行分离。离心后，从上到下可分为透明的血浆层，呈白膜状的单个核细胞层，透明的分离液层，粒细胞和红细胞比重最大，沉在最下面，从而达到粗分离的目的；其次，白膜层中的淋巴细胞和吞噬细胞在培养基中培养时贴壁的能力存在差异，因此通过不通贴壁力的区分，可以成功分离吞噬细胞，细胞培养基中的血清能促进细胞生长，并有助于细胞贴壁，因此通过修正血清的加入量和加入时机，在培养一定时间后，通过修正胰酶浓度，来消化贴壁细胞可有效分离吞噬细胞和淋巴细胞；而且，在体外单核细胞会被吞噬细胞集落刺激因子（M-CSF）活化成吞噬细胞，吞噬细胞具有吞噬活性，呼吸爆发等特征。这是淋巴细胞和吞噬细胞之间最大的差异，可通过此条件鉴定吞噬细胞。

实施例：以半滑舌鳎为例，介绍本发明的一种用于鱼类吞噬细胞的培养、功能验证及吞噬细胞的转化方法。

1.半滑舌鳎外周血单核细胞的分离与培养

半滑舌鳎于冰水中麻醉， 70%酒精棉球擦拭背部尾静脉，肝素抗凝管抽取外周血2ml，于超净工作台中将全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀，取比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液3ml于15ml离心管中，加入2ml稀释血液于水平离心机1800-2100rpm离心18-21分钟，收集单个核细胞层，加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次，900-1100rpm 离心5min收集细胞沉淀，重悬于DMEM完全培养基，接种在培养瓶置于24℃培养箱培养3 h，Hank’s缓冲液洗去上清，加入新鲜培养基继续培养贴壁细胞，隔天半量换新鲜的完全DMEM培养基，倒置显微镜下观察细胞形态。

利用半滑舌鳎外周血不同细胞的比重差异，离心获得单核细胞层，即包括淋巴细胞和单核细胞，根据淋巴细胞在体外不贴壁呈悬浮状态，而单核细胞极易贴壁的特点，将分离后的单个核细胞重悬于添加促贴壁生长因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培养基中，培养2-4h后洗去悬浮淋巴细胞，获得贴壁的单核细胞，可培养一周以上，倒置显微镜下单核细胞形态图1。胞体直径12～16μm，细胞呈现扇形，多边形等不规则形态，胞质量多，具有较强的贴壁性。

2.MTT法检测单核细胞体外生长曲线

将分离的单核细胞接种于96孔培养板中，置于培养箱中24℃培养。分别在0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h加入50ul MTT溶液，培养箱继续孵育4h。洗净上清，每孔加150ul DMSO，平板摇床10min，酶标仪检测在570nm波长处每孔的光密度，重复三次。MTT法检测的半滑舌鳎单核细胞体外生长曲线见图2。细胞在接种3h就能很好的贴壁，12h后迅速增殖，48h细胞数量基本稳定，细胞呈现聚集生长现象，形态不规则形。

3.单核细胞呼吸爆发的测定

分离得到的单核细胞加佛波酯（PMA）刺激剂50ul，23-25℃孵育15min，加二氢若丹明25ul，24℃避光孵育5min，PBS缓冲液洗涤2次，1500rpm离心5min，去上清液，加0.5mlPBS缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测，设置对照组，对照组不加入单核细胞；同时直接对半滑舌鳎进行鳗弧菌感染：设实验组和对照组，实验组用3.18×10⁵ CFU/g (半致死剂量，LD50) 对半滑舌鳎进行腹腔注射，对照组参照实验组注射与体重相应剂量的PBS注射。24h后分别无菌取实验组鱼和对照组鱼外周血，按照上述方法分离获得单核细胞，加佛波酯（PMA）刺激剂50ul24℃孵育15min，加二氢若丹明25ul，24℃避光孵育5min，PBS缓冲液洗涤2次，1500rpm离心5min，去上清液，加0.5mlPBS缓冲液重悬细胞，分别上流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测结果如图3，正常细胞对照组中发荧光的细胞比例为0.4%，而实验组中PMA刺激下的单核细胞发荧光的细胞比例为80.67%，说明分离得到的单核细胞具有呼吸爆发功能。鳗弧菌感染后分离获得的单核细胞的呼吸爆发如图4，对照组中发荧光的细胞比例为4.18%，而实验组中发荧光的细胞比例为83.81%，说明病原刺激显著增强单核细胞呼吸爆发强度。

4.单核细胞诱导为吞噬细胞的体外培养

单核细胞和淋巴细胞体外共培养，能刺激单核细胞活化变为典型的吞噬细胞。因此在含有15%胎牛血清的完全DMEM培养集中加入5-10%数量比的淋巴细胞，隔天半量换取新鲜DMEM完全培养基。细胞培养3d后，倒置相差显微镜下观察（如图5）。吞噬细胞贴壁，细胞伸展，牢固黏附，体积明显增大，从不规则形逐渐变成椭圆形，呈煎蛋状，少数呈长梭形。细胞间可有部分融合，细胞周边或两极可见板状伪足和突起，细胞无明显增殖(如图6)，培养至13天，吞噬细胞发生老化（如图7）。

5.吞噬细胞染色观察

吞噬细胞培养至7天，PBS缓冲液洗去培养瓶中悬浮的淋巴细胞，加甲醇固定贴壁的吞噬细胞，滴加稀释好的姬姆萨染色液使其覆盖瓶底，室温染色20min，吸去染液，蒸馏水冲洗贴壁细胞，倒置显微镜观察发现，吞噬细胞细胞体积较大，形态不规则。胞浆丰富，淡粉色，富含颗粒及少许空泡。胞核蓝紫红色，为卵圆形、肾形或不规则形，具有典型的吞噬细胞形态学特征(图8)。

6.吞噬细胞吞噬功能的验证

鸡红细胞吞噬试验：培养第5d在培养体系中加入10-15％鸡红细胞悬液100ul/ml，24℃培养箱培养孵育30 min至1h，PBS冲洗后镜检。吞噬鸡红细胞的吞噬细胞，胞浆内可见多个鸡红胞，核被挤压(见图9)。外来病菌入侵吞噬细胞，镜检观察培养基先是浑浊，继续置于24℃培养箱培养，发现吞噬细胞最终将病菌吞噬，培养基变得澄清。

7.吞噬细胞染色体核型分析

在吞噬细胞培养至第 5 天时进行核型分析，制备染色体步骤如下：培养瓶内加入秋水仙素，浓度为1ug/ml，作用3-4h，吸弃培养基，PBS 冲洗，用 0.25%胰酶消化混合液消化后加入培养基吹打，吞噬细胞贴壁较紧，难消化的细胞使用细胞刮，再将细胞悬液移入 15ml 离心管，以 1500rpm 离心5min，吸弃上清，加入 5ml 的 0.0375M KCl 后 在 37℃水浴锅中低渗处理 25min，缓慢加入 1ml 新配的预冷卡诺固定液，以 1000rpm 离心 min，吸弃上清，加入 2ml 卡诺固定液，冰浴固定处理 15min，以 1000rpm 离心 5min，重复操作两次，第二次固定后根据离心收集的细胞多少留存 0.2-0.5ml卡诺固定液，冷滴片法滴片，待载玻片干燥后，用 5%Gimsa 染色 25min，干燥后油镜镜检。

对培养5天的吞噬细胞进行了染色体核型分析，在统计的 100 个分裂相中，染色体数目从 28-56不等，其中61%的分裂相染色体数目为 42 条（图 10），42 条染色体全部是端着丝点染色体，并且其中包含 W 异型染色体。染色体数目呈正态分布，二倍体染色体数目出现频率最高，其他非整倍体所占比例很小（图 11 ）。

以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施方式而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。