NK细胞的制备方法与流程

本发明涉及一种细胞的制备方法，更具体的，本发明涉及使用细胞因子扩增NK细胞的方法。

背景技术：

自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，CD3^-CD56⁺淋巴细胞被定义为人NK细胞。NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。

肿瘤的生长是一个复杂的系统工程，涉及到肿瘤与肿瘤基质、血管生成因子和免疫系统中淋巴细胞等微环境之间的复杂交互作用。NK细胞是已知最有效的杀伤肿瘤细胞的免疫细胞之一，对抑制肿瘤组织的发生、发展和扩散起着重要的作用。

有文献报道(Koepsell SA,Miller JS,McKenna DH Jr.Natural killer cells:a review of manufacturing and clinical utility.Transfusion.2013Feb；53(2):404-10)，浸润到肿瘤组织中的NK细胞数量尽管非常少，但是NK细胞浸润到肿瘤组织的患者能明显的观察到其生存期的显著延长，及其肿瘤扩散比率的显著降低。与健康人的NK细胞相比，肿瘤患者NK细胞浸润到肿瘤组织中的杀伤能力显著降低。另外，肿瘤患者的NK细胞表面抑制受体如CD158a、CD158b和NKG2A表达显著上升，而激活受体如NKG2D、NKG2C、NPp30和CD69则显著下降。

现有研究数据表明，癌症患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞。但这为肿瘤的免疫治疗提供了一个契机，即通过体外细胞活化和扩增的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对肿瘤免疫治疗的效果。

已经报道的许多临床前研究表明，NK细胞作为一种有效地免疫治疗方法可以用于治疗各种肿瘤。一些NK细胞临床研究的细胞制备方法已经有可能被转化成为临床级或者是cGMP级的标准制备过程(Lapteva N,Durett AG,et al.Large-scale ex vivo expansion and characterization of natural killer cells for clinical applications.Cytotherapy.2012Oct；14(9):1131-43)。在这些报道的NK细胞制备方法中，大多使用外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞作为培养NK细胞的样本。

另外，还有文献报道(Campbell KS,Hasegawa J.Natural killer cell biology:an update and future directions.J Allergy Clin Immunol.2013Sep；132(3):536-44.)，体外扩增NK细胞，有多种因素都会影响到NK细胞的数量，从而降低NK细胞扩增的可能性。

因此，需要有一种能够提高扩增数量和扩增纯度的NK细胞制备方法。

技术实现要素：

本发明提供了由不同血液样本快速、高效、低成本地扩增NK细胞的方法。

具体的，提供了一种制备NK细胞的方法，所述方法包括：接种单个核细胞、第一次扩增、第二次扩增、第三次扩增、第四次扩增和第五次扩增。

在一些实施方式中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括从血液样品中分离单个核细胞的步骤。

在一些实施方式中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括用人源化CD16和CD3单克隆抗体包被培养瓶的预处理步骤。

培养瓶预处理

本领域技术人员熟知利用单克隆抗体对培养瓶进行包被，以便于血液细胞生长的方法。

在一些实施方式中，通过包含人源化CD16单抗和人源化CD3单抗的生理盐水在4℃温育培养瓶，例如温育过夜，实现培养瓶的预处理。

在一些实施方式中，人源化CD16单抗的浓度为0-10ug/ml，人源化CD3单抗的浓度为0-10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD16单抗的浓度为2ug/ml、4ug/ml、5ug/ml或10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD3单抗的浓度为2ug/ml、4ug/ml、5ug/ml或10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD16单抗和人源化CD3单抗的浓度均为5ug/ml。

分离单个核细胞

从血液样品中分离单个核细胞的方法是本领域熟知的，如Ficoll分层液法、Percoll分层液法。

在一些实施方式中，血液样品为外周血、脐血、骨髓。

在一些实施方式中，通过Ficoll分层液法分离单个核细胞。

在一些实施方式中，还包括将来自血液样品的血浆加热灭活，例如56℃灭活30min，获取自体的灭活血浆。

在一些实施方式中，分离得到的单个核细胞中，NK[CD3^-CD56⁺]比例为0.78％～11.71％，例如4.77％(外周血单个核细胞中)。

接种单个核细胞

将从血液样品中分离的单个核细胞以0.5×10⁶个/ml至2×10⁶个/ml的密度接种在包被细胞培养瓶中，进行培养。

在一些实施方案中，所接种的单个核细胞的密度为0.5×10⁶个/ml、0.6×10⁶个/ml、0.7×10⁶个/ml、0.8×10⁶个/ml、0.9×10⁶个/ml、1.0×10⁶个/ml、1.2×10⁶个/ml、1.5×10⁶个/ml或2.0×10⁶个/ml。

在一些实施方式中，所述接种培养基含有2000至5000IU/ml IL-2、500至3000IU/ml IFN-γ、0-50ng/ml IL-7、0-50ng/ml IL-15和2-5％的自体灭活血浆或同血型的灭活血清。

在一些实施方式中，IL-7的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-15的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-2的浓度为2000IU/ml、3000IU/ml、4000IU/ml或5000IU/ml。在一些实施方式中，IFN-γ的浓度是500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml或3000IU/ml。在一些实施方式中，所述自体灭活血浆或同血型的灭活血清的浓度为2％、3％、4％或5％。

在一个具体的实施方式中，接种培养基中含有4000IU/ml IL-2、2000IU/ml IFN-γ、30ng/ml IL-7、30ng/ml IL-15和5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆。

本领域技术人员熟知适合来自血液的单个核细胞的培养条件，例如可以在37℃、CO₂浓度为5％且湿度为45％-55％的培养箱中培养。

第一次扩增

在培养的第2天至第3天，向细胞中补加2倍体积的第一扩增培养基，进行第一次扩增。

所述第一扩增培养基包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0-100ug/ml OK-432、0-50ng/ml IL-15和0-50ng/ml IL-12。

在一些实施方式中，IL-12的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-15的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，OK-432的浓度是20IU/ml、40IU/ml、60IU/ml、80IU/ml或100IU/ml。在一些实施方式中，所述自体灭活血浆或同血型的灭活血清的浓度为2％、3％、4％或5％。

在一个具体实施方案中，所述第一扩增培养基包含80ug/ml OK-432，30ng/ml IL-15、30ng/ml IL-12和5％自体灭活血浆或同血型灭活血浆。

OK432是本领域熟知且可从市场购买的一种获自A群溶血性链球菌(Su株)的免疫活性剂。

第二次扩增

在培养的第4至第5天，向细胞中补加7倍体积的第二扩增培养基，进行第二次扩增。

所述第二扩增培养基包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0-100ug/ml OK-432、0-50ng/ml IL-15和0-50ng/ml IL-12。

在一些实施方式中，IL-12的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-15的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，OK-432的浓度是20IU/ml、40IU/ml、60IU/ml、80IU/ml或100IU/ml。在一些实施方式中，所述自体灭活血浆或同血型的灭活血清的浓度为2％、3％、4％或5％。

在一个具体实施方案中，所述第二扩增培养基包含80ug/ml OK-432，30ng/ml IL-15、30ng/ml IL-12和5％自体灭活血浆或同血型灭活血浆。

第三次扩增

在培养的第7至第8天，向细胞中补加20倍体积的第三扩增培养基，进行第三次扩增。

所述第三扩增培养基包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、500-2000IU/ml IL-2、0-50ng/ml IL-21和0-50ng/ml IL-18。

在一些实施方式中，IL-2的浓度为500IU/ml、1000IU/ml或2000IU/ml。在一些实施方式中，IL-21的浓度可以为20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-18的浓度是20IU/ml、25ng/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方式中，所述自体灭活血浆或同血型的灭活血清的浓度为2.5％、3％、4％或5％。

在一个具体实施方案中，所述第三扩增培养基包含2.5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、1000IU/ml IL-2、25ng/ml IL-21和25ng/ml IL-18。

第四次扩增

在培养的第9至10天，向细胞中补加30倍体积的第四扩增培养基，进行第四次扩增。

所述第四扩增培养基包含500-2000IU/ml的IL-2。

在一些实施方式中，IL-2的浓度为500IU/ml、1000IU/ml或2000IU/ml。

在一些实施方案中，在补加第四扩增培养基前，可以将培养物等分为多份，例如2份，并装入细胞培养袋中。

第五次扩增

在培养的第12至14天，向细胞中补加20倍体积的第五扩增培养基，进行第五次扩增。

所述第五扩增培养基包含500-2000IU/ml IL-2。

在一些实施方式中，IL-2的浓度为500IU/ml、1000IU/ml或2000IU/ml。

在一些实施方案中，如果在第四次扩增步骤已经培养物等分为多份，则将第五扩增培养基均分。

在本发明中，所添加的扩增培养基的体积均基于接种培养的体积。

在本发明的一个具体的实施方案中，提供了一种扩增NK细胞的方法，所述方法包括：

1)培养瓶预处理，使用包括5ug/ml人源化CD16单抗和人源化CD3单抗的生理盐水温育培养瓶；

2)从血液样品中分离单个核细胞，所述血液样品可以是例如脐血、骨髓、外周血，可以通过例如ficoll分层液法进行分离；

3)细胞接种

将分离得到的单个核细胞按照1.5×10⁶个/ml细胞密度接种到含4000IU/ml IL-2、2000IU/ml IFN-γ、30ng/ml IL-7、30ng/ml IL-15和5％灭活血清的培养基的预处理培养瓶中；

4)第一次扩增

在第3天，补加2倍体积的第一扩增培养基，其包含5％的患者灭活血浆、80ug/mlOK-432、30ng/ml IL-15和30ng/ml IL-12；

5)第二次扩增

在第5天，补加7倍体积的第二扩增培养基，其包含80ug/ml OK-432，30ng/ml IL-15、30ng/ml IL-12和5％自体灭活血浆或同血型灭活血浆；

6)第三次扩增

在第7天，补加20倍体积的第三扩增培养基，其包含2.5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、1000IU/ml IL-2、25ng/ml IL-21和25ng/ml IL-18；

7)第四次扩增

在第10天，向细胞中补加30倍体积的第四扩增培养基，其包含1000IU/ml IL-2；和

8)第五次扩增

在第12天，向细胞中补加20倍体积的第四扩增培养基，其包含1000IU/ml IL-2。

本发明采用从不同个体自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外不同种类细胞因子，如IL-7,IL-21,IL-15,IL-18等刺激活化作用，而使得NK细胞从初始的外周血单个核细胞(PBMC)中比例仅为5％左右，而经过14天的培养达到90％以上，快速、高效且低成本。

附图说明

图1：以0.8×10⁶个/ml密度接种的外周血单个核细胞中，NK细胞的生长扩增曲线。

图2：A和B是以0.8×10⁶个/ml密度接种的外周血单个核细胞中，第0天及第14天的NK细胞流式结果。

图3：A和B是以0.8×10⁶个/ml密度接种的外周血单个核细胞中，NK细胞扩增的细胞照片。

图4：以0.8×10⁶个/ml密度接种的外周血单个核细胞经扩增后，NK细胞对肿瘤的杀伤作用。

图5：A和B是以1.2×10⁶个/ml密度接种的脐血单个核细胞中，第0天及第14天的NK细胞流式结果。

图6：A和B是以1.5×10⁶个/ml密度接种的外周血单个核细胞中，第0天及第14天的NK细胞流式结果。

图7：A和B是以1.5×10⁶个/ml密度接种的骨髓单个核细胞中，第0天及第14天的NK细胞流式结果。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：由外周血样本制备NK细胞

1.1细胞培养瓶的预处理

将25ml含5ug/ml人源化CD16单抗(获自北京同立海源生物科技有限公司)和5ug/ml人源化CD3单抗(获自北京同立海源生物科技有限公司)的生理盐水溶液，加入到175cm²底面积的细胞培养瓶(Nunc)中，并使液体充分在瓶底分散，4℃平放过夜。

1.2外周血单个核细胞(PBMC)的分离

以下以100ml外周血为例，如血量不同，可按此操作做相应调整。

将经平皿检菌后无菌的100ml患者外周血在室温下差速离心(Thermo水平低速离心机中进行，离心15分钟，升9降7(即从2000rpm至0rpm的降速时间为10min)，使血浆和血细胞分离。

将上层血浆转入离心管，56℃灭活30min之后，2000rpm离心10min，取上清4℃备用。

将血细胞沉淀用等体积的生理盐水混匀，通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。具体的，将上述混合物小心加到含Ficoll层的50ml离心管中，室温差速离心20分钟(升9降3，即2000rmp至0rmp，30min)。吸取PBMC层，尽量吸尽两液面交界处的细胞层，加生理盐水吹打混匀，室温1800rpm离心8分钟。利用生理盐水再次洗涤细胞。

弃去上清后，用5ml无血清培养基(X-VIVO无血清细胞培养基，LONZA)重悬细胞，定容到20ml。吸取少量细胞计数。同时取少量细胞悬液进行流式检测，NK[CD3^-CD56⁺]比例为4.77％。一般，血液样品中NK[CD3^-CD56⁺]比例为0.78％～11.71％。

1.3接种

按照0.8×10⁶个/ml的细胞浓度，将步骤1.2获得的PBMC细胞接种到含4000IU/ml IL-2、2000IU/ml IFN-γ、30ng/ml IL-7、30ng/ml IL-15和5％的步骤1.2获得的患者灭活血浆的25ml培养基(X-VIVO无血清细胞培养基，LONZA)的步骤1.1获得的包被培养瓶中。在培养箱中(37℃，CO₂浓度为5％，湿度：45％-55％)培养。

1.4 NK细胞的第一次扩增

在培养的第3天，检测细胞浓度为0.938×10⁶个/ml。此时，向培养瓶中补加含有5％的患者灭活血浆、80ug/ml OK-432(获自北京同立海源生物科技有限公司)、30ng/ml IL-15和30ng/ml IL-12的50ml无血清培养基(X-VIVO无血清细胞培养基，LONZA)，确保培养基的终体积为75ml。同时进行细胞计数，检测细胞的生产状况。注意，请勿吹打细胞。

1.5 NK细胞的第二次扩增

在第5天，检测细胞浓度为0.979×10⁶个/ml。向培养瓶中继续补加含有5％的患者灭活血浆、80ug/mlOK-432、30ng/ml IL-15和30ng/ml IL-12的175ml无血清培养基(X-VIVO无血清细胞培养基，LONZA)，确保培养基的终体积为250ml。同时进行细胞计数，检测细胞的生产状况。注意，请勿吹打细胞。

1.6 NK细胞的第三次扩增及其装袋

第7天，检测细胞浓度为1.543×10⁶个/ml。将培养瓶底部的细胞轻微吹散(约250ml)，将其与500ml含有1000IU/ml IL-2、25ng/ml IL-21、25ng/mlIL-18和剩余灭活血浆(约2.5％)的X-VIVO无血清细胞培养基，一起装入到细胞培养袋(GT-T610，来自TAKARA公司)中，确保终体积为750ml。同时进行细胞计数，检测细胞的生产状况。

1.7 NK细胞的第四次扩增

第10天，检测细胞浓度为1.897×10⁶个/ml。将培养袋从细胞培养箱(37℃，CO₂浓度为5％，湿度为45％-55％，Thermo)中取出，将细胞悬液均匀分至2个培养袋中，并等体积补充扩增液(含有1000IU/ml IL-2的X-VIVO无血清细胞培养基)。将两袋细胞放入培养箱中继续培养。同时进行细胞计数，确定细胞的生产状况。

1.8 NK细胞的第五次扩增

第12天，检测细胞浓度为2.534×10⁶个/ml。将500ml扩增液(含有1000IU/ml IL-2的X-VIVO无血清细胞培养基)均分到2个培养袋中，确保每袋体积为1000ml。同时进行细胞计数，确定细胞的生产状况。

1.9检菌

细胞培养第13天，对细胞悬液进行检菌和内毒素检测。结果表明，无菌，内毒素小于0.25EU/ml。

实施例2：所扩增的NK细胞的检测

在培养的第13、14天各收获1000ml细胞悬液。同时对第14天扩增的细胞进行细胞数量、流式及其对肿瘤细胞的杀伤功能检测。

2.1肿瘤抑制试验

取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，以8×10⁵细胞/ml铺于96孔培养板中，每孔50μL。同时，每孔加入50μL浓度为4×10⁶细胞/ml、8×10⁶细胞/ml、1.6×10⁷细胞/ml的实施例1制备的NK细胞，使效靶比(实施例1制备的NK细胞和K562之比)分别为5:1、10:1、20:1，一式三份。

具体的接种方式如下：

实验组(a值)：K562(50ul，8×10⁵细胞/ml)+所制备的NK(50ul，4×10⁶细胞/ml、8×10⁶细胞/ml或1.6×10⁷细胞/ml)

对照组1(b值)：(K562(50ul，8×10⁵细胞/ml)+X-VIVO无血清培养基(50ul)

对照组2(c值)：NK(50ul，4×10⁶细胞/ml、8×10⁶细胞/ml或1.6×10⁷细胞/ml)+X-VIVO无血清培养基(50ul)

空白组(d值)：X-VIVO无血清培养基(100ul)

所接种的细胞置于37℃、5％CO₂条件下共培养24小时后，每孔加10mlMMT(Sigma)，摇匀，37℃、5％CO₂条件下继续培养3小时，酶标仪450nm波长测吸光度(A570)。按下式计算肿瘤抑瘤率：抑瘤效率＝[1－(a值－c值－d值)/(b值－d值)]×100％。

图1为NK细胞的生长扩增曲线。从图1可以看出，NK细胞从第5天以后即进入到对数生长期，呈现指数型的生长状态，细胞数量由最初的2×10⁷个，培养14天后，达到6.2×10⁹个，扩增倍数达到300倍以上。

图2A和2B为NK细胞第0天及第14天的流式结果。从流式结果可以看出，全血分离出的CD3^-CD56⁺的NK细胞的比例＜5％，而在实施例1的细胞活化扩增14天后，CD3^-CD56⁺的NK细胞的比例＞90％。

图3A和3B是NK细胞扩增的细胞照片。从细胞的状态来看，最初分离的PBMC是以单个细胞的状态，随着多种细胞因子的逐步刺激、活化和扩增过程，细胞逐步悬浮成团生长，而且细胞团大小适中，分布均一。

图4是NK细胞对肿瘤的杀伤作用。通过图4可以看出，经过14天的多因子逐步刺激和活化，NK细胞的数量和纯度均得到了明显的提高。进一步的，通过肿瘤的抑制率试验检测NK细胞的功能。实验结果标明，随着效靶的逐渐提高，NK细胞对肿瘤的抑制率也逐渐提高，尤其是当效靶比达到20：1的时候，NK细胞对肿瘤的抑制率达到90％以上。

实施例3.由其他血液样本制备NK细胞并检测

在本实施例中，利用与实施例1和2相同的方法，从数个不同来源的血液样品的不同接种浓度的单个核细胞扩增了NK细胞，并对所扩增的NK细胞进行检测。

简言之，按照实施例1中1.1和1.2的步骤对培养瓶进行预处理并分别分离外周血、脐血、骨髓的单个核细胞。

以1.2×10⁶/ml脐血来源的单个核细胞、1.5×10⁶/ml外周血来源的单个核细胞和1.5×10⁶/ml骨髓来源的单个核细胞的接种浓度，将细胞接种到按照实施例1中1.1步骤预处理的培养瓶中。

然后，按照实施例1中1.4至1.8相同的步骤进行五次扩增，并按照实施例1中1.9的步骤进行检菌。

最后，通过流式细胞试验，对所扩增的NK细胞进行检测。

结果如下表1、2、3所示。

表1：脐血样本

其中，在所测试的脐血样本，第0天NK细胞比例为0.307％；培养14天以后，NK细胞比例为84.40％。

表2：外周血样本

其中，在所测试的外周血样本，第0天，NK细胞比例为1.70％；培养14天以后，NK细胞比例为89.60％。

表3：骨髓样本

其中，在所测试的骨髓样本，第0天，NK细胞比例为8.1％；培养14天以后，NK细胞比例为84.40％。

尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。