本发明属于细胞培养基
技术领域：
，具体涉及一种无血清干细胞培养基及其制备方法。
背景技术：
：干细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。因此采用的基础培养基常常要添加血清，如马血清或胎牛血清；因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。尤其是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。中国专利申请CN105087480A公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因子，补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。中国专利申请CN104357379A公开了一种干细胞培养基，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品如(IGF-1/2)、成纤维生长因子。目前，已经研发出不含血清的干细胞培养基，但是，现有的干细胞培养基存在细胞增殖的速度慢的问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无血清干细胞培养基及其制备方法。本发明提供的无血清干细胞培养基能快速扩增干细胞，大大缩短了干细胞培养的时间。本发明的技术方案是：一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子10-20ng/mL，成纤维细胞生长因子6-15ng/mL，昆布氨酸3-6mg/mL，胰高血糖素0.15-0.2μg/mL，人血白蛋白2-5mg/mL，转铁蛋白10-22μg/mL，腺苷脱氨酶2-6μg/mL，肉豆蔻酸0.8-2μM，亚油酸5-8μM，银耳多糖25-36μg/mL，槲皮素8-13μg/mL。一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子14ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/mL，昆布氨酸4mg/mL，胰高血糖素0.18μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，转铁蛋白15μg/mL，腺苷脱氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.3μM，亚油酸6μM，银耳多糖30μg/mL，槲皮素10μg/mL。优选地，所述基础培养基为DMEM或F12培养基。另外，本发明还提供了所述无血清干细胞培养基的制备方法，步骤如下：S1向基础培养基中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、昆布氨酸、胰高血糖素、人血白蛋白、转铁蛋白、腺苷脱氨酶、肉豆蔻酸、亚油酸、银耳多糖和槲皮素，混合均匀，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为5-10％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.0-7.5，即得。优选地，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的碳酸钠溶液。优选地，所述步骤S2调节培养基的pH至7.4。本发明无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，加入的添加剂包括表皮生长因子、昆布氨酸、胰高血糖素、银耳多糖等。发明人意外地发现，在无血清干细胞培养基中加入银耳多糖和槲皮素，这两种成分能与其他成分间相互作用，使干细胞的扩增速度得到进一步的提高。本发明无血清干细胞培养基搭配合理，各成分间相互协调，共同作用，提高了干细胞扩增速度，大大缩短了干细胞培养的时间。与现有技术相比，本发明提供的无血清干细胞培养基具有以下优势：(1)本发明提供的无血清干细胞培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染。(2)本发明提供的是一种无动物源性成分、成分确定的无血清干细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。(3)本发明提供的无血清干细胞培养基能快速扩增干细胞，大大缩短了干细胞培养的时间。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中DMEM培养基可购自Sigma公司，F12培养基可购自Sigma公司，银耳多糖可购自杭州众芝康菇生物技术有限公司，槲皮素可购自上海谱振生物有限公司。实施例1、一种无血清干细胞培养基所述无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子10ng/mL，成纤维细胞生长因子6ng/mL，昆布氨酸3mg/mL，胰高血糖素0.15μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，转铁蛋白10μg/mL，腺苷脱氨酶2μg/mL，肉豆蔻酸0.8μM，亚油酸5μM，银耳多糖25μg/mL，槲皮素8μg/mL。所述基础培养基为DMEM培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、昆布氨酸、胰高血糖素、人血白蛋白、转铁蛋白、腺苷脱氨酶、肉豆蔻酸、亚油酸、银耳多糖和槲皮素，混合均匀，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为5％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.0，即得。实施例2、一种无血清干细胞培养基所述无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子20ng/mL，成纤维细胞生长因子15ng/mL，昆布氨酸6mg/mL，胰高血糖素0.2μg/mL，人血白蛋白5mg/mL，转铁蛋白22μg/mL，腺苷脱氨酶6μg/mL，肉豆蔻酸2μM，亚油酸8μM，银耳多糖36μg/mL，槲皮素13μg/mL。所述基础培养基为DMEM培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、昆布氨酸、胰高血糖素、人血白蛋白、转铁蛋白、腺苷脱氨酶、肉豆蔻酸、亚油酸、银耳多糖和槲皮素，混合均匀，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为10％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.5，即得。实施例3、一种无血清干细胞培养基所述无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子14ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/mL，昆布氨酸4mg/mL，胰高血糖素0.18μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，转铁蛋白15μg/mL，腺苷脱氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.3μM，亚油酸6μM，银耳多糖30μg/mL，槲皮素10μg/mL。所述基础培养基为F12培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、昆布氨酸、胰高血糖素、人血白蛋白、转铁蛋白、腺苷脱氨酶、肉豆蔻酸、亚油酸、银耳多糖和槲皮素，混合均匀，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.4，即得。对比例1、一种无血清干细胞培养基所述无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子14ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/mL，昆布氨酸4mg/mL，胰高血糖素0.18μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，转铁蛋白15μg/mL，腺苷脱氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.3μM，亚油酸6μM，地木耳多糖30μg/mL，槲皮素10μg/mL。所述基础培养基为F12培养基。制备方法与实施例3类似。与实施例3的区别在于，将银耳多糖替换为地木耳多糖。对比例2、一种无血清干细胞培养基所述无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：表皮生长因子14ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/mL，昆布氨酸4mg/mL，胰高血糖素0.18μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，转铁蛋白15μg/mL，腺苷脱氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.3μM，亚油酸6μM，银耳多糖30μg/mL，黄芩素10μg/mL。所述基础培养基为F12培养基。制备方法与实施例3类似。与实施例3的区别在于，将槲皮素替换为黄芩素。试验例一、本发明无血清干细胞培养基对干细胞生长的影响1、试验对象：本发明实施例1-3所得无血清干细胞培养基，以及对比例1和对比例2所得无血清干细胞培养基。2、试验方法：用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20mL，在1h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后800r/min离心10分钟，反复冲洗3次后加入等量15g/LⅠ型胶原酶，37℃水浴中充分振荡30分钟。800r/min离心10分钟后弃去上清。将下层细胞用PBS悬浮后加入16mmol/LNH4Cl37℃水浴中10min以裂解红细胞。800r/min离心10分钟后，再用PBS冲洗3次。最后，将细胞分别用本发明本发明实施例1-3所得无血清干细胞培养基，以及对比例1和对比例2所得无血清干细胞培养基悬浮后移入培养瓶中，37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育。在培养开始，及第7天、14天、21天和28天时，分别计算细胞总数。结果如表1所示。表1：干细胞在不同培养基中扩增倍数培养基7天14天21天28天实施例1155.2±25.41368.6±50.66583.7±41.811232.5±78.6实施例2158.4±26.71372.4±43.16463.5±56.811240.3±82.4实施例3162.8±25.21375.9±42.76471.3±60.411246.5±81.6对比例140.3±15.8631.8±30.53238.5±54.35785.4±67.2对比例245.7±13.2724.6±25.43178.9±48.25645.8±58.3由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得无血清干细胞培养基中细胞的扩增倍数，明显大于生长在对比例1和对比例2所得无血清干细胞培养基中细胞的扩增倍数。这说明，本发明无血清干细胞培养基的扩增效果好。当前第1页1 2 3